CN110044859A - 荧光比率检测乙酰胆碱的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了荧光比率检测乙酰胆碱的方法，包括以下步骤：步骤一、配制等体积的含有相同浓度乙酰胆碱酯酶、胆碱氧化酶、辣根过氧化物酶、邻苯二胺和碳量子点，且含有不同浓度乙酰胆碱的多个标准溶液；步骤二、检测多个标准溶液在442nm和573nm处的荧光强度I442和I573，建立I573/I442与乙酰胆碱浓度之间的线性关系式；步骤三、配制未知乙酰胆碱浓度的待测溶液，检测其在442nm和573nm处的荧光强度I442和I573，根据步骤二中所得的线性关系式，即可计算待测溶液中的乙酰胆碱浓度。本发明具有操作简单、检测快速且灵敏度高等优点。

Description

荧光比率检测乙酰胆碱的方法
技术领域
本发明涉及乙酰胆碱检测技术领域。更具体地说，本发明涉及一种荧光比率检测乙酰胆碱的方法。
背景技术
乙酰胆碱(ACh)发现于神经肌肉接头和动物突触，异常低浓度的乙酰胆碱可以引起各种神经心理和神经精神疾病。碳点除具有独特的光学性质外，还因为主要含有碳元素而表现出很低的细胞毒性以及良好的生物相容性，从而促使碳点成为传统重金属量子点在生物领域如生物细胞标记、疾病诊断、生物成像、生物检测、药物释放应用方面的替代物。目前，国内外对乙酰胆碱的检测方法主要有化学发光法、荧光法、分光光度法以及电化学方法等。但大多数方法存在操作方法复杂、反应时间长、灵敏度不高等缺陷。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种荧光比率检测乙酰胆碱的方法，该方法操作简单、检测快速且灵敏度高，能进行样品中乙酰胆碱的高灵敏识别。
为了实现根据本发明的目的和其它优点，提供了一种荧光比率检测乙酰胆碱的方法，包括以下步骤：
步骤一、配制等体积的含有相同浓度乙酰胆碱酯酶、胆碱氧化酶、辣根过氧化物酶、邻苯二胺和碳量子点，且含有不同浓度乙酰胆碱的多个标准溶液；
步骤二、检测所述多个标准溶液在442nm和573nm处的荧光强度I442和I573，建立I573/I442与乙酰胆碱浓度之间的线性关系式；
步骤三、配制与步骤一中的标准溶液相同体积相同乙酰胆碱酯酶、胆碱氧化酶、辣根过氧化物酶、邻苯二胺和碳量子点浓度和未知乙酰胆碱浓度的待测溶液，检测其在442nm和573nm处的荧光强度I442和I573，根据步骤二中所得的线性关系式，即可计算待测溶液中的乙酰胆碱浓度。
优选的是，所述的荧光比率检测乙酰胆碱的方法，步骤一中，所述多个标准溶液的具体配制方法为：A、用乙酰胆碱干粉配置浓度为1×10-2mol/L的原液；B、将所述原液用Tris-HCl缓冲液进行梯度稀释，得不同浓度的乙酰胆碱标准溶液；C、分别向相同体积的所述不同浓度的乙酰胆碱标准溶液中加入相同体积的乙酰胆碱酯酶溶液、胆碱氧化酶溶液、辣根过氧化物酶溶液、邻苯二胺溶液和碳量子点溶液，混匀后，即得。
优选的是，所述的荧光比率检测乙酰胆碱的方法，B中，所述不同浓度的乙酰胆碱标准溶液的浓度具体为：0mol/L、5×10-5mol/L、1×10-4mol/L、1.5×10-4mol/L、2×10-4mol/L，所述Tris-HCl缓冲液的pH为7.4，浓度为0.05mol/L。
优选的是，所述的荧光比率检测乙酰胆碱的方法，C中，具体为：先分别向相同体积的所述不同浓度的乙酰胆碱标准溶液中加入相同体积的乙酰胆碱酯酶溶液、胆碱氧化酶溶液、辣根过氧化物酶溶液和邻苯二胺溶液，于37℃下混合30min后，再分别加入相同体积的碳量子点溶液，并用微量进样器搅拌，于常温下混合反应1min，即得。
优选的是，所述的荧光比率检测乙酰胆碱的方法，C中，所述乙酰胆碱酯酶溶液的浓度为80U/L，所述胆碱氧化酶溶液的浓度为4U/mL，所述辣根过氧化物酶溶液的浓度为1×10-5g/mL，所述邻苯二胺溶液的浓度为3×10-2mol/L，所述碳量子点溶液的浓度为5.3×10-6g/mL，且所述乙酰胆碱酯酶溶液、胆碱氧化酶溶液、辣根过氧化物酶溶液、邻苯二胺溶液和碳量子点溶液均由pH为7.4，浓度为0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液配制而成。
优选的是，所述的荧光比率检测乙酰胆碱的方法，步骤一中，所述碳量子点的制备方法为：称取0.20g精氨酸，加入20mL超纯水溶解，混合均匀后，将所得混合液转移至50mL反应釜中，于180℃下反应6h，自然冷却至室温后，将所得反应液用0.22μm的微孔滤膜过滤，取滤液冷冻干燥，即得。
