CN113777088A - 一种基于碳点的乙酰胆碱酯酶的荧光检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测乙酰胆碱酯酶浓度的方法，用硝酸处理近红外光发射的碳点得到氧化型碳点CDs‑HNO3，由于CDs‑HNO3表面含有大量水溶性基团，Ag+能与CDs‑HNO3之间产生很强的配位作用和静电作用，引起碳点聚集，从而可以明显的猝灭CDs‑HNO3的荧光发射峰。而AChE可以催化水解乙酰硫代胆碱(ATCh)，并产生硫代胆碱(TCh)，TCh上巯基与Ag+的结合能力更强。因此，我们可以用AgNO3再去处理CDs‑HNO3得到荧光强度极弱的Ag+‑CDs‑HNO3，从而使Ag+‑CDs‑HNO3的荧光强度增强，通过测定Ag+‑CDs‑HNO3荧光增强的强度，我们可以定量的检测出溶液中AChE的浓度。该方法检测过程简单方便、灵敏度高、响应快速且检测限低。

Description

一种基于碳点的乙酰胆碱酯酶的荧光检测方法
技术领域
本发明涉及一种检测乙酰胆碱酯酶浓度的方法，属于乙酰胆碱酯酶检测领域。
背景技术
乙酰胆碱酯酶(AChE)是普遍存在于周围神经系统中的一种关键酶,可特异性催化底物乙酰硫代胆碱发生水解反应产生硫代胆碱和醋酸盐,这一过程与阿尔兹海默症和炎症过程等相关疾病有着密切的关系，从而乙酰胆碱酯酶在生物信号传导中起到十分重要的作用，乙酰胆碱酯酶的高灵敏度、快速响应及操作简便的检测对于临床诊断，阿尔兹海默症药物以及有机磷农药的分析检测是非常重要的。当前，国内外常见的乙酰胆碱酯酶检测方法主要有电化学方法、荧光发、分光光度法以及化学发光法等。但大多数方法存在操作方法复杂、反应时间长、灵敏度不高等缺陷。
发明内容
本发明提供了一种检测乙酰胆碱酯酶浓度的方法，用硝酸处理近红外光发射碳点纳米颗粒得到氧化型碳点CDs-HNO3，CDs-HNO3在650nm和681nm处的荧光发射峰都显著提升，相比于未改性的碳点，用硝酸改性后的碳点其荧光强度明显增强。由于CDs-HNO3表面含有大量水溶性基团，Ag+能与CDs-HNO3之间产生很强的配位作用和静电作用，引起碳点聚集，从而可以明显的猝灭CDs-HNO3的荧光发射峰。其中，Ag+猝灭的是CDs-HNO3681nm处的荧光发射峰，而650nm处的荧光发射峰保持不变。乙酰胆碱酯酶AChE可以催化水解乙酰硫代胆碱ATCh，并产生硫代胆碱TCh，TCh上巯基与Ag+的结合能力更强。因此，我们可以用AgNO3再去处理CDs-HNO3得到荧光强度极弱的Ag+-CDs-HNO3，利用Ag+与碳点和硫代胆碱TCh之间的竞争性结合，当体系有硫代胆碱TCh存在时，修饰在碳点上的Ag+可以脱离碳点与体系中的硫代胆碱结合，从而使Ag+-CDs-HNO3的荧光强度增强。因此，通过测定Ag+-CDs-HNO3荧光增强的强度，我们可以定量的检测出溶液中乙酰胆碱酯酶AChE的浓度。本发明不仅容易操作，并且具有灵敏度高、响应快速且检测限低等优点。
本发明提供了一种检测乙酰胆碱酯酶浓度的方法，包括以下步骤：
(1)制备近红外发射碳点纳米颗粒CDs；
(2)以步骤(1)所述CDs为原料制备氧化型近红外发射碳点纳米颗粒CDs-HNO3；
(3)将步骤(2)所述氧化型近红外发射碳点纳米颗粒CDs-HNO3与AgNO3溶液孵育过夜，得到Ag+-CDs-HNO3；
(4)将步骤(3)中制得的Ag+-CDs-HNO3用Tris-HAc缓冲溶液配制为Ag+-CDs-HNO3碳量子点溶液；
(5)配制等体积的氯化硫代乙酰胆碱溶液和乙酰胆碱酯酶标准溶液，混合反应后，得到混合液a；
(6)取与步骤(5)中混合液a等体积的步骤(4)中Ag+-CDs-HNO3碳量子点溶液，记为溶液b，将溶液a和溶液b混合反应后，得标准样品系c；
(7)取步骤(6)中标准样品系c并检测其在681nm处的荧光强度，记为Fc；取步骤(6)中溶液b并检测其在681nm处的荧光强度，记为Fb；然后建立(Fc-Fb)与乙酰胆碱酯酶浓度CAChE之间的线性关系式；
