CN109402209B - 一种从游离态羟基类胡萝卜素制备类胡萝卜素多元酸酯的方法 - Google Patents
一种从游离态羟基类胡萝卜素制备类胡萝卜素多元酸酯的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种使用脂肪酶做为催化剂从游离态羟基类胡萝卜素制备类胡萝卜素多元酸酯的方法。生成的羟基类胡萝卜素多元酸酯具有超过0.2％(W/W，4℃，常压)和2％(W/W，37℃，常压)的饱和溶解度。所述方法包括：(1)将游离态的羟基类胡萝卜素分子在脂肪酶的催化下与多元酸酐发生酯化反应，生成羟基类胡萝卜素多元酸酯。(2)制备产物的分离与纯化。(3)纯化组分的鉴定。(4)纯化组分在水中的饱和溶解度测定。所述方法的优点显著：(1)使用脂肪酶做为酯化反应的催化剂，保障了酯化产物食品安全性。(2)使羟基类胡萝卜素分子在水中具有一定的饱和溶解度。扩大了其在食品中的应用范围。
Description
技术领域
本发明属于食品化学技术领域，具体涉及一种使用脂酶或脂肪酶做为催化剂从游离态羟基类胡萝卜素制备类胡萝卜素多元酸酯的方法。
背景技术
羟基类胡萝卜素，指分子结构上含有羟基的类胡萝卜素。食品和药材中常见的羟基类胡萝卜素包括：叶黄素和玉米黄质等。
(一)叶黄素，中文习惯命名为叶黄素或叶黄质，英文习惯命名为Lutein，中文系统命名为3,3’-二羟基-β,α-胡萝卜素，英文系统命名为3,3’-dihydroxy-β,α-carotene。分子式为C40H56O2，分子量为568.88。CAS号：127-40-2。
叶黄素分子结构的碳骨架由中央多聚烯链和位于两侧的芳香环组成，并在每个芳香环上各有一个羟基(-OH)。叶黄素分子的C40链含多个共轭双键结构。由于烯键的存在，在理论上可以存在多个几何异构体。在自然界中，全反式异构体的数量最多，最常见。其全反式异构体的分子结构见式1。
叶黄素广泛存在于自然界的植物和部分微生物中。在万寿菊(Tagetes erecta的亚种)花中的含量可超过2％(W/W干重)。因此，目前万寿菊花是叶黄素制品的主要生物资源。叶黄素在其中主要是以双酯的形式存在，见下述式(2)叶黄素双酯全反式异构体的分子结构：
叶黄素酯在强碱条件下水解(皂化)形成游离态叶黄素见式(3)：
叶黄素的防治疾病功能显著，对人眼视网膜黄斑有明显的保护作用，可防止黄斑衰退症，并具有淬灭体内自由基、调节人体免疫等功能。
游离态叶黄素是中国已批准合法使用的食品添加剂，属着色剂。其功能是给食品着色。详见“GB 26405-2011食品安全国家标准食品添加剂叶黄素”。目前，游离态叶黄素在食品、保健食品和饲料中均有应用。
叶黄素是脂溶性化合物，在水中不溶解。因此，叶黄素在水介质中的溶解或分散是急需解决的技术问题。目前，所有使用的技术均为乳化法，即：构建水分散体系。所使用的乳化剂包括：吐温、蔗糖酯、阿拉伯胶、单甘脂等。这类水分散体系在食品中表现出相当的不稳定性，严重限制了叶黄素在含水食品中的应用。
(二)玉米黄质，中文习惯命名为玉米黄质或玉米黄素，英文习惯命名为Zeaxanthin，中文系统命名为:(3R,3‘R)-β,β-胡萝卜素-3,3‘-二醇，英文系统命名为(3R,3‘R)-dihydroxy-β,β-carotene。分子式为C40H56O2，分子量为568.88。CAS号：144-68-3。
玉米黄质分子结构的碳骨架由中央多聚烯链和位于两侧的芳香环组成，并在每个芳香环上各有一个羟基(-OH)。玉米黄质分子的C40链含多个共轭双键结构。由于烯键的存在，在理论上可以存在多个几何异构体。在自然界中，全反式异构体的数量最多，最常见。其全反式异构体的分子结构见式(4)：
玉米黄质广泛存在于自然界的植物和部分微生物中。在万寿菊(Tagetes erecta的亚种)花中的含量超过1.5％(W/W干重)。在枸杞果实中的含量超过0.2％(W/W干重)。
因此，目前万寿菊花和枸杞果实是玉米黄素制品的主要生物资源。玉米黄素在万寿菊花和枸杞果实中主要是以双酯的形式存在见式(5)玉米黄质双酯全反式异构体的分子结构：
