CN104513844A - 一种利用脂肪酶催化合成虾青素琥珀酸酯的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及直接以红法夫酵母菌为原料，利用脂肪酶催化，分离与反应耦合合成虾青素琥珀酸酯的方法。具体方法：红法夫酵母细胞经高压匀浆法破碎，离心回收并冷冻干燥后加入异丙醇/正己烷混合溶液进行虾青素萃取，萃取液旋转蒸发浓缩后直接加入脂肪酶和琥珀酸酐及DMF等反应溶剂在温度20-50℃进行酯化即可合成虾青素琥珀酸酯。此方法对于解决虾青素的高度不稳定性的问题和生产高效稳定的抗氧化剂虾青素琥珀酸酯方面具有重要的应用价值与前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，提供了一种以红法夫酵母细胞为原料采用脂肪酶催化法分离和反应耦合制备虾青素琥珀酸酯的方法，此方法对于解决虾青素的高度不稳定性的问题和生产高效稳定的抗氧化剂虾青素琥珀酸酯方面具有重要的应用价值与前景。
背景技术
虾青素（3,3’-二羟基-4,4’-二酮基β-胡萝卜素）是从河螯虾外壳、牡蛎和鲑鱼中发现的一种红色类胡萝卜素，在细胞内，可与蛋白质结合而成青、蓝色。虾青素是自然界中最强的抗氧化剂，其抗氧化能力是维生素E的1000倍，可有效清除细胞的氧自由基，增强细胞再生能力，清除衰老细胞和维持机体平衡，具有保护皮肤，促进毛发生长，抗衰老、缓解运动疲劳、增强活力等生物活性。虾青素已在食品、医药、高端化妆品和保健品等领域广泛使用。
虾青素的来源有化学合成和生物获取两种方式。利用化学合成可从胡萝卜素直接制备虾青素，但得到的虾青素结构大多是顺式结构，而不是天然生物产物的反式结构。化学法合成虾青素成本高，而且产品生物利用率低、活性差，安全性也受到质疑。生物法得到的天然虾青素因生物活性高，安全性好而广受人们青睐。天然虾青素的主要生物来源有甲壳类动物、雨生红球藻和红法夫酵母菌（Phaffia rhodozyma）。其中最适用于大规模工业化生产虾青素的是红法夫酵母菌，因红法夫酵母菌相对易培养，短时间内可获得很高的生物量。但因为虾青素极端不稳定，在光，热和辐射等条件易失去生物活性，且红法夫酵母菌细胞壁厚难以破碎。从红法夫酵母细胞中提取虾青素，需要用到酸煮等条件剧烈的细胞壁破碎方法，然后溶剂萃取，溶液浓缩（旋转蒸发法），再续以结晶，色谱等手段进行纯化，由于虾青素的不稳定在分离纯化过程中容易降解，导致最终虾青素的得率低。
在虾青素类产品的储存、加工过程中，也由于虾青素的高度不稳定性，导致其活性的大幅度降低而影响其使用效果。如果能将虾青素转化为虾青素酯，其不仅具有虾青素的活性，同时还因为新基团的引入而赋予新的功能，如亲疏水性改善，容易消化吸收等。如美国发明专利US20050228188 A1中提到虾青素中链脂肪酸酯具有高的消化性和细胞渗透性。
本技术采用分离与反应耦合，以红法夫酵母细胞为原料直接制备虾青素琥珀酸酯。首先对红法夫酵母细胞采用高压匀浆法进行细胞破碎，然后采用有机溶剂萃取、浓缩后直接加入脂肪酶和酰基化试剂（琥珀酸酐）催化酯化，在一定条件下反应，合成稳定性好的虾青素琥珀酸酯。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种反应条件简单、绿色环保、转化率高的利用脂肪酶催化合成虾青素琥珀酸酯的方法。
本发明的技术方案是，一种利用脂肪酶催化合成虾青素琥珀酸酯的方法，该方法具体包括以下步骤：
步骤1：首先将一定量的红法夫酵母菌的发酵液用高压匀浆机破壁，离心并冷冻干燥后加入足量的正己烷与异丙醇的混合有机溶剂进行虾青素萃取，得到虾青素萃取液，备用；
步骤2：将步骤中1得到虾青素萃取液中加入反应溶剂、琥珀酸酐和足量的酵母脂肪酶，在温度为20-50℃下持续搅拌反应6-72小时，即可合成虾青素琥珀酸酯。
进一步，所述正己烷与异丙醇的体积比为2:1。
进一步，所述反应溶剂为二甲基甲酰胺DMF或二甲基亚砜DMSO，加入量为虾青素萃取液2-10倍体积。
进一步，所述琥珀酸酐的加入量与虾青素的摩尔比为50-3000：1。
本发明的原理是：虾青素（3,3’-二羟基-4,4’-二酮基β-胡萝卜素）分子具有很长的共轭双键链，两端各有一个羟基（-OH），每一个羟基都可以与羧基脱水反应生成酯，并且在反应过程中加入脂肪酶催化可以加快反应速度。虾青素的高度不稳定性其原因就是因为两端的羟基极易被氧化，本发明采用脂肪酶催化，以琥珀酸酐为酯化酰基供体，将虾青素一端或两端的羟基转化成酯基（分别为虾青素琥珀酸单酯和虾青素琥珀酸双酯），不仅保留了虾青素本身的生物活性，还大大提高了其稳定性，使其更好的应用于食品、医药、化妆品和保健品等领域。