(8)配制与步骤(5)中乙酰胆碱酯酶标准溶液体积相同、浓度未知的乙酰胆碱酯酶待测溶液，参照步骤(5)、(6)、(7)制得待测样品并测定其荧光强度Fc和Ag+-CDs-HNO3碳量子点溶液b的荧光强度Fb，根据(Fc-Fb)与乙酰胆碱酯酶浓度CAChE之间的线性关系式，即可计算出所述乙酰胆碱酯酶待测溶液中的乙酰胆碱酯酶的浓度。
其中：
步骤(1)中，所述近红外发射碳点纳米颗粒CDs的制备方法为：取0.1-1g的谷胱甘肽和10-20g的甲酰胺溶液，混合均匀后，在100-200℃的高压反应釜中反应5-15h，将反应后的反应液冷冻干燥，即得。
步骤(2)中，所述氧化型近红外发射碳点纳米颗粒CDs-HNO3的制备方法为：称取10-20mg步骤(1)中制备得到的近红外发射碳点纳米颗粒CDs和10-20μL浓度为10-15mol/L的HNO3溶液，用20-40mL H2O稀释，混合均匀后，在30-100℃油浴下磁力搅拌回流12-24h，将回流后的反应液过滤；用NaOH溶液调节过滤后的反应液，使其pH值至中性，再过滤，取滤下物，冷冻干燥，即得。
步骤(3)中，所述Ag+-CDs-HNO3的制备方法为：称取10-20mg步骤(2)中制备得到的氧化型近红外发射碳点纳米颗粒CDs-HNO3，加入100-300μL浓度为20-60mmol/L的AgNO3溶液，用10-30mL去离子水稀释，通入N2，在室温下搅拌10-20h，搅拌结束后，通过过滤、透析将未反应的Ag+除去，最后将纯化的Ag+-CDs-HNO3冷冻干燥，即得。
步骤(4)中，所述Ag+-CDs-HNO3溶液的制备为：将上述步骤(3)中制得的Ag+-CDs-HNO3用pH为7.4、浓度为10mmol/L Tris-HAC缓冲溶液配制为浓度为1-20μg/mL的碳量子点溶液；
步骤(5)中，所述乙酰胆碱酯酶标准溶液的浓度为0.5mU/mL～30mU/mL，且上述溶液均采用Tris-HAc缓冲溶液配制，所述Tris-HAc缓冲溶液的pH为7.4、浓度为10mmol/L；所述乙酰胆碱酯酶标准溶液的具体配制方法为：先利用乙酰胆碱酯酶干粉配制浓度为1000mU/mL的原液，再将所述原液用所述Tris-HAc缓冲溶液进行梯度稀释，即得；所述混合反应条件为：反应温度为20-50℃、反应时间为20-60min。
步骤(6)中，所述混合反应条件为：反应温度为10-30℃、反应时间为1-5min。
步骤(7)中，荧光测定的条件为：激发波长为420nm，激发和发射狭缝均为5nm。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
首先，制得的氧化型近红外发射碳点纳米颗粒CDs-HNO3表面含有大量水溶性基团，能与Ag+之间产生很强的配位作用和静电作用，用AgNO3处理氧化型近红外发射碳点纳米颗粒CDs-HNO3可以将Ag+修饰在碳点表面，使碳点发生聚集，碳点的荧光发生猝灭。其次，乙酰胆碱酯酶AChE可以特异性催化水解乙酰硫代胆碱生成含有巯基的硫代胆碱TCh，硫代胆碱TCh上的巯基与Ag+有更强的结合能力，当在Ag+-CDs-HNO3溶液中有硫代胆碱TCh存在时，修饰在碳点表面上的Ag+会脱离碳点，与体系中硫代胆碱TCh上的巯基结合，最终使Ag+-CDs-HNO3的荧光增强，由此可以用该碳点荧光增强的强度定量的检测乙酰胆碱酯酶AChE的浓度。该方法检测过程简单方便、灵敏度高、响应快速且检测限低，本发明公开的方法对乙酰胆碱酯酶的检测限为0.88μU/mL，与其他的荧光测试方法相比其检测限低1-4个数量级。
附图说明
图1为实施例1中标准样品系在激发波长为420nm时得到的荧光光谱图。
图2为实施例1中以乙酰胆碱酯酶浓度为横坐标、(Fc-Fb)为纵坐标绘制的标准曲线。
图3为实施例2中标准样品系在激发波长为420nm时得到的荧光光谱图。
图4为实施例2中以乙酰胆碱酯酶浓度为横坐标、(Fc-Fb)为纵坐标绘制的标准曲线。
具体实施方案
本发明下面将通过具体的实施例进行更详细的描述，但本发明的保护范围并不受限于这些实施例。
实施例1：
