CN107338279A - 酶催化酯化制取叶黄素羧酸酯 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种在亚临界溶剂介质中，脂肪酶的催化含羟基的叶黄素类化合物与羧酸或羧酸酐反应制备叶黄素羧酸酯的方法，其步骤如下：将叶黄素类化合物加入到高压反应釜，同时加入一定比例的短链羧酸或羧酸酐和脂肪酶制剂。密封高压反应釜后通过高压泵将预冷的亚临界流体泵入反应釜，控制反应温度在‑10至80℃，压力在2‑10Mpa范围，在搅拌下反应0.5‑12h。反应结束后，反应物经过设在反应器内部或出料通道的酶过滤器过滤回收酶催化剂，然后减压脱除反应介质，用去离子水或5%的盐酸水溶液洗涤产物，减压干燥得到相应的叶黄素类化合物羧酸酯。

Description

酶催化酯化制取叶黄素羧酸酯

技术领域

本发明涉及生物催化技术，尤其涉及以脂肪酶为催化剂在高压亚临界流体介质中制取叶黄素类化合物羧酸酯的工艺，属于食品添加剂领域。

技术背景

叶黄素是含氧类胡萝卜素的总称，其中，以含有羟基的黄体素、玉米黄质、辣椒红素、辣椒玉红素、β-隐黄素、虾青素等在自然界含量最为丰富。叶黄素及其衍生物有着重要的保健和营养价值，被广泛应用到饲料和食品中。

万寿菊和红辣椒是目前世界上天然叶黄素类化合物最重要的来源。其中，万寿菊花主要含有黄体素和玉米黄素，红辣椒主要含有辣椒红素、辣椒玉红素、β-隐黄质、玉米黄素。另外，雨生红球藻、红发夫酵母、福寿花等则是天然虾青素的主要来源。从万寿菊花、辣椒果实以及福寿花中提取的天然叶黄素酯皆为长链脂肪酸酯，主要是单肉豆蔻酸酯，单棕榈酸酯，单硬脂酸酯，月桂酸-肉豆蔻酸酯，二肉豆蔻酸酯，肉豆蔻酸-棕榈酸酯，二棕榈酸酯，棕榈酸-硬脂酸酯和二硬脂酸酯等。

研究显示，在禽类体内游离态叶黄素比以长链脂肪酸酯的形式存在的叶黄素衍生物具有更高的生物利用度。游离叶黄素的生物利用度虽然较高，但是其光热稳定性却远远不如天然叶黄素酯。稳定性低大大限制了游离叶黄素的应用范围，为了提高稳定性，常常需要将其制成各种含有抗氧化剂和包覆剂的制剂，而这些添加物不同程度地影响了叶黄素本身的吸收和利用。由短碳链羧酸形成的叶黄素酯比其自然形态下的高级脂肪酸酯具有更高的生物利用度，同时，还具有比游离态叶黄素好得多的稳定性。叶黄素转化为低级羧酸酯除了能够大大提高储存稳定性，又具有明显优于天然叶黄素高级脂肪酸酯的生物利用度，尤其适合禽类、水产鱼虾的着色。为此，人们开始探寻在稳定程度和生物利用度上能有所兼顾的的叶黄素形式。

授权专利CN03805645以叶黄素类化合物与1-12碳的羧酸进行以强酸或金属盐为催化剂的脱水酯化反应，在反应过程中连续加热回流，并设置分水装置，在常压或减压条件下不断地将酯化产生的水从体系中反应体系分离，从而使化学平衡向酯化的方向进行，可以制备出黄体素、玉米黄素、辣椒红素、辣椒玉红素等叶黄素类化合物的短碳链羧酸酯。该方法使用有机强酸或无机强酸或金属盐为催化剂，除了化学过程产生的废水和工业废料之外，更重要的问题是，难免在最终产品中残留这些有机酸无机酸或者金属盐。另一方面，由于该方法需要一定的温度以使酯化过程产生的水分得以移除，所以，反应物和反应产物不可避免产生一定程度的热降解。

