CN101054573A

CN101054573A - 一种固定化乙酰胆碱酯酶片和配套基质片及两者的制备方法和用途

Info

Publication number: CN101054573A
Application number: CN 200710051737
Authority: CN
Inventors: 王承明; 阎玉林; 彭云峰; 吴谋成; 杨健; 徐盈
Original assignee: Institute of Hydrobiology of CAS; Huazhong Agricultural University; Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Institute of Hydrobiology of CAS; Huazhong Agricultural University; Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2007-03-26
Filing date: 2007-03-26
Publication date: 2007-10-17

Abstract

本发明提供了一种固定化乙酰胆碱酯酶片和配套基质片及两者的制备方法和用途。固定化乙酰胆碱酯酶片的载体为定性滤纸，乙酰胆碱酯酶吸附于定性滤纸中。它是以鲫鱼脑为乙酰胆碱酯酶的酶源，采用物理吸附法，以定性滤纸为固定载体而制得。配套基质片则用如下方法制得：将重量百分比为0.1～1％的百里香酚蓝酒精溶液与0.1～0.5mol·L^－1的氯化乙酰胆碱溶液按体积比1∶1～1∶5的比例混合，用0.05～0.2mol·L^－1的氢氧化钠溶液滴定，使其颜色由红变蓝，瞬间马上停止滴定，加入到培养皿中，用滤纸吸附即得到基质片。本发明制备的酶片重现性好，活性高，酶活回收率也高。酶片保存容易，操作简便，能用于检测氨基甲酸酯类农药，特别是能广泛应用于各种蔬菜水果的快速农药残留检验。

Description

一种固定化乙酰胆碱酯酶片和配套基质片及两者的制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种固定化乙酰胆碱酯酶片和配套基质片，及两者的制备方法和用途，属于生物技术领域。

背景技术

现在市场上销售的农药杀虫剂中，50％以上属于有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂，其产量占70％以上。这类杀虫剂因价格低、产生抗药性的速度和程度均低于拟除虫菊酯类杀虫剂，颇受农民欢迎。对于农药质量的检测，虽已有必要的检测方法和手段，但多局限于在特定的实验室内进行，用气谱、液谱等大型仪器检测。这些设备操作复杂，价格昂贵，工作条件要求高，抽样检查时间长。目前农药快速检测常用的方法是酶抑制法，酶抑制法是一种简便、灵敏、经济、快速的检测方法，利用这一原理生产的各种速测卡、速测仪，由于其高度的专一性、灵敏性和准确性，正在广泛用于果蔬生产基地以及监督部门。检测用的酶则是决定检测灵敏度的关键因素，现有技术中通常用的是从家畜肝脏、马血清、果蝇和植物等中提取的乙酰胆碱酯酶。以测定乙酰胆碱酯酶(AChE)活力被抑制的程度来判断农药残留是否超标。它可将抽查的蔬菜样本先进行粗筛，将有残毒问题的蔬菜再用气相色谱仪等分析仪器进一步定性和定量分析。如果蔬菜的提取液中不含有机磷或氨基甲酸酯类农药或残留量低，酶的活性就不被抑制，试验中加入的基质底物就被酶水解或少部分水解，水解产物与加入的显色剂反应产生颜色；反之，如果蔬菜的提取液中含有一定量的氨基甲酸酯类农药，酶的活性就被抑制，试验中加入的基质就不能被酶水解，从而不会发生颜色变化或颜色变化很小，用分光光度计法计算出抑制率，就可以判断出蔬菜中含有机磷或氨基甲酸酯类农药的残留情况。然而这种方法存在一些不足。首先，所用乙酰胆碱酯酶(AchE)价格昂贵；其次，由于是在体外进行抑制，某些农药对AChE的抑制并不明显。

与游离酶相比，固定化酶具有稳定性强，重现性好，能重复使用等优点，关于把乙酰胆碱酯酶(AchE)做成酶片，然后再利用显色反应进行氨基甲酸酯农药检验方面的研究在本领域目前很活跃，但现在的研究程度尚仅限于制作，还不能利用其对农药进行检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种固定化乙酰胆碱酯酶片和配套基质片，及两者的制备方法和用途，用该固定化乙酰胆碱酯酶片和配套基质片能用于检测氨基甲酸酯类农药，特别是能简便、快速地检测到氨基甲酸酯类农药是否残留。