一种检测乙酰胆碱酯酶浓度的方法，具体包括如下步骤：
1.制备近红外发射碳点纳米颗粒CDs：
称取0.6g谷胱甘肽和19.4g甲酰胺溶液，超声混合30min后装入到50mL聚四氟乙烯的高压反应釜中，160℃下反应10h，待其自然冷却后，用0.22微米的微孔膜过滤，过滤后再用分子量为1000的透析袋透析两天，最后将产品冷冻后放入冻干机中冷冻干燥两天，即得到近红外发射的碳点。
2.制备氧化型近红外发射碳点纳米颗粒CDs-HNO3：
称取10mg步骤1中制备的近红外发射碳点纳米颗粒CDs，量取17μL浓度为14.5mol/L的HNO3，将HNO3用20mL去离子水稀释，再将称取的近红外发射碳点纳米颗粒CDs溶解到稀释的HNO3溶液中，混合均匀后，将混合液加入到50mL圆底烧瓶中，在60℃油浴下磁力搅拌回流12h，反应结束后待回流后的反应液自然冷却后，用NaOH溶液调节其pH至中性，然后用0.22微米的微孔膜过滤，过滤后再用分子量为1000的透析袋透析24h，最后将产品冷冻后放入冻干机中冷冻干燥两天，即得。
3.制备Ag+-CDs-HNO3
称取10mg步骤2中制备的氧化型近红外发射碳点纳米颗粒CDs-HNO3，量取200μL浓度为50mmol/L的AgNO3溶液，用19.8mL去离子水稀释，混合均匀后，将混合液加入到50mL三口烧瓶中，通入N2，在室温下磁力搅拌12h，反应结束后，用0.22微米的微孔膜过滤,过滤后再用分子量为1000的透析袋透析24h，最后将产品冷冻后，放入冻干机中冷冻干燥两天，即得。
4.将上述步骤3中制得的Ag+-CDs-HNO3用pH为7.4、浓度为10mmol/L Tris-HAC缓冲溶液配制为浓度为10μg/mL的Ag+-CDs-HNO3溶液；
5.称取10mg乙酰胆碱酯酶粉末，量取2mL去离子水配制浓度为1000mU/mL的原液，将所述原液用pH为7.4、浓度为10mmol/L Tris-HAC缓冲溶液进行梯度稀释，制得不同浓度的乙酰胆碱酯酶标准溶液，其浓度依此为0.5mU/mL、5mU/mL、10mU/mL、15mU/mL、20mU/mL、25mU/mL、30mU/mL，再向100μL所述不同浓度的乙酰胆碱酯酶标准溶液中加入100μL浓度为1mmol/L的氯化乙酰硫代胆碱，在37℃下反应30min，得混合液a，其中，所述氯化乙酰硫代胆碱用所述Tris-HAC缓冲溶液配制；
6.分别向所述混合液系a中加入1800μL步骤二中的Ag+-CDs-HNO3溶液b，于25℃下反应2min，得标准样品系c；
7.用RF-6000荧光分光光度计，设定激发波长为420nm，激发和发射狭缝均为5nm，分别检测所述标准样品系c在681nm处的荧光强度，并记录Fc；同样地，用RF-6000荧光分光光度计，设定激发波长为420nm，激发和发射狭缝均为5nm，测定Ag+-CDs-HNO3溶液的荧光强度，并记录Fb；
8.得到所述标准样品系c在激发波长为420nm时的荧光光谱图，如图1所示，再以乙酰胆碱酯酶的浓度为横坐标，碳点荧光增强的强度(Fc-Fb)为纵坐标绘制的标准曲线，如图2所示，得到(Fc-Fb)与CAChE具有良好的线性关系，线性方程为Fc-Fb＝1833.46CAChE+2108.29，R2＝0.996；
9.配制与步骤5中的乙酰胆碱酯酶标准溶液体积相同，浓度未知的乙酰胆碱酯酶待测溶液，参照步骤5-7，测定荧光强度Fb和Fc，根据(Fc-Fb)与CAChE之间的线性关系式，即可计算出所述乙酰胆碱酯酶待测溶液中的乙酰胆碱酯酶的浓度。
实施例2：
一种检测乙酰胆碱酯酶浓度的方法，具体包括如下步骤：
1.制备近红外发射碳点纳米颗粒CDs：与实施例1相同；
2.制备氧化型近红外发射碳点纳米颗粒CDs-HNO3：
称取10mg步骤1中制备的近红外发射碳点纳米颗粒CDs，量取17μL浓度为14.5mol/L的HNO3，将HNO3用20mL去离子水稀释，再将称取的近红外发射碳点纳米颗粒CDs溶解到稀释的HNO3溶液中，混合均匀后，将混合液加入到50mL圆底烧瓶中，在60℃油浴下磁力搅拌回流24h，反应结束后待回流后的反应液自然冷却后，用NaOH溶液调节其pH至中性，然后用0.22微米的微孔膜过滤，过滤后再用分子量为1000的透析袋透析24h，最后将产品冷冻后放入冻干机中冷冻干燥两天，即得。
