CN110161092A - 一种AchE/GQDs/N-F-TiO2Ns光电化学生物传感器制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及电化学分析技术领域，具体涉及一种AchE/GQDs/N‑F‑TiO2Ns光电化学生物传感器制备方法及其应用。本发明所提供的AchE/GQDs/N‑F‑TiO2Ns光电化学生物传感器包括GQDs/N‑F‑TiO2Ns和AchE，所述GQDs/N‑F‑TiO2Ns包括氮氟掺杂的二氧化钛纳米管阵列(N‑F‑TiO2Ns)、以及修饰在所述二氧化钛纳米管阵列上的石墨烯量子点(GQDs)；所述乙酰胆碱酯酶(AchE)交联修饰在所述GQDs/N‑F‑TiO2Ns上；所述光电化学生物传感器的光电流响应最高的波长为365nm。所述AchE通过壳聚糖交联修饰在所述GQDs/N‑F‑TiO2Ns上。石墨烯量子点的修饰提高了光生电流强度，由于其具有良好的生物兼容性，提高了酶在电极上的固定作用，同时提高了酶与底物的亲和力。本发明可以用于与乙酰胆碱及乙酰胆碱酯酶相关的检测研究中。

Description

一种AchE/GQDs/N-F-TiO2Ns光电化学生物传感器制备方法及 其应用
技术领域
本发明涉及电化学分析技术领域，具体涉及一种 AchE/GQDs/N-F-TiO2Ns光电化学生物传感器制备方法及其应用。
背景技术
乙酰胆碱(Acetycholine，简称Ach)是一种重要的神经递质，存在于许多生物体的周围神经系统和中枢神经系统中；Ach在记忆和认知功能中起着重要作用，并控制着骨骼肌和心肌的运动。因此，它的浓度太高或太低都会导致疾病的发生，例如精神分裂症。精神分裂症(Schizophrenia，简称SZ)属于慢性衰弱的神经精神疾病，被认为是慢性残疾的主要原因，精神分裂症患者经常被发现具有与胆碱能系统变化相关的认知功能障碍。
乙酰胆碱酯酶(Acetyl cholinesterase)，简称AchE，是生物神经传导中的一种关键性酶，在胆碱能突触间，该酶能催化水解乙酰胆碱，终止神经递质对突触后膜的兴奋作用，保证神经信号在生物体内的正常传递。乙酰胆碱酯酶参与细胞的发育和成熟，能促进神经元发育和神经再生。如果乙酰胆碱酯酶的活性被抑制，则会导致突触后膜持续处于兴奋状态。
Ket试验的动物模型是最广泛接受的模拟神经分裂症的动物模型之一，因为它产生的动物行为和生化变化，都类似于人类的精神分裂症的症状。目前，氯胺酮对乙酰胆碱酯酶的作用研究主要是基于对实验动物的观察，但是氯胺酮对光电化学中乙酰胆碱酯酶的作用机制仍然是未知的。因此，体外研究氯胺酮对乙酰胆碱酯酶的作用机制具有重要的意义。
光电化学生物传感器技术是近年来新出现并迅速发展的一种分析方法，其检测原理是给予光电化学反应过程中产生的光电流或光电压等信号的变化与待测物的浓度间的关系进行定量检测。光电化学生物传感器在分析界受到广泛关注。传统的分析方法，如高效液相色谱法(HPLC)，需要复杂的预处理和熟练的人员，甚至需要很长时间，相比而言，光电化学生物传感器的方法具有背景信号低、灵敏度高、便携性好、稳定性好、响应时间短等优点。二氧化钛作为一种半导体材料，由于其长期稳定性，无毒性，较强的氧化活性和良好的生物相容性，二氧化钛受到了广泛的关注。可见光下的低吸收效率和光生电子-空穴对的重新组合严重妨碍了它们的PEC应用。贵金属如Ag， Au纳米粒子(NPs)可以有效地加速电子转移并降低光生电子空穴对由于局域表面等离子体共振(LSPR)而产生的复合速率。有相关文献报道，利用微波辅助加热法制备Ag-N/F/TiO2NTs电极，贵金属Ag 的修饰可以提高TiO2NTs的光电性能。但是，贵金属存在原料价格昂贵，微波辅助加热法将Ag修饰在电极上需要特殊的设备等缺点。