另一个相关的授权专利CN201310034353公开了一种以三乙胺为催化剂，叶黄素（黄体素）和琥珀酸酐为原料制备叶黄素二琥珀酸酯的超声波辅助酯化工艺。该方法使用大量的三乙胺为催化剂，虽然用超声波提供能量，大大加快的反应的速度，但是，由于大规模的超声设备仍是技术难点，这种工艺并不适合工业生产，而且工艺过程仍然涉及到产物分离、浓缩与纯化等一系列繁琐的工艺过程。该工艺使用大量的三乙胺催化剂和二氯乙烷溶剂，在产物中不可避免存在三乙胺、二氯甲烷等溶剂的残留。有机溶剂浓缩处理过程既容易造成叶黄素的降解损耗，又消耗能量并污染环境。

由此可见，化学催化法合成叶黄素羧酸酯的过程，通常需要用到有机强酸、无机强酸、有机碱等有害物质作为催化剂，并且反应温度和回收溶剂的温度较高，容易造成叶黄素化合物的热降解。在这种背景下，我们开发了反应条件温和且环境友好的脂肪酶催化羧酸与叶黄素酯化的反应体系。本发明涉及在亚临界溶剂介质中，通过脂肪酶的催化，使含羟基的叶黄素类化合物与羧酸或羧酸酐反应制备多种叶黄素类化合物的羧酸酯。

非水介质中酶催化是目前生物技术中一个颇具基础的研究领域， 有许多有机化学反应已可由酶催化来实现。在有机介质中酶催化反应可以获得许多常规条件下所不具有的优势。例如，可进行水不溶性化合物的催化转化，使酶作用底物的范围大大拓宽；改变反应的平衡点，使水溶液中不能发生的反应向所期望的方向进行，催化水解的酶可催化合成反应的进行，如转酯、酯化、氨解、酰基交换和转硫酯等；由于酶在有机溶剂中结构上刚性的增加，对底物的专一性大大提高，从而使实现对酶催化选择性的有目的的调控成为可能；酶的热稳定性大大提高；由于酶不溶于大多数有机溶剂，反应后易于回收和重复利用：可避免长期反应中微生物的污染；减少或防止由水引起的副反应；可方便地利用对水敏感的底物进行反应，如酸酐；当使用挥发性溶剂作介质时，反应后的分离过程能耗降低。

本发明利用脂肪酶在有机溶剂或者亚临界溶剂中能催化羧酸或羧酸酐与羟基化合物进行酯化反应的性质，建立了在高压亚临界流体介质中，以脂肪酶生物为催化剂，用羧酸或其酸酐与叶黄素类化合物反应制备叶黄素羧酸脂的方法。

脂肪酶的系统名称是酰基甘油水解酶，广泛存在于原核生物和真核生物。虽然脂肪酶的天然底物是甘油酯类，但是研究表明，脂肪酶除了能够催化甘油酯类化合物的水解与合成外，还可以用于催化酯交换反应和其它类型的酯的水解与合成。在水解与酯化的化学平衡中，脂肪酶在水性介质里倾向于催化水解，而在非水体系中，则倾向于促进酯化反应。

总体上，有机溶剂中进行的酶催化酯化反应时间较长，产物分离步骤繁琐，浓缩时仍需要加热。与之相比，超临界或亚临界溶剂中进行的酶催化酯化反应体系在产物分离和溶剂回收方面具有明显的优势。亚临界是指流体的压力、温度两项工艺参数之一处在临界点之上，另一参数处在临界点之下的状态。其中，R134a是一种对大气臭氧层无破坏性的新型亚临界溶剂，化学名为1，1，1，2-四氟乙烷。其临界温度为101.1℃，临界压力为4.067Mpa。亚临界R134a的操作压力远低于超临界二氧化碳。并且，亚临界R134a对某些物质的溶解能力远高于超临界二氧化碳，对醇、酸、酯有较高的溶解能力。R134a作为酶催化酯化的反应介质，在反应结束后通过降压即可与反应物分离，利于重复使用，实现绿色的生产过程。适合做亚临界溶剂的还有丙烷、丁烷、六氟化硫、二甲醚、异丁烷（R600a）、以及1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷(R227)。