3.制备Ag+-CDs-HNO3
称取10mg步骤2中制备的氧化型近红外发射碳点纳米颗粒CDs-HNO3，量取300μL浓度为50mmol/L的AgNO3，用19.7mL去离子水稀释，混合均匀后，将混合液加入到50mL三口烧瓶中，通入N2，在室温下磁力搅拌24h，反应结束后，用0.22微米的微孔膜过滤,过滤后再用分子量为1000的透析袋透析24h，最后将产品冷冻后，放入冻干机中冷冻干燥两天，即得。
4.将上述步骤3中制得的Ag+-CDs-HNO3用pH为7、浓度为10mmol/L的Tris-HAC缓冲溶液配制为浓度为10μg/mL的碳量子点溶液；
5.称取10mg乙酰胆碱酯酶粉末，量取2mL去离子水配制浓度为1000mU/mL的原液，将所述原液用pH为7、浓度为10mmol/L Tris-HAC缓冲溶液进行梯度稀释，制得不同浓度的乙酰胆碱酯酶标准溶液，其浓度依此为6mU/mL、10mU/mL、14mU/mL、16mU/mL、18mU/mL、22mU/mL、24mU/mL，再向100μL所述不同浓度的乙酰胆碱酯酶标准溶液中加入100μL浓度为1mmol/L的氯化乙酰硫代胆碱，在37℃下反应30min，得混合液a，其中，所述氯化乙酰硫代胆碱用所述Tris-HAC缓冲溶液配制；
6.分别向所述混合液系a中加入1800μL步骤二中的Ag+-CDs-HNO3碳量子点溶液b，于25℃下反应2min，得标准样品系c；
7.用RF-6000荧光分光光度计，设定激发波长为420nm，激发和发射狭缝均为5nm，分别检测所述标准样品系c在681nm处的荧光强度，并记录Fc；同样地，用RF-6000荧光分光光度计，设定激发波长为420nm，激发和发射狭缝均为5nm，测定Ag+-CDs-HNO3碳量子点溶液的荧光强度，并记录Fb；
8.得到所述标准样品系c在激发波长为420nm时的荧光光谱图，如图3所示，再以乙酰胆碱酯酶的浓度为横坐标，碳点荧光增强的强度(Fc-Fb)为纵坐标绘制的标准曲线，如图4所示，得到Fc-Fb与CAChE具有良好的线性关系，线性方程为Fc-Fb＝2871.92CAChE-758.58，R2＝0.997；
9.配制与步骤5中的乙酰胆碱酯酶标准溶液体积相同，浓度未知的乙酰胆碱酯酶待测溶液，参照步骤5-7，测定荧光强度Fb和Fc，根据Fc-Fb与CAChE之间的线性关系式，即可计算出所述乙酰胆碱酯酶待测溶液中的乙酰胆碱酯酶的浓度。
采用本实施例的方法对乙酰胆碱酯酶的检出限为0.88μU/mL，与其他的荧光测试方法相比其检测限低1-4个数量级，如表1所示。
表1本发明实施例2与参考文献的检测效果对比
Figure BDA0003289689680000061
Figure BDA0003289689680000071
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干改进和变换，这些都属于本发明的保护范围。
参考文献：
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Claims (10)

1.一种检测乙酰胆碱酯酶浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备近红外发射碳点纳米颗粒CDs；
(2)以步骤(1)所述CDs为原料制备氧化型近红外发射碳点纳米颗粒CDs-HNO3；
(3)将步骤(2)所述CDs-HNO3与AgNO3溶液孵育过夜，得到Ag+-CDs-HNO3；
(4)将上述步骤(3)中制得的Ag+-CDs-HNO3用Tris-HAc缓冲溶液配制为Ag+-CDs-HNO3碳量子点溶液；
(5)配制等体积的氯化硫代乙酰胆碱溶液和乙酰胆碱酯酶标准溶液，混合反应后，得到混合液a；