本专利的优点在于：（1）虾青素酯的合成传统方法是从红法夫酵母菌等生物原料中分离纯化得到虾青素，然后再进行酯化。本发明是直接从红法夫酵母菌出发，分离和酶法反应耦合直接得到虾青素琥珀酸酯，这样部分克服了虾青素在分离纯化过程中易分解的难题，可提高虾青素的收率；（2）虾青素是自然界中天然的抗氧化剂，但极其不稳定，在其储存或加工过程中会导致其活性大幅度降低而影响其功能。而虾青素琥珀酸酯不仅具有虾青素的活性，而且比虾青素更加稳定，而且更容易被人体消化和吸收。虾青素琥珀酸酯在医药，化妆品及保健品等多个领域具有很好的应用潜力。（3）酶法合成琥珀酸酯相对于化学法，反应条件温和，合成的虾青素酯收率高而且产品品质好。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明的技术方案做进一步说明。
以下实施例中虾青素转化率是由酯化反应中虾青素的减少量与反应前虾青素量的百分比值计算得到。
实施例1
将2L的红法夫酵母发酵液直接采用高压匀浆机进行细胞破碎，离心回收破碎后的红法夫酵母细胞，冷冻干燥后用异丙醇与正己烷的混合溶液（V:V=2:1）进行虾青素萃取，料液比为15mL/g。萃取所得溶液经旋转蒸发后即得虾青素粗提取液。取1.2mL粗提液，加入反应溶剂DMSO 3.8mL和0.2g酵母脂肪酶，并加入琥珀酸酐，使琥珀酸酐与虾青素的摩尔比为1500倍， 在温度为35℃恒温摇床（160 r/min）中反应8h，虾青素转化率为53.70%，其中虾青素琥珀酸酯中单酯含量82.14%，二酯含量17.86%。
实施例2
将2L的红法夫酵母发酵液直接采用高压匀浆机进行细胞破碎，离心回收破碎后的红法夫酵母细胞，冷冻干燥后用异丙醇与正己烷的混合溶液（V:V=2:1）进行虾青素萃取，料液比为15mL/g。萃取所得溶液经旋转蒸发后即得虾青素粗提取液。取1.2mL粗提取液，加入反应溶剂DMF3.8mL和0.2g酵母脂肪酶，加入琥珀酸酐，琥珀酸酐与虾青素的摩尔比为1500倍， 35℃恒温摇床（160 r/min）中反应6h，虾青素转化率为25.96%，所生成虾青素琥珀酸酯均为虾青素琥珀酸单酯。
实施例3
将2L的红法夫酵母发酵液直接采用高压匀浆机进行细胞破碎，离心回收破碎后的红法夫酵母细胞，冷冻干燥后用异丙醇与正己烷的混合溶液（V:V=2:1）进行虾青素萃取，料液比为15mL/g。萃取所得溶液经旋转蒸发后即得虾青素粗提取液。取1.2mL粗提取液，加入反应溶剂DMSO2.4mL和0.2g酵母脂肪酶，加入琥珀酸酐，琥珀酸酐与虾青素的摩尔比为1500倍，45℃恒温摇床（160 r/min）中24h，虾青素转化率为86.50%，其中虾青素琥珀酸酯中单酯含量68.01%，二酯含量31.99%。
实施例4
将2L的红法夫酵母发酵液直接采用高压匀浆机进行细胞破碎，离心回收破碎后的红法夫酵母细胞，冷冻干燥后用异丙醇与正己烷的混合溶液（V:V=2:1）进行虾青素萃取，料液比为15mL/g。萃取所得溶液经旋转蒸发后即得虾青素粗提取液。取1.2mL粗提取液，加入反应溶剂DMSO3.8mL和0.2g酵母脂肪酶，加入琥珀酸酐，使琥珀酸酐与虾青素的摩尔比为3000倍， 35℃恒温摇床（160 r/min）中反应48h，虾青素转化率为91.40%，其中虾青素琥珀酸酯中单酯含量40.72%，二酯含量59.28%。
实施例5
将2L的红法夫酵母发酵液直接采用高压匀浆机进行细胞破碎，离心回收破碎后的红法夫酵母细胞，冷冻干燥后用异丙醇与正己烷的混合溶液（V:V=2:1）进行虾青素萃取，料液比为15mL/g。萃取所得溶液经旋转蒸发后即得虾青素粗提取液。取1.2mL粗提取液，加入反应溶剂DMSO3.8mL和0.2g酵母脂肪酶，加入琥珀酸酐，使琥珀酸酐与虾青素的摩尔比为300倍，45℃恒温摇床（160 r/min）中反应72h，虾青素转化率为70.19%，其中虾青素琥珀酸酯中单酯含量为88.89%，二酯含量为11.11%。
Claims (4)
1.一种利用脂肪酶催化合成虾青素琥珀酸酯的方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：
步骤1：首先将一定量的红法夫酵母菌的发酵液用高压匀浆机破壁，离心并冷冻干燥后加入足量的正己烷与异丙醇的混合有机溶剂进行虾青素萃取，得到虾青素萃取液，备用；
步骤2：将步骤中1得到虾青素萃取液中加入反应溶剂、琥珀酸酐和足量的酵母脂肪酶，在温度为20-50℃下持续搅拌反应6-72小时，即可合成虾青素琥珀酸酯。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述正己烷与异丙醇的体积比为2:1。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应溶剂为二甲基甲酰胺DMF或二甲基亚砜DMSO，加入量为虾青素萃取液2-10倍体积。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述琥珀酸酐的加入量与虾青素的摩尔比为50-3000 : 1。
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