目前，尚未见有在亚临界体系中以脂肪酶催化叶黄素与羧酸或羧酸酐反应制备叶黄素酯的研究报道和专利文献。

发明内容

本发明涉及一种在亚临界溶剂介质中，以脂肪酶为催化剂促进含羟基的叶黄素类化合物与羧酸或羧酸酐反应制备叶黄素羧酸酯的方法，其步骤如下：将1份（以叶黄素物质的量为基准）叶黄素类化合物加入到高压反应釜，同时加入0.1-1000份（物质的量比）短链羧酸或羧酸酐以及相当于叶黄素反应物质量0.1-10倍（重量比）的脂肪酶制剂。密封高压反应釜后通过高压液泵将预冷却的亚临界流体泵入高压反应釜，在搅拌下，控制反应温度在-10至80℃，压力在2-10Mpa范围，反应0.5-12h。反应结束后，反应物经过设在反应器内部或出料通道的酶过滤器过滤回收酶催化剂，然后减压分离气化反应介质，收集反应产物，用去离子水或5%的盐酸水溶液洗去产物中的羧酸或羧酸酐，减压干燥，得到相应的叶黄素类化合物羧酸酯。

本发明涉及的叶黄素类化合物包括：黄体素、玉米黄质、辣椒红素、辣椒玉红素、β-隐黄质、虾青素。叶黄素类化合物脂肪酸酯的提取来源包括万寿菊、万寿菊花、万寿菊粉、红辣椒、玉米、福寿花、春侧金盏花、夏侧金盏花、雨生红球藻、红法夫酵母等。

作为反应原料的叶黄素类化合物是由含有叶黄素类化合物脂肪酸酯的天然提取物经过皂化所得到的皂化产物或该皂化产物经过进一步加热异构化所得到的某种叶黄素类化合物或所述异构化产物进一步氧化所得到的某种叶黄素类化合物。

所述的羧酸和羧酸酐包括乙酸、乙酸酐、丙酸、丙酸酐、正丁酸、正丁酸酐、异丁酸、异丁酸酐、丁二酸、丁二酸酐、3-羟基丙三羧酸。

分子中含有双羟基的黄体素、玉米黄质、辣椒红素、辣椒玉红素、虾青素等叶黄素类化合物，在与过量的羧酸或羧酸酐反应时，得到二羧酸酯。分子中含有单羟基的β-隐黄素，在与过量的羧酸或羧酸酐反应时，得到单羧酸酯。

所述的亚临界流体可以是丙烷、丁烷、六氟化硫、二甲醚、异丁烷（R600a）、1,1,1,2-四氟乙烷（R134a）和1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷(R227)、。

为了促进反应，在亚临界流体中可以加入一种或多种食品级的溶剂，包括乙醇，乙二醇，丙二醇。所使用的脂肪酶可以采用其固定化形式，也可以采用其游离酶形式。反应过程可以在微波辅助，超声波辅助的条件下进行。

本发明是一个全新的叶黄素羧酸酯制备技术，比起之前的强酸化学催化法以及三乙胺催化法制备叶黄素酯的工艺，在产品方面可以没有溶剂残留、没有催化剂残留；在工艺方面，反应可以在低温下进行，不需要通入其它惰性保护气体，并且在反应介质分离时无需加热，大大减少了工艺过程中产生的降解。在环保方面所用方法基本上没有使用有毒有害物质排放，也不涉及有毒有害物质的操作。

具体实施方式

实施例1

在250ml高压反应器中，加入1.18g（0.002mol）96.8%黄体素（分子量568.85）、1.20g乙酸（分子量60.05)和1.18g大孔丙烯酸树脂固定的南极假丝酵母脂肪酶B（Novozym 435），通过柱塞泵泵入亚临界R134a流体，系统自动控温在40℃并持续加压，直至反应压力达到8Mpa，保持搅拌反应6小时，反应结束后，料液经过滤网回收酶后减压分离，亚临界流体气化后回收，反应产物用水反复洗涤抽滤后真空干燥得到产物1.085g，测得叶黄素二酸酯转化率为73.92%。