优选的是，所述的荧光比率检测乙酰胆碱的方法，所述碳量子点制备时，将所述混合液转移至反应釜前，还包括，将所述混合液放入带有微电流发生器的容器中，进行通电处理，电流大小为10mA，处理时间为4min。
优选的是，所述的荧光比率检测乙酰胆碱的方法，步骤二中，荧光检测的激发波长为380nm，激发和发射狭缝均为5nm。
本发明至少包括以下有益效果：
第一、本发明利用乙酰胆碱酯酶会把乙酰胆碱水解，水解产物为胆碱，胆碱在胆碱氧化酶的作用下产生过氧化氢，而辣根过氧化物酶与过氧化氢相互作用后生成具有强氧化性的羟基自由基，将邻苯二胺氧化成2,3-二氨基吩嗪，2,3-二氨基吩嗪能通过内部过滤效应猝灭碳量子点的荧光，而2,3-二氨基吩嗪本身也具有一定强度的荧光，由此可以通过两者的荧光强度比值构建比率型检测体系检测乙酰胆碱的含量，检测过程简单方便，灵敏度高、检测限低，可实现混合样品中乙酰胆碱的快速灵敏检测，对乙酰胆碱的检测限可达到9.85×10-6mol/L。
第二、在碳量子点制备时，先将所述混合液进行微电流处理，最后再放入反应釜中进行水热合成，微电流处理，可改变精氨酸分子的电荷分布，使制得的碳量子点具有更高的荧光发光强度，使得对乙酰胆碱的检测限进一步降低，达6.35×10-6mol/L。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1根据本发明一个实施例中的多个标准溶液，在激发波长为380nm时得到的荧光光谱图；
图2是根据本发明一个实施例中以乙酰胆碱浓度为横坐标，I573/I442为纵坐标，绘制的标准曲线。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：
一种荧光比率检测乙酰胆碱的方法，包括以下步骤：
步骤一、配制等体积的含有相同浓度乙酰胆碱酯酶、胆碱氧化酶、辣根过氧化物酶、邻苯二胺和碳量子点，且含有不同浓度乙酰胆碱的多个标准溶液，具体为：A、用乙酰胆碱干粉和超纯水配制成浓度为1×10-2mol/L的原液；B、将所述原液用pH为7.4、浓度为0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液进行梯度稀释，制得不同浓度的乙酰胆碱标准溶液，其浓度依次为0mol/L、5×10-5mol/L、1×10-4mol/L、1.5×10-4mol/L、2×10-4mol/L；C、分别向100μl所述不同浓度的乙酰胆碱标准溶液中加入100μl浓度为80U/L的乙酰胆碱酯酶溶液，100μl浓度为4U/mL的胆碱氧化酶溶液，100μl浓度为1×10-5g/mL辣根过氧化物酶溶液、100μl浓度为3×10-2mol/L邻苯二胺溶液和100μl浓度为5.3×10-6g/mL碳量子点溶液，混匀后，即得，其中，所述乙酰胆碱酯酶溶液、胆碱氧化酶溶液、辣根过氧化物酶溶液、邻苯二胺溶液和碳量子点溶液均由所述Tris-HCl缓冲液配制而成；所述碳量子点的制备方法为：称取0.20g精氨酸，加入20mL超纯水溶解，混合均匀后，将所得混合液转移至50mL反应釜中，于180℃下反应6h，自然冷却至室温后，将所得反应液用0.22μm的微孔滤膜过滤，取滤液冷冻干燥，即得；
步骤二、将所述多个标准溶液依次用RF-6000荧光分光光度计，在设定激发波长为380nm，激发和发射狭缝均为5nm下，检测所述多个标准溶液在442nm和573nm处的荧光强度I442和I573，建立I573/I442与乙酰胆碱浓度之间的线性关系式；
步骤三、配制与步骤一中的标准溶液相同体积相同乙酰胆碱酯酶、胆碱氧化酶、辣根过氧化物酶、邻苯二胺和碳量子点浓度和未知乙酰胆碱浓度的待测溶液，检测其在442nm和573nm处的荧光强度I442和I573，根据步骤二中所得的线性关系式，即可计算待测溶液中的乙酰胆碱浓度。
实施例2：
一种荧光比率检测乙酰胆碱的方法，其过程与实施例1大致相同，区别在于：C中，具体为：先分别向所得不同浓度的乙酰胆碱标准溶液中加入相同体积的乙酰胆碱酯酶溶液、胆碱氧化酶溶液、辣根过氧化物酶溶液和邻苯二胺溶液，于37℃下混合30min后，再分别加入相同体积的碳量子点溶液，并用微量进样器搅拌，于常温下混合反应1min，即得；所述多个标准溶液的荧光光谱图如图1所示，其中，I442为碳点的荧光，I573为2,3-二氨基吩嗪的荧光，曲线a、b、c、d、e对应的乙酰胆碱标准溶液浓度依次为0mol/L、5×10-5mol/L、1×10- 4mol/L、1.5×10-4mol/L、2×10-4mol/L，以乙酰胆碱浓度为横坐标，I573/I442为纵坐标，绘制的标准曲线如图2所示，从图2可看出，乙酰胆碱浓度与I573/I442具有良好的线性关系，线性方程为I573/I442＝0.063×c乙酰胆碱+0.17，R2＝0.994。
