CN101581670A - 一种乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器的制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器的制备方法，涉及一种乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器的制备方法。本发明解决了现有酶生物传感器受环境影响造成酶活性丧失，造成假阳性；酶的价格昂贵，不可逆反应造成生物传感器无法多次使用，仪器成本过高；选择性不高等问题。一种乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器的制备方法的步骤为：首先对鲫鱼脑乙酰胆碱酯酶进行提取分离、纯化，然后采用壳聚糖将鲫鱼脑乙酰胆碱酯酶进行固定化，制备出固定化乙酰胆碱酯酶膜，即得酰胆碱酯酶荧光生物传感器。本发明制备的乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器，具有不需连接外部电源、不用参考电极、体积小、质量轻、响应速度快、抗电磁干扰、防腐蚀、灵敏度很高、测量带宽很宽、操作简便、成本低廉等优点。可应用于食品中有机磷农药的快速检测。

Description

一种乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器的制备方法
技术领域
本发明涉及一种乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器的制备方法。
背景技术
我国是一个农业大国，农药是农业生产中十分重要的生产资料。由于有机磷类农药具有药效高、品种多、防治对象多、在环境中易降解等优点，在我国农业生产上得到大量使用。有机磷农药及残留物致使人、畜中毒的情况时常发生。解决农产品的关键问题是检测技术建立一种准确快速、简单廉价的农药残留检测技术是食品安全和环境保护的当务之急。
有机磷生物传感器快速检测方法的研制国内外均有报道，电化学酶电极生物传感器的研制较多，但存在受环境影响造成酶活性丧失，造成假阳性；酶的价格昂贵，不可逆反应造成生物传感器无法多次使用，仪器成本过高；选择性不高。与电化学酶传感器相比，荧光型酶传感器具有不需连接外部电源不用参考电极、体积小、质量轻、易于小型化、信息容量大、响应速度快等优点。
本发明制备的乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器，具有贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续及可控、工艺简便、成本低廉等一系列优点。可应用于食品中有机磷农药的快速检测。
发明内容
为了解决现有酶生物传感器受环境影响造成酶活性丧失、造成假阳性；酶的价格昂贵、不可逆反应造成生物传感器无法多次使用、仪器成本过高等问题，本发明提供了一种乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器的制备方法，能有效提高食品中有机磷农药残留测定的速度和精度。本发明中一种乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器的制备方法，其特征在于乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器的制备方法的步骤如下：一、乙酰胆碱酯酶的提取：1、将购买的活鲫鱼头于自制冰盒保存，剪开头骨，再用镊子将整个脑组织取出，以滤纸吸去血丝，并除去非脑组织，放入表面皿中称重。2、Tris-HCl浸提法含0.1％Triton X-100和0.05mol/L NaCl的Tris-HCl冰浴条件下匀浆(每15s，间歇5s)。匀浆液在0～4℃离心(10000r/min)10min。二、纯化：1、脱盐将硫酸铵分级盐析后，Tris-Hcl(0.07mol/l，pH＝8)溶解的酶液装入透析袋中，对蒸馏水透析48h，并用BaCl2溶液检测透析袋外溶液，直至透析袋外溶液与BaCl2溶液无沉淀生成。2、使用SephadexG-200凝胶层析柱(2.5cm×60cm)，洗脱液为缓冲液，以一定的流速每管3ml进行收集，测定每管酶液比活力，检测时做三个平行样。三、乙酰胆碱酯酶固定化：壳聚糖膜吸附-交联法固定化乙酰胆碱酯酶：取0.2g壳聚糖粉末，加入1％醋酸10mL，室温下磁力搅拌5～10min，至形成黄色溶胶。4℃，10000r/min离心3min，除去不溶颗粒。将纤维素膜(1cm×1cm×0.04cm)置于该溶胶中浸泡12h，取出在自制晾干床上晾干后再置于0.1mol/L、pH值为8.0的PBS浸泡12h，取出，晾干备用。将50μl酶液用移液器喷涂在已制备的壳聚糖膜两面，置于4℃吸附，用戊二醛于4℃进行交联，取出膜，用PBS将多余的戊二醛洗净，吸干，即制得壳聚糖酶膜。晾干最后得到乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器。
本发明中，在乙酰胆碱酯酶固定化方法中，采用壳聚糖吸附-交联法固定化乙酰胆碱酯酶，克服了游离乙酰胆碱酯酶稳定性差，易失活、乙酰胆碱酯酶催化反应后与反应体系混在一起，无法回收和重复利用、生产成本偏高等缺点。与游离酶相比，固定化酶在保持其高效、专一及温和的酶催化反应特性的同时，还呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用。所制备的乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器，具有贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续及可控、工艺简便、成本低廉等一系列优点。可应用于食品中有机磷农药的快速检测。
具体实施方式
具体实施方式一：本具体实施方式中，1、一种乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器的制备方法，其特征在于乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器的制备方法的步骤如下：一、乙酰胆碱酯酶的提取：1、将购买的活鲫鱼头于自制冰盒保存，剪开头骨，再用镊子将整个脑组织取出，以滤纸吸去血丝，并除去非脑组织，放入表面皿中称重。2、Tris-HCl浸提法含0.1％Triton X-100和0.05mol/L NaCl的Tris-HCl冰浴条件下匀浆(每15s，间歇5s)。匀浆液在0～4℃离心(10000r/min)10min。二、纯化：1、脱盐将硫酸铵分级盐析后，Tris-Hcl(0.07mol/l，pH＝8)溶解的酶液装入透析袋中，对蒸馏水透析48h，并用BaCl2溶液检测透析袋外溶液，直至透析袋外溶液与BaCl2溶液无沉淀生成。2、使用SephadexG-200凝胶层析柱(2.5cm×60cm)，洗脱液为缓冲液，以一定的流速每管3ml进行收集，测定每管酶液比活力，检测时做三个平行样。三、乙酰胆碱酯酶固定化：壳聚糖膜吸附-交联法固定化乙酰胆碱酯酶：取0.2g壳聚糖粉末，加入1％醋酸10mL，室温下磁力搅拌5～10min，至形成黄色溶胶。4℃，10000r/min离心3min，除去不溶颗粒。将纤维素膜(1cm×1cm×0.04cm)置于该溶胶中浸泡12h，取出在自制晾干床上晾干后再置于0.1mol/L、pH值为8.0的PBS浸泡12h，取出，晾干备用。将50μl酶液用移液器喷涂在已制备的壳聚糖膜两面，置于4℃吸附，用戊二醛于4℃进行交联，取出膜，用PBS将多余的戊二醛洗净，吸干，即制得壳聚糖酶膜。晾干最后得到乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器。
具体实施方式二：本具体实施方式与具体实施方式一不同的是：其特征在于步骤一中，乙酰胆碱酯酶的提取，采用pH＝8.0～10.0Tris-HCl溶液，冰浴条件下匀浆4～10min(每15s，间歇5s)，匀浆比(质量：体积)为1∶5。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本具体实施方式与具体实施方式一不同的是：其特征在于步骤二中使用SephadexG-200凝胶层析柱纯化，洗脱液为0.1～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液，流速0.15mL/min。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式四：本具体实施方式与具体实施方式一不同的是：其特征在于步骤三中50μl酶液置于4℃吸附12h，用0.1～0.4％戊二醛于4℃进行交联1.0～3.0h。其它与具体实施方式一相同。