玉米黄质酯在强碱条件下水解(皂化)形成游离态玉米黄质式(6)：
玉米黄质的防治疾病功能显著，对人眼视网膜黄斑有明显的保护作用，可防止黄斑衰退症，并具有淬灭体内自由基、调节人体免疫等功能。
游离态玉米黄质是我国已批准合法使用的新食品原料(国家卫生和计划生育委员会2017年第7号公告)。
玉米黄质是脂溶性化合物，在水中不溶解。因此，玉米黄质在水介质中的溶解或分散是急需解决的技术问题。目前，所有使用的技术均为乳化法，即：构建水分散体系。所使用的乳化剂包括：吐温、蔗糖酯、阿拉伯胶、单甘脂等。这类水分散体系在食品中表现出相当的不稳定性，严重限制了玉米黄质在含水食品中的应用。
发明内容
为了克服上述问题，本发明的目的在于提供一种使用脂肪酶做为催化剂从游离态羟基类胡萝卜素制备类胡萝卜素多元酸酯的方法，该方法克服了现有羟基类胡萝卜素水分散体系的缺陷，实现羟基类胡萝卜素以真溶液的形式在水环境中的分布。
为了实现上述目的本发明提供一种从游离态羟基类胡萝卜素制备水溶性羟基类胡萝卜素的方法，包括如下步骤：
1)将6×109n活力单位酶粉或液酶，平摊于薄层支撑材料上，涂抹或滴加pH＝7-10的缓冲液，使酶固定于支撑物上，阴干，将带有固定化酶的薄层支撑材料剪成条，待用；
2)将1n摩尔的底物A和20-100n摩尔底物B分别溶于相同水溶性有机试剂，制得3-10μM的反应液A和3-10mM的反应液B；
3)取等体积的反应液A和反应液B，混合均匀，加入带有固定化酶的支撑材料条，使加入的酶量(活力单位数)为103-104/mL；
4)搅拌，在4-55℃下反应6-12小时，得到反应产物(类胡萝卜素多元酸酯)；
5)取5mL反应液。吹氮气浓缩后，在硅胶薄层层析板上点样，以正己烷-丙酮混合液(4:1，V/V)为展层液，进行薄层层析，收集纯化的低极性组分。
其中，所述底物A纯度5-99％W/W的植物源游离态羟基类胡萝卜素，优选为：叶黄素(β,ε-Carotene-3,3'-diol)、玉米黄质(β,β-Carotene-3,3'-diol)或隐黄质(β,β-Caroten-3-ol、β,ε-caroten-3-ol或β,ε-caroten-3'-ol)。
其中，所述底物B为纯度≥70％W/W的2-8C多元酸酐，如：琥珀酸酐或磷酸酐。
其中，所述的水溶性有机试剂为丙酮、四氢呋喃、甲醇或乙醇。
其中，所述酶粉或液酶为微生物源或植物源，可催化酯键生成的酯酶和脂肪酶，如：胆固醇酯水解酶。
其中，所述薄层支撑材料为：滤纸、高分子聚合物，各种纤维或各种纺织品。
本方法的优点：
(1)使用脂肪酶做为酯化反应的催化剂，保障了酯化产物食品安全性。
(2)使羟基类胡萝卜素分子在水中具有一定的饱和溶解度。实现了在非乳化条件下羟基类胡萝卜素的水溶性，为羟基类胡萝卜素在水质食品中的应用创造了条件。
附图说明
图1为本发明所述的一种从游离态叶黄素制备水溶性叶黄素产品的方法流程图。
图2为本发明实施例1中TLC结果图。
图3为本发明实施例1中叶黄素参比样品的MS图谱。
图4为本发明实施例1中反应产物组分I的MS图谱。
图5为本发明实施例2中TLC结果图。
图6为本发明实施例2中国玉米黄质参比样品的MS图谱。
图7为本发明实施例2中反应产物组分I的MS图谱。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步说明。
实施例1
材料：
1.底物A：含有70％(W/W)游离态叶黄素的万寿菊花制备物购自河南中大恒源生物科技股份有限公司。
2.底物B：纯度≥96％(W/W)的琥珀酸酐，购自北京化学试剂厂。
3.酶：胆固醇酯水解酶粉，购自Sigma(Cat N：C9281，500活力单位)。
4.固定化酶支撑材料：定性分析滤纸。
5.叶黄素参比样品，购自贵州迪大科技有限责任公司，华夏标准物质中心(产品编号：GZDD-1376)。
具体步骤如图1所示：