实施例2

在20L高压反应器中，称取298g(约0.2mol)40%纯度虾青素（分子量596.86）、1021g（10mol)乙酸酐（分子量102.09）和30g固定化脂肪酶Lipozyme TL IM 置于高压反应釜中，密封后，通过盘管冷冻控温系统保温至-10℃，温度稳定后开始通过亚临界流体加料柱塞泵泵入亚临界丁烷流体，压力达到4Mpa后停止泵加反应介质。通过温控系统和加压泄压系统控制反应的温度和压力，保持搅拌反应12h，反应结束后，料液经过滤网回收酶后减压分离，亚临界流体气化后回收，反应产物用水反复洗涤抽滤后真空干燥，得到产物118g，测得虾青素二乙酸转化率为94.01%。

实施例3

在200L高压反应器中，称取10.0Kg(约14.4mol)82%玉米黄质（分子量568.85）、28.8Kg（约288mol)丁二酸酐（分子量100.07）和2Kg固定化脂肪酶Lipozyme RM IM 置于高压反应釜中，密封后，通过控温系统保温至50℃，温度稳定后开始通过亚临界流体加料柱塞泵泵入亚临界R134a流体，压力达到6Mpa后停止泵加反应介质。通过温控系统和加压泄压系统控制反应的温度和压力，保持搅拌反应6h，反应结束后，料液经过滤网回收酶后减压分离，亚临界流体气化后回收，反应产物用5%盐酸水溶液反复洗涤抽滤后真空干燥，得到产物8.0Kg，测得叶黄素二丁二酸酯转化率为85.54%。

Claims (10)

1.一种在亚临界溶剂介质中以脂肪酶为催化剂促进（催化）叶黄素类化合物与羧酸或羧酸酐反应制备叶黄素羧酸酯的方法，其特征如下：将1份（以叶黄素类化合物物质的量为基准）叶黄素类化合物加入到高压反应釜，同时加入0.1-1000份（物质的量比）短链羧酸或羧酸酐以及相当于叶黄素反应物质量0.1-10倍（重量比）的脂肪酶制剂。

2.密封高压反应釜后通过高压液泵将预冷却的亚临界流体泵入高压反应釜，在搅拌下，控制反应温度在-10至80℃，压力在2-10Mpa范围，反应0.5-12h。

3.反应结束后，反应物经过设在反应器内部或出料通道的酶过滤器过滤回收酶催化剂，然后减压气化分离反应介质，收集反应产物，用去离子水或5%的盐酸水溶液洗去产物中的羧酸或羧酸酐，减压干燥，得到相应的叶黄素类化合物羧酸酯。

4.本发明涉及的叶黄素类化合物包括：黄体素、玉米黄质、辣椒红素、辣椒玉红素、β-隐黄质、虾青素。

5.权利要求1所述的叶黄素类化合物是由含有叶黄素类化合物脂肪酸酯的天然提取物经过皂化所得到的皂化产物或该皂化产物经过进一步加热异构化所得到的某种叶黄素类化合物或所述异构化产物进一步氧化所得到的某种叶黄素类化合物。

6.权利要求1所述的羧酸和羧酸酐包括乙酸、乙酸酐、丙酸、丙酸酐、正丁酸、正丁酸酐、异丁酸、异丁酸酐、丁二酸、丁二酸酐、3-羟基丙三羧酸。

7.权利要求1所述的亚临界流体可以是丙烷、丁烷、六氟化硫、二甲醚、异丁烷、1,1,1,2-四氟乙烷和1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷。

8.为了促进反应，在亚临界流体中可以加入一种或多种食品级的溶剂，包括乙醇，乙二醇，丙二醇。

9.所使用的脂肪酶可以采用其固定化形式，也可以采用其游离酶形式。

10.反应过程可以在微波辅助，超声波辅助的条件下进行。