(6)取与步骤(5)中混合液a等体积的步骤(4)中Ag+-CDs-HNO3碳量子点溶液，记为溶液b，将溶液a和溶液b混合反应后，得标准样品系c；
(7)取步骤(6)所述标准样品系c并检测其在681nm处的荧光强度，记为Fc；检测步骤(6)所述溶液b并检测其在681nm处的荧光强度，记为Fb；然后建立(Fc-Fb)与乙酰胆碱酯酶浓度CAChE之间的线性关系式；
(8)配制与步骤(5)中乙酰胆碱酯酶标准溶液体积相同、浓度未知的乙酰胆碱酯酶待测溶液，参照步骤(5)、(6)、(7)制得待测样品并测定其荧光强度Fc和Ag+-CDs-HNO3碳量子点溶液b的荧光强度Fb，根据(Fc-Fb)与乙酰胆碱酯酶浓度CAChE之间的线性关系式，即可计算出所述乙酰胆碱酯酶待测溶液中的乙酰胆碱酯酶的浓度。
2.如权利要求1所述的检测乙酰胆碱酯酶浓度的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述CDs的制备方法为：取0.1-1g的谷胱甘肽和10-20g的甲酰胺溶液，混合均匀后，在100-200℃的高压反应釜中反应5-15h，反应结束后，经过滤、透析、冷冻干燥，即得。
3.如权利要求1所述的检测乙酰胆碱酯酶浓度的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述CDs-HNO3的制备方法为：称取10-20mg步骤(1)中制备的CDs和10-20μL浓度为10-15mol/L的HNO3溶液，用20-40mL H2O稀释，混合均匀后，在30-100℃油浴下磁力搅拌回流12-24h，将回流后的反应液过滤；用NaOH溶液调节过滤后的反应液，使其pH值至中性，经过滤、透析、冷冻干燥，即得。
4.如权利要求1所述的检测乙酰胆碱酯酶浓度的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述Ag+-CDs-HNO3的制备方法为：称取10-20mg的CDs-HNO3，加入100-300μL浓度为20-60mmol/L的AgNO3溶液，用10-30mL去离子水稀释，通入N2，在室温下搅拌10-20h，搅拌结束后，经过滤、透析、冷冻干燥，即得。
5.如权利要求1所述的检测乙酰胆碱酯酶浓度的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述Ag+-CDs-HNO3碳量子点溶液的制备方法为：将步骤(3)中制得的Ag+-CDs-HNO3用pH为7.4、浓度为10mmol/LTris-HAC缓冲溶液配制为浓度为1-20μg/mL的Ag+-CDs-HNO3碳量子点溶液。
6.如权利要求1所述的检测乙酰胆碱酯酶浓度的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述乙酰胆碱酯酶标准溶液的浓度为0.5mU/mL～30mU/mL，且上述溶液均采用Tris-HAc缓冲溶液配制，所述Tris-HAc缓冲溶液的pH为7.4、浓度为10mmol/L。
7.如权利要求7所述的检测乙酰胆碱酯酶浓度的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述乙酰胆碱酯酶标准溶液的具体配制方法为：先利用乙酰胆碱酯酶干粉配制浓度为1000mU/mL的原液，再将所述原液用所述Tris-HAc缓冲溶液进行梯度稀释，即得。
8.如权利要求1所述的检测乙酰胆碱酯酶浓度的方法，其特征在于，步骤(5)中，混合反应的条件为：反应温度为20-50℃、反应时间为20-60min。
9.如权利要求1所述的检测乙酰胆碱酯酶浓度的方法，其特征在于，步骤(6)中，混合反应的条件为：反应温度为10-30℃、反应时间为1-5min。
10.如权利要求1所述的检测乙酰胆碱酯酶浓度的方法，其特征在于，步骤(7)中，荧光测定的条件为：激发波长为420nm，激发和发射狭缝均为5nm。
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