1.酶的固定化：称量0.03克酶粉，均匀平铺于2张直径约7cm的滤纸上，向滤纸上滴加pH＝8的磷酸缓冲液，使酶固定于滤纸上，阴干，将滤纸剪成1×0.5cm纸条，待用。
2.称量0.02g底物A，丙酮溶解并定容至50mL，制得反应液A；称量1.66克底物B，溶于10mL丙酮溶液，混合均匀，制得反应液B。
3.取10mL反应液A加入等量反应液B中，混合均匀，滴在120片固定化酶纸条上，密封置于35℃水浴中搅拌12小时，得到反应产物。
4.取5mL反应液，吹氮气浓缩，在硅胶板上点样。
鉴定步骤：
1.取叶黄素参比样品，溶于丙酮中，制成1％(W/W)的参比样品溶液。-20℃储存、充氮气贮藏待用。
2.制备5cm×15cm厚0.5mm的硅胶(G60)薄层层析(TLC)板备用。
3.制备直径＝1cm、柱床＝10cm的硅胶(G60)柱，备用。
4.TLC分析：将反应产物、反应液A和参比样品溶液各5mL分别进行吹氮气浓缩，在硅胶板上点样，以正己烷-丙酮(4:1，V/V)为展层液，层析，结果如图2所示，其中，A为叶黄素参比样品；B为反应液A；C为反应产物(组分I)。图2结果表明：反应产物C具有很强的非极性，色谱移动距离长(Rf＝7.1)，被鉴定为叶黄素琥珀酸酯。
5.MS鉴定：取TLC板上样品C中Rf值为7.1的组分(组分I)，溶于丙酮中，过滤除去硅胶颗粒。滤液用于MALDI-TOF质谱分析：检测模式：负离子模式。叶黄素参比样品的MS图谱如图3所示。组分I的MS图谱如图4所示，图3显示叶黄素参比样品的分子离子峰核质比为：[M]-＝568
图4显示片段：[M-18-18]-＝768；[M-18-18-100]-＝668(100)；[M-18-18-100-100]-＝568；[M-18-18-100-100-16]-＝552。
分子结构描述：叶黄素琥铂酸双酯
分子量：804
分子式：C48H100O8
结构式：详见式(7)。
图4显示结果表明：组分I具有式(7)所示结构，鉴定为叶黄素琥珀酸酯。
6.溶解度测定：以正己烷-丙酮(4:1，V/V)为流动相，在硅胶柱上对反应产物进行层析分离，收集组分I。在55℃、常压条件下，配制组分I的饱和水溶液。
组分I的饱和水溶液降温至37℃。过滤法收集沉淀。减重法测定纯化组分在水中的饱和溶解度。2.7％(W/W，37℃，常压)。
组分I的饱和水溶液降温至4℃。过滤法收集沉淀。减重法测定纯化组分在水中的饱和溶解度为0.24％(W/W，4℃，常压)。
饱和溶解度测定结果表明：叶黄素琥珀酸酯在常压、37℃条件下具有2.7％(W/W)饱和溶解度，4℃条件下具有0.24％(W/W)的饱和溶解度，实现了叶黄素母体分子在水溶液中的溶解。而现有叶黄素在水中的饱和溶解度为0。
实施例2
材料：
1.底物A：含有70％(W/W)游离态玉米黄质的万寿菊花制备物购自河南中大恒源生物科技股份有限公司。
2.底物B：纯度≥96％(W/W)的琥珀酸酐，购自北京化学试剂厂。
3.酶：胆固醇酯水解酶粉，购自Sigma(Cat N：C9281，500活力单位)。
4.固定化酶支撑材料：定性分析滤纸。
5.玉米黄质参比样品购自上海甄准生物科技有限公司，代理法国EXTRASYNTHESE公司产品，货号：ES-0307S。
具体步骤具体步骤如图1所示：
1.酶的固定化：称量0.03克酶粉，均匀平铺于2张直径约7cm的滤纸上，向滤纸上滴加pH＝8的磷酸缓冲液，使酶固定于滤纸上，阴干。将滤纸剪成1×0.5cm纸条，待用。
2.称量0.02g底物A，丙酮溶解并定容至50mL，制得反应液A。
3.称量1.66克底物B，溶于10mL丙酮溶液，混合均匀，制得反应液B。
4.取10mL反应液A加入等量反应液B中，滴在120片固定化酶纸条上，密封置于35℃水浴中搅拌12小时。
鉴定步骤：
1.取一定量的玉米黄质参比样品，溶于丙酮中，制成1％(W/W)的参比样品溶液。-20℃储存、充氮气贮藏待用。
2.制备5cm×15cm、0.5mm的硅胶(G60)薄层层析(TLC)板备用。
3.制备直径＝1cm、柱床＝10cm的硅胶(G60)柱，备用。