石墨烯作为二维sp2杂化碳纳米片，具有高比表面积和高导热性。此外，石墨烯具有高迁移率的电荷载体，这可以大大提高含石墨烯的金属氧化物纳米复合材料的电导率。石墨烯量子点(GQDs)的尺寸小于20nm，在紫外光下产生荧光。它具有较大的比表面积，良好的生物相容性，成本低和低毒性。同时，其制备工艺简单，不需要大型的仪器设备进行制备。GQDs还保留着石墨烯的一些优异的性能。由于其电化学性质，与石墨烯相似，GQDs已被用作电极表面的改性剂。因此，我们选择石墨烯量子点作为信号放大光电化学活性材料。本研究采用光电化学方法建立了体外模拟人体内神经类毒剂氯胺酮对乙酰胆碱酯酶的影响。
发明内容
本发明的目的在于：针对现有技术中存在的上述问题，提供一种 AchE/GQDs/N-F-TiO2Ns光电化学生物传感器制备方法及其应用，所述光电化学生物传感器的制备原理是：本电化学生物传感器能够在 365nm光激发下产生光生电子和空穴，以氯化乙酰硫代胆碱(Acetylcholine chloride，ATCl)作为底物，经AchE催化水解所得的硫代胆碱(thiocholine，TCh)能够作为电子牺牲的供体，在空穴上发生氧化反应，有效捕获光生空穴，抑制光生空穴与光生电子的复合率，从而提高了光电流，增大了放大的信号；在光电检测体系中加入氯胺酮，氯胺酮与乙酰胆碱酯酶相作用，引起其活性变化进而对硫代乙酰胆碱的水解效率产生影响，表现为光生电流发生改变。乙酰胆碱酯酶酶活性的大小与在工作电极上产生的光生电流的改变量成相关性，由此可实现对氯胺酮影响下乙酰胆碱酯酶的酶活检测。所述光电化学生物传感器的应用是：将底物ATCl加入到添加有氯胺酮的 AchE/GQDs/N-F-TiO2Ns传感器中，检测光电流，发现氯胺酮对AchE 的活性有抑制作用。本发明还可以应用于其他物质对AchE的作用研究。
为实现上述目的，达到上述效果，本发明是通过以下技术方案实现：
一种AchE/GQDs/N-F-TiO2Ns光电化学生物传感器，包括 GQDs/N-F-TiO2Ns和AchE，所述GQDs/N-F-TiO2Ns包括氮氟掺杂的二氧化钛纳米管阵列以及修饰在所述二氧化钛纳米管阵列上的石墨烯量子点；所述AchE交联修饰在所述GQDs/N-F-TiO2Ns上。
进一步，用不同波长的光对所述AchE/GQDs/N-F-TiO2Ns光电化学生物传感器进行照射，所述光电化学生物传感器的光电流响应最高的波长为365nm。
进一步，所述AchE通过壳聚糖交联修饰在所述 GQDs/N-F-TiO2Ns上。
一种AchE/GQDs/N-F-TiO2Ns光电化学生物传感器制备方法，包括以下步骤：
1)用电化学阳极氧化法制备N-F-TiO2Ns电极
用不同粒径的砂纸对钛片进行打磨清洁，依次用丙酮、无水乙醇、去离子水对钛片进行冲洗，将钛片置于抛光液中进行抛光，抛光1min 后取出，用丙酮和去离子水依次冲洗，氮气氛下干燥；
以制备好的石墨电极为阴极，钛片为阳极，外加电压20V，以含有0.1mol/L NH4F和1mol/L(NH4)2SO4的溶液为电解质，阳极化进行2小时，煅烧1小时后制得N-F-TiO2Ns电极；
2)用高温裂解法制备GQDs(石墨烯量子点)并修饰在 N-F-TiO2Ns电极上
用分析天平秤取2.2000g的一水合柠檬酸置于50ml小烧杯中，将其放置在电陶炉上进行缓慢加热7分钟，直到一水合柠檬酸变为橙色液体即可停止加热，此时液体温度为170℃；用滴管将橙色液体迅速转移到磁力搅拌器上的100ml 10mg/mL NaOH溶液中，得到橙黄色溶液，加入10mg/mL HCL调节PH值至7，所得为浅绿色的溶液，将溶液置于紫外灯下，可观察到溶液发出荧光，表明石墨烯量子点 (GQDs)制备成功；