Claims (4)

1、一种乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器的制备方法，其特征在于乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器的制备方法的步骤如下：一、乙酰胆碱酯酶的提取：1、将购买的活鲫鱼头于自制冰盒保存，剪开头骨，再用镊子将整个脑组织取出，以滤纸吸去血丝，并除去非脑组织，放入表面皿中称重。2、Tris-HCl浸提法含0.1％Triton X-100和0.05mol/LNaCl的Tris-HCl冰浴条件下匀浆(每15s，间歇5s)。匀浆液在0～4℃离心(10000r/min)10min。二、纯化：1、脱盐将硫酸铵分级盐析后，Tris-Hcl(0.07mol/l，pH＝8)溶解的酶液装入透析袋中，对蒸馏水透析48h，并用BaCl2溶液检测透析袋外溶液，直至透析袋外溶液与BaCl2溶液无沉淀生成。2、使用SephadexG-200凝胶层析柱(2.5cm×60cm)，洗脱液为缓冲液，以一定的流速每管3ml进行收集，测定每管酶液比活力，检测时做三个平行样。三、乙酰胆碱酯酶固定化：壳聚糖膜吸附-交联法固定化乙酰胆碱酯酶：取0.2g壳聚糖粉末，加入1％醋酸10mL，室温下磁力搅拌5～10min，至形成黄色溶胶。4℃，10000r/min离心3min，除去不溶颗粒。将纤维素膜(1cm×1cm×0.04cm)置于该溶胶中浸泡12h，取出在自制晾干床上晾干后再置于0.1mol/L、pH值为8.0的PBS浸泡12h，取出，晾干备用。将50μl酶液用移液器喷涂在已制备的壳聚糖膜两面，置于4℃吸附，用戊二醛于4℃进行交联，取出膜，用PBS将多余的戊二醛洗净，吸干，即制得壳聚糖酶膜。晾干最后得到乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器。
2、根据权利要求1所述的一种乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器的制备方法，其特征在于步骤一中，乙酰胆碱酯酶的提取，采用pH＝8.0～10.0Tris-HCl溶液，冰浴条件下匀浆4～10min(每15s，间歇5s)，匀浆比(质量∶体积)为1∶4～1∶10。
3、根据权利要求1所述的一种乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器的制备方法，其特征在于步骤二中使用SephadexG-200凝胶层析柱纯化，洗脱液为0.1～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液，流速0.1～0.5mL/min。
4、根据权利要求1所述的一种乙酰胆碱酯酶荧光生物传感器的制备方法，其特征在于步骤三中50μl酶液置于4℃吸附0～12h，用0.1～0.4％戊二醛于4℃进行交联1.0～3.0h。
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