采用本实施例的方法对乙酰胆碱的检出限为9.85×10-6mol/L。
实施例3：
一种荧光比率检测乙酰胆碱的方法，其过程与实施例2大致相同，区别在于：所述碳量子点制备时，将所述混合液转移至反应釜前，还包括，将所述混合液放入带有微电流发生器的容器中，进行通电处理，电流大小为10mA，处理时间为4min。
采用本实施例的方法对乙酰胆碱的检出限为6.35×10-6mol/L。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (8)

1.荧光比率检测乙酰胆碱的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、配制等体积的含有相同浓度乙酰胆碱酯酶、胆碱氧化酶、辣根过氧化物酶、邻苯二胺和碳量子点，且含有不同浓度乙酰胆碱的多个标准溶液；
步骤二、检测所述多个标准溶液在442nm和573nm处的荧光强度I442和I573，建立I573/I442与乙酰胆碱浓度之间的线性关系式；
步骤三、配制与步骤一中的标准溶液相同体积相同乙酰胆碱酯酶、胆碱氧化酶、辣根过氧化物酶、邻苯二胺和碳量子点浓度和未知乙酰胆碱浓度的待测溶液，检测其在442nm和573nm处的荧光强度I442和I573，根据步骤二中所得的线性关系式，即可计算待测溶液中的乙酰胆碱浓度。
2.如权利要求1所述的荧光比率检测乙酰胆碱的方法，其特征在于，步骤一中，所述多个标准溶液的具体配制方法为：A、用乙酰胆碱干粉配置浓度为1×10-2mol/L的原液；B、将所述原液用Tris-HCl缓冲液进行梯度稀释，得不同浓度的乙酰胆碱标准溶液；C、分别向相同体积的所述不同浓度的乙酰胆碱标准溶液中加入相同体积的乙酰胆碱酯酶溶液、胆碱氧化酶溶液、辣根过氧化物酶溶液、邻苯二胺溶液和碳量子点溶液，混匀后，即得。
3.如权利要求2所述的荧光比率检测乙酰胆碱的方法，其特征在于，B中，所述不同浓度的乙酰胆碱标准溶液的浓度具体为：0mol/L、5×10-5mol/L、1×10-4mol/L、1.5×10-4mol/L、2×10-4mol/L，所述Tris-HCl缓冲液的pH为7.4，浓度为0.05mol/L。
4.如权利要求3所述的荧光比率检测乙酰胆碱的方法，其特征在于，C中，具体为：先分别向相同体积的所述不同浓度的乙酰胆碱标准溶液中加入相同体积的乙酰胆碱酯酶溶液、胆碱氧化酶溶液、辣根过氧化物酶溶液和邻苯二胺溶液，于37℃下混合30min后，再分别加入相同体积的碳量子点溶液，并用微量进样器搅拌，于常温下混合反应1min，即得。
5.如权利要求2或4任一所述的荧光比率检测乙酰胆碱的方法，其特征在于，C中，所述乙酰胆碱酯酶溶液的浓度为80U/L，所述胆碱氧化酶溶液的浓度为4U/mL，所述辣根过氧化物酶溶液的浓度为1×10-5g/mL，所述邻苯二胺溶液的浓度为3×10-2mol/L，所述碳量子点溶液的浓度为5.3×10-6g/mL，且所述乙酰胆碱酯酶溶液、胆碱氧化酶溶液、辣根过氧化物酶溶液、邻苯二胺溶液和碳量子点溶液均由pH为7.4，浓度为0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液配制而成。
6.如权利要求1所述的荧光比率检测乙酰胆碱的方法，其特征在于，步骤一中，所述碳量子点的制备方法为：称取0.20g精氨酸，加入20mL超纯水溶解，混合均匀后，将所得混合液转移至50mL反应釜中，于180℃下反应6h，自然冷却至室温后，将所得反应液用0.22μm的微孔滤膜过滤，取滤液冷冻干燥，即得。
7.如权利要求6所述的荧光比率检测乙酰胆碱的方法，其特征在于，所述碳量子点制备时，将所述混合液转移至反应釜前，还包括，将所述混合液放入带有微电流发生器的容器中，进行通电处理，电流大小为10mA，处理时间为4min。
8.如权利要求1所述的荧光比率检测乙酰胆碱的方法，其特征在于，步骤二中，荧光检测的激发波长为380nm，激发和发射狭缝均为5nm。
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