将N-F-TiO2Ns电极浸入含上述GQDs的溶液中，浸泡10min，用二次蒸馏水冲洗，室温晾干，GQDs被修饰在N-F-TiO2Ns的修饰电极表面，制得GQDs/N-F-TiO2Ns电极；
3)用交联法构建AchE/GQDs/N-F-TiO2Ns光电化学生物传感器
将含有AchE和壳聚糖的混合溶液滴涂在GQDs/N-F-TiO2Ns修饰电极上，晾干后得到AchE/GQDs/N-F-TiO2Ns光电化学生物传感器。所述AchE和壳聚糖的混合溶液，AchE的浓度为500U/mL，壳聚糖浓度为5.0mg/mL。
进一步，上述步骤1)中的石墨电极的制备方法是：
将石墨碳棒裁剪成半径0.4cm、长度5.5cm，制备相同规格的石墨碳棒4支；分别用铝片包裹住裁剪好的碳棒一端做电极帽，采用电焊的方式用三节长度为2.5cm的铜制导线将电极帽依次焊接成非闭合的矩形，选择大小合适的(根据使用的电解池选择)试剂瓶盖，在其中心打半径为0.5cm的圆孔，以圆孔圆心作为边长2.5cm正方形对角线的交点，并分别以正方形四个角顶点为圆心打半径为1.0cm的4 个圆孔；制备好的石墨电极和打好孔的瓶盖进行组装即可。
优选的，上述的步骤1)中的抛光液的成分及体积比为：HF： HNO3：H2O＝1：4：5。
本发明还提供上述AchE/GQDs/N-F-TiO2Ns光电化学生物传感器在研究氯胺酮对乙酰胆碱酯酶的抑制作用中的应用。
上述AchE/GQDs/N-F-TiO2Ns光电化学生物传感器在探究氯胺酮对乙酰胆碱酯酶的抑制作用中的应用方法为：在光电化学电池中，以所述AchE/GQDs/N-F-TiO2Ns光电化学生物传感器为工作电极，以饱和甘汞电极为参比电极，以铂丝为辅助电极，所述工作电极的电压设定为+0.6V，在浓度为1M、pH为6.0的磷酸盐缓冲溶液中，以氙灯为光源，波长为365nm条件下，采用计时电流法，记录光电流响应值，实现氯胺酮对乙酰胆碱酯酶的动力学研究。
上述AchE/GQDs/N-F-TiO2Ns光电化学生物传感器可以用于筛选具有抑制或激活乙酰胆碱酯酶作用的生化物质。
上述AchE/GQDs/N-F-TiO2Ns光电化学生物传感器可以用于检测乙酰胆碱及其衍生物。
有益效果：
本发明提供的AchE/GQDs/N-F-TiO2Ns光电化学生物传感器能够在365nm光激发下产生电子和空穴，以氯化乙酰硫代胆碱(ATCl) 作为底物，经AchE催化水解所得的硫代胆碱(thiocholine，TCh)能够作为电子牺牲的供体。在空穴上发生氧化反应，有效捕获光生空穴，抑制光生空穴与光生电子的复合率，从而提高了光电流，增大了放大的信号。
石墨烯量子点的修饰提高了光生电流值，由于其具有良好的生物兼容性，提高了酶在电极上的固定作用，同时提高了酶与底物的亲和力。
本发明中使用石墨烯量子点(GQDs)修饰于N-F-TiO2Ns，实验结果表明，光电流的响应明显增大。相比于贵重金属的修饰，石墨烯量子点(GQDs)的修饰不仅成本低，工艺简单，而且具有较大的比表面积，良好的生物相容性，低毒性。
本发明可以用于研究乙酰胆碱酯酶的活性损伤，并且可用于筛选对乙酰胆碱酯酶有抑制或激活活性的生化物质。本发明的 AchE/GQDs/N-F-TiO2Ns光电化学生物传感器用于研究氯胺酮对乙酰胆碱酯酶的的活性，对研究氯胺酮对人体神经系统作用影响具有重要现实意义。
附图说明
图1是石墨电极制备示意图。
图2是制备石墨烯量子结果图；图中：(A)：石墨烯量子点的紫外光谱，内图：右侧内图是肉眼观察(左)与紫外光照射(右)石墨烯量子点的实物图谱；(B)：石墨烯量子点荧光光谱。
图3是本发明光电化学生物传感器制备过程中修饰石墨烯量子点、乙酰胆碱酯酶的光暗条件下电流响应图；图中，曲线a为 N-F-TiO2Ns的光暗条件下电流响应，曲线b为GQDs/N-F-TiO2Ns的光暗条件下电流响应，曲线c为AchE/GQDs/N-F-TiO2Ns光暗条件下电流响应。