4.TLC鉴定：取反应液、反应液A和参比样品溶液各5mL，吹氮气浓缩，在硅胶板上点样，以正己烷-丙酮(4:1，V/V)为展层液，层析。结果如图5所示，其中，样品A为玉米黄质参比样品；B为反应液A；C为反应产物(组分I)。
图5结果表明：反应产物C具有很强的非极性，色谱移动距离长(Rf＝7.1)，被鉴定为玉米黄质琥珀酸酯。
5.MS鉴定：取TLC板上样品C中Rf值为7.1的组分(组分I)，溶于丙酮中，过滤除去硅胶颗粒。滤液用于MALDI-TOF质谱分析：检测模式：负离子模式。玉米黄质参比样品的MS图谱如图6所示。组分I的MS图谱如图7所示，图6显示玉米黄质参比样品的分子离子峰核质比为：[M]-＝568
图7显示片段：[M-18-18]-＝768；[M-18-18-100]-＝668(100)；[M-18-18-100-100]-＝568；[M-18-18-100-100-16]-＝552。
分子结构描述：玉米黄质琥铂酸双酯
分子量：804
分子式：C48H100O8
结构式：详见式(8)。
6.溶解度测定：以正己烷-丙酮(4:1，V/V)为流动相，在硅胶柱上对反应产物进行层析分离，收集组分I。在55℃、常压条件下，配制组分I的饱和水溶液。
组分I的饱和水溶液降温至37℃。过滤法收集沉淀。减重法测定纯化组分在水中的饱和溶解度。2.4％(W/W，37℃，常压)。
组分I的饱和水溶液降温至4℃。过滤法收集沉淀。减重法测定纯化组分在水中的饱和溶解度为0.21％(W/W，4℃，常压)。
饱和溶解度测定结果表明：玉米黄素酯琥珀酸酯在常压、37℃条件下具有2.4％(W/W)饱和溶解度，4℃条件下具有0.21％(W/W)的饱和溶解度，实现了玉米黄素酯母体分子在水溶液中的溶解。而现有叶黄素在水中的饱和溶解度为0。
说明：显然，上述实施例仅是为清楚地说明本发明所做的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的专业人员，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的、显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
Claims (4)
1.一种从游离态羟基类胡萝卜素制备类胡萝卜素多元酸酯的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将6×109n活力单位的酶粉或液酶，平摊于薄层支撑材料上，涂抹或滴加pH＝7-10的缓冲液，使酶固定于支撑物上，阴干，将带有固定化酶的薄层支撑材料剪成条，待用；
2)将1n摩尔的底物A和20-100n摩尔底物B分别溶于相同水溶性有机试剂，制得3-10μM的反应液A和3-10mM的反应液B；
3)取等体积的反应液A和反应液B，混合均匀，加入带有固定化酶的支撑材料条，使加入的酶量达到活力单位数为103-104/mL；
4)搅拌，在4-55℃下反应6-12小时，得到反应产物类胡萝卜素多元酸酯；
5)取5mL反应液，吹氮气浓缩后，在硅胶薄层层析板上点样，以正己烷-丙酮混合液按体积比4:1为展层液，进行薄层层析，收集纯化的低极性组分；
其中，所述底物A为纯度5-99％W/W的植物源游离态羟基类胡萝卜素；
所述底物B为纯度≥70％W/W的2-8C多元酸酐；
所述2-8C多元酸酐为琥珀酸酐或磷酸酐；
所述酶为胆固醇酯水解酶。
2.如权利要求1所述的从游离态羟基类胡萝卜素制备类胡萝卜素多元酸酯的方法，其特征在于，所述植物源游离态羟基类胡萝卜素为叶黄素、玉米黄质或隐黄质。
3.如权利要求1所述的从游离态羟基类胡萝卜素制备类胡萝卜素多元酸酯的方法，其特征在于，所述的水溶性有机试剂为丙酮、四氢呋喃、甲醇或乙醇。
4.如权利要求1所述的从游离态羟基类胡萝卜素制备类胡萝卜素多元酸酯的方法，其特征在于，所述薄层支撑材料为滤纸、高分子聚合物，纤维或纺织品。
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