实现本发明目的的技术方案是一种固定化乙酰胆碱酯酶片，酶片的载体为定性滤纸，乙酰胆碱酯酶吸附于定性滤纸中。

且酶片中的乙酰胆碱酯酶的酶源为鲫鱼脑。实施例中将对从鲫鱼脑中提取乙酰胆碱酯酶的工艺予以说明。

本发明提供的该固定化乙酰胆碱酯酶片的制备方法是采用物理吸附法，以定性滤纸为固定载体制备，具体步骤如下：将从鲫鱼脑中提取的乙酰胆碱酯酶冷冻干燥，用0.05～0.5mol/·L、pH 7.0-8.0的磷酸缓冲液稀释至0.75-10U单位酶液，在酶液中同时加入占总重量0.5～3％的明胶混合，置于培养皿中，然后将所需规格、数量的定性滤纸片放入培养皿中浸泡，当所有滤纸片充分润湿后，取出于2-25℃条件下，避光干燥，1-5℃密封保存，即得到固定化乙酰胆碱酯酶片。

其中所用乙酰胆碱酯酶的酶源为鲫鱼脑，所用定性滤纸片为直径为5～20mm mm的圆形纸片。

本发明还提供了与该固定化乙酰胆碱酯酶片成套使用的基质片，基质片是按如下方法制备的：将重量百分比为0.1～1％的百里香酚蓝酒精溶液与0.1～0.5mol·L^-1的氯化乙酰胆碱溶液按体积比1∶1～1∶5的比例混合，用0.05～0.2mol·L^-1的氢氧化钠溶液滴定，使其颜色由红变蓝，瞬间马上停止滴定，加入到培养皿中，将待用的滤纸片放入到该培养皿中，当所有滤纸片充分润湿后，取出在2～25℃条件下晾干，最后于1～5℃下，密封、避光保存，即得到基质片。

将本发明提供的固定化乙酰胆碱酯酶片和基质片成套使用，能用于检测氨基甲酸酯类农药，特别是用于各种蔬菜水果的快速农药残留检验。

目前在乙酰胆碱酶研究中酶源通常为家畜肝脏、马血清、果蝇和植物等，而本发明制备的乙酰胆碱酶酶片的酶源是鲫鱼脑，不仅所获得的酶重现性好、热稳定性好，而且来源广泛、成本低廉。又由于本发明中的酶片采用物理吸附法制备，不涉及化学反应，酶活力损失较小，因此酶活回收率较高。且选用的载体为定性滤纸，滤纸含有丰富的纤维素，特别适合作为制备固定化乙酰胆碱酯酶片的固定化载体。

本发明提供的固定化乙酰胆碱酯酶片和基质片成套使用，可用于测定氨基甲酸酯类农药的含量，还可以广泛应用于各种蔬菜水果的快速农药残留检测，特别是氨基甲酸酯类农药残留检测。检测时，酶活性降低则样品中含有农药残留，反之则无残留。本发明的推广和应用可以大大减少或避免因食物引起的农药急性中毒的发生以及出口存在的农药残留超标问题。

具体实施方式

本发明提供的固定化乙酰胆碱酯酶片的载体为定性滤纸，乙酰胆碱酯酶吸附于定性滤纸中，酶片中的乙酰胆碱酯酶的酶源为鲫鱼脑。实施例对从鲫鱼脑中提取乙酰胆碱酯酶进行了说明。

1鲫鱼脑乙酰胆碱脂酶提取工艺

将鲫鱼脑组织在Tris-HCl缓冲液中充分匀浆，取上清液，加入聚乙二醇(PEG)2000，离心，弃上清液，沉淀用磷酸盐缓冲液溶解，即得粗酶液。粗酶液过DEAE-SephadexA-50柱，用磷酸缓冲溶液梯度洗脱，收集洗脱液。洗脱液在透析袋中用PEG 20000浓缩体积，Tris-HCl缓冲溶液中透析。过DEAE-SephadexG-200柱层析：Tris-HCl缓冲溶液洗脱，洗脱液为所提取的精酶液，再浓缩干燥，即得精酶。

2酶片的制作

将从鲫鱼脑中提取的乙酰胆碱酯酶冷冻干燥，用0.05～0.5mol/·L、pH 7.0-8.0的磷酸缓冲液稀释至0.75-10U单位酶液，在酶液中加入占总重量百分比为0.5～3％的明胶混合，置于培养皿中，然后将定性滤纸剪成5～20mm的圆形纸片放入培养皿中浸泡，当所有滤纸片充分润湿后，取出于2-25℃条件下，避光干燥，1-5℃密封保存，即得到固定化乙酰胆碱酯酶片。

3基质片的制作

将重量百分比为0.1～1％的百里香酚蓝酒精溶液与0.1～0.5mol·L^-1的氯化乙酰胆碱溶液按体积比1∶1～1∶5的比例混合，用0.05～0.2mol·L^-1的氢氧化钠溶液滴定，使其颜色由红变蓝，瞬间马上停止滴定，加入到培养皿中，将待用的滤纸片放入到该培养皿中，当所有滤纸片充分润湿后，取出在2～25℃条件下晾干，最后于1～5℃下，密封、避光保存，即得到基质片。