图4是ATCl对乙酰胆碱酯酶的动力学曲线。
图5是ATCl对乙酰胆碱酯酶的Lineweaver-Burk曲线。
图6是在有不同浓度氯胺酮存在条件下，ATCl对乙酰胆碱酯酶的Lineweaver-Burk曲线。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：
制备AchE/GQDs/N-F-TiO2Ns光电化学生物传感器
第一步：利用电化学阳极氧化技术制备N-F-TiO2Ns电极
在阳极氧化之前，先用不同的砂纸打磨钛片，随后把钛片浸在蒸馏水中超声10min，依次用丙酮、无水乙醇、二次蒸馏水进行超声清洗，在每种物质中超声10min，然后把干净的钛片浸在氢氟酸和硝酸的混合液中1min，混合液的体积比例为V(HF)：V(HNO3)：V(H2O)＝1： 4：5，之后钛片用丙酮和蒸馏水冲洗，氮气氛下干燥。
石墨碳棒被用作石墨电极材料，裁剪至其半径r＝0.4cm、长度 l＝5.5cm，制备相同规格的石墨碳棒4支。再分别用铝片包裹住裁剪好的碳棒一端做电极帽。采用电焊的方式分别将三节长度为2.5cm的铜制导线和电极帽焊接成未封口的正方形，制备成石墨电极，备用。
选择大小合适的(根据使用的电解池选择)试剂瓶盖，在其中心打半径为0.5cm的圆孔，以圆孔圆心作为边长2.5cm正方形对角线的交点，并分别以正方形四个角顶点为圆心打半径为1.0cm的4个圆孔，备用。将制备好的石墨电极和打好孔的瓶盖进行组装即可使用。石墨电极的制备如图1所示。
N-F-TiO2Ns电极是在柱状的电化学反应器(半径为30mm，高为70mm)里制备。在整个制备过程中以含有0.1M的NH4F和1M 的(NH4)2SO4溶液作为电解质，4支上述手工制作的石墨电极用作阴极，外加电压为20V。氧化后，钛片在500℃干燥的有氧环境里煅烧 1小时。加热和冷却速率保持在2.5℃/min，所得即为N-F-TiO2Ns电极。
本发明中，电解液(含有0.1M NH4F的1M(NH4)2SO4溶液)可通过一步阳极氧化技术实现对二氧化钛纳米管的氮氟同时掺杂，对比了不同阳极氧化时间下所得电极的光电流强度，发现氧化时间为2小时电极的光生电流强度最大。
第二步：采用高温裂解法制备石墨烯量子点及浸泡法将石墨烯量子点修饰在N-F-TiO2Ns中
用分析天平秤取2.2000g的一水合柠檬酸置于小烧杯中，将其放置在温度为170℃的电陶炉上进行加热7分钟，直到一水合柠檬酸变为橙色液体停止加热。随后，将其转移至磁力搅拌器上，在搅拌的条件下，加入100ml 10mg/mL NaOH溶液，即可以得到橙黄色的溶液，再加入10mg/mL HCl调节PH值，用pH计进行测量PH值为7，即可得到浅绿色溶液。将溶液置于紫外灯下，可观察到溶液发出荧光，表明石墨烯量子点制备成功。
将N-F-TiO2Ns电极浸入5mL pH＝7.00的石墨烯量子点溶液中，浸泡10分钟，取出电极，用二次蒸馏水冲洗，室温晾干，石墨烯量子点即被修饰在N-F-TiO2Ns修饰电极表面，所获即为 GQDs/N-F-TiO2Ns修饰电极。
第三步：利用交联法将AchE固定在GQDs/N-F-TiO2Ns修饰电极
将制得的酶溶液10μl(500U/mL AchE，5.0mg/mL壳聚糖)滴涂到GQDs/N-F-TiO2Ns修饰电极的一侧，晾干，所得即为 AchE/GQDs/N-F-TiO2Ns光电化学生物传感器。
实施例一的结果如图1-2所示，图1为石墨电极制备的示意图；图2所示(A)石墨烯量子点的紫外光谱，内图：该图是正常条件下 (左图)与紫外光照射石墨烯量子点(右图)的实物图谱；(B)石墨烯量子点荧光光谱；图2表明了本实施例成功制备了石墨烯量子点；图2所示不同类型电极的光暗条件下的电流响应图。图3中，曲线a为N-F-TiO2Ns的光暗条件下的电流响应，曲线b为 GQDs/N-F-TiO2Ns的的光暗条件下的电流响应，曲线c为 AchE/GQDs/N-F-TiO2Ns的光暗条件下的电流响应。比较曲线a、b、 c可知，N-F-TiO2Ns修饰石墨烯量子后光电流提高并且修饰乙酰胆碱酯酶成功。