4将制备的固定化乙酰胆碱酯酶片和基质片用作农药检验

4.1分析步骤

(1)样品处理：选取有代表性的蔬菜样品，冲洗掉表面泥土，剪成1cm见方碎片，取样品1g，放入烧杯或提取瓶中，加入5ml缓冲溶液，振荡1-2min，倒出提取液，静置3-5min，待用。

(2)对照实验测试：取出一酶片放在培养皿中，取1mL蒸馏水滴加在酶片上，3分钟后，将一基质片压在酶片上，使二者完全重合压紧。5分钟后观察基质片颜色变化，基质片颜色从蓝色变为橙红色，为阴性。即无氨基甲酸酯类农药抑制酶活，使基质片底物在乙酰胆碱酯酶作用下发生反应，颜色发生变化。

(3)样品溶液测试：将样品配制成溶液，取出一酶片放在培养皿中，取1mL样品滴加在酶片上，3分钟后，将一基质片压在酶片上，使二者完全重合压紧。5分钟后观察基质片颜色变化，基质片变为浅蓝色，或变为白色，为阳性。即存在氨基甲酸酯类农药抑制酶活，基质片底物几乎没有乙酰胆碱酯酶的作用，不发生化学反应，颜色不发生变化。对阳性结果的样品，可用其他方法进一步确定农药的具体含量。

4.2最低检出限的确定

用不同浓度的农药进行显色反应，在农药西维因或杀螟丹浓度为2000mg·L^-1时，酶活性可以100％抑制，基质片由蓝色变为白色或变为淡蓝色，与对照具有明显的区别，通过使用不同浓度的农药进行抑制显色反应从而确定了两种农药检出极限的大致范围。用酶片进行这两种农药检验时，通过使用不同浓度的农药进行抑制显色反应从而确定了两种农药检出限分别为80-100mg·L^-1与90-100mg·L^-1。

Claims

1、一种固定化乙酰胆碱酯酶片，其特征在于：酶片的载体为定性滤纸，乙酰胆碱酯酶吸附于定性滤纸中。

2、根据权利要求1所述的固定化乙酰胆碱酯酶片，其特征在于：酶片中的乙酰胆碱酯酶的酶源为鲫鱼脑。

3、一种权利要求1所述固定化乙酰胆碱酯酶片的制备方法，其特征是采用物理吸附法，以定性滤纸为固定载体制备，具体步骤如下：将从鲫鱼脑中提取的乙酰胆碱酯酶冷冻干燥，用0.05～0.5mol/·L、pH7.0-8.0的磷酸缓冲液稀释至0.75-10U单位酶液，在酶液中同时加入占总重量0.5～3％的明胶混合，置于培养皿中，然后将所需规格、数量的定性滤纸片放入培养皿中浸泡，当所有滤纸片充分润湿后，取出于2-25℃条件下，避光干燥，1-5℃密封保存，即得到固定化乙酰胆碱酯酶片。

4、根据权利要求3所述固定化乙酰胆碱酯酶片的制备方法，其特征在于：所用乙酰胆碱酯酶的酶源为鲫鱼脑。

5、根据权利要求3所述固定化乙酰胆碱酯酶片的制备方法，其特征在于：所用定性滤纸片为直径为5～20mm的圆形纸片。

6、一种与权利要求1所述固定化乙酰胆碱酯酶片成套使用的基质片，其特征是按如下方法制备：将重量百分比为0.1～1％的百里香酚蓝酒精溶液与0.1～0.5mol·L^-1的氯化乙酰胆碱溶液按体积比1∶1～1∶5的比例混合，用0.05～0.2mol·L^-1的氢氧化钠溶液滴定，使其颜色由红变蓝，瞬间马上停止滴定，加入到培养皿中，将待用的滤纸片放入到该培养皿中，当所有滤纸片充分润湿后，取出在2～25℃条件下晾干，最后于1～5℃下，密封、避光保存，即得到基质片。

7、一种权利要求6所述基质片的制备方法，其特征是采用具体步骤如下：将重量百分比为0.1～1％的百里香酚蓝酒精溶液与0.1～0.5mol·L^-1的氯化乙酰胆碱溶液按体积比1∶1～1∶5的比例混合，用0.05～0.2mol·L^-1的氢氧化钠溶液滴定，使其颜色由红变蓝，瞬间马上停止滴定，加入到培养皿中，将待用的滤纸片放入到该培养皿中，当所有滤纸片充分润湿后，取出在2～25℃条件下晾干，最后于1～5℃下，密封、避光保存，即得到基质片。

8、一种权利要求1所述固定化乙酰胆碱酯酶片的用途是与权利要求6所述基质片成套使用，用于氨基甲酸酯类农药的检测，特别是用于各种蔬菜水果的快速农药残留检验。