本实施例制备得到的AchE/GQDs/N-F-TiO2Ns光电化学生物传感器，是通过阳极氧化技术在金属钛片上制备得到氮氟掺杂的二氧化钛纳米管阵列(N-F-TiO2Ns)，通过高温裂解及浸泡法制备石墨烯量子点并将其修饰到二氧化钛纳米管阵列上(GQDs/N-F-TiO2Ns)，以壳聚糖为交联剂将乙酰胆碱酯酶AchE修饰在GQDs/N-F-TiO2Ns上制备得AchE/GQDs/N-F-TiO2Ns光电化学生物传感器。石墨烯量子点的修饰提高了光生电流强度，同时提高了酶与底物的亲和力。
实施例二：
AchE/GQDs/N-F-TiO2Ns光电化学生物传感器对ATCl的光电流响应
氯化乙酰硫代胆碱(ATCl)可以作为AchE催化水解的底物，产物为硫代胆碱(TCh)，而TCh能够作为电子牺牲的供体，理论上在空穴上发生氧化反应，有效捕获光生空穴，抑制光生空穴与光生电子的复合率，从而提高了光电流，增大了放大的信号。将ATCl应用于实施例一中制备的AchE/GQDs/N-F-TiO2Ns光电化学生物传感器上，验证本发明的生物传感器是否能有电流的响应。
以实施例1中制备的AchE/GQDs/N-F-TiO2Ns光电化学生物传感器为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝为辅助电极，光电化学电池中工作电极的电压设定为+0.6V，在pH＝7.00的磷酸盐缓冲溶液中，以500W氙灯为灯源，以365nm波长光为激发光源，采用计时电流法，记录加入不同浓度的ATCl后的光电流响应值。
结果如图4-5所示：图4ATCl对乙酰胆碱酯酶的动力学曲线，横坐标是ATCl浓度，纵坐标为光电流值，随着ATCl浓度的增加，光电流响应也随之上升；图5是乙酰胆碱酯酶对底物的Lineweaver- Burke图，使用Michaelis-Menten方程的Lineweaver-Burk变换计算 Km值，固定化AchE的Michaelis-Menten常数为0.2804μM，表明了石墨烯量子点和N-F-TiO2Ns纳米管的良好生物相容性。
实施例三：
AchE/GQDs/N-F-TiO2Ns光电化学生物传感器检测氯胺酮对 AchE的抑制作用
以实施例1制备的AchE/GQDs/N-F-TiO2Ns光电化学生物传感器为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝为辅助电极，光电化学电池中工作电极的电压设定为+0.6V，在365nm波长下，在pH＝7.00 的磷酸盐缓冲溶液中，以500W氙灯为光源，采用计时电流法，根据 AchE/GQDs/N-F-TiO2Ns光电化学生物传感器中有氯胺酮时对ATCl 产生的光电流变化来探究氯胺酮对AchE的抑制情况。
实验共分为三组：
第一组：在无氯胺酮的条件下，AchE/GQDs/N-F-TiO2Ns为工作电极，加入不同浓度的ATCl，测定光暗电流响应；
第二组：AchE/GQDs/N-F-TiO2Ns体系中含有1fg/L氯胺酮浓度，加入不同浓度的ATCl，测定光暗电流响应；
第三组：AchE/GQDs/N-F-TiO2Ns体系中含有1pg/L氯胺酮浓度，加入不同浓度的ATCl，测定光暗电流响应。
将实施例三的结果统计分析后，在含不同质量浓度的氯胺酮溶液的反应体系中，改变ATCl的浓度，测定酶促反应速率，采用 Lineweaver-Burke双倒数作图，可以得到一组相交于第二象限的直线。如图6所示，横坐标为底物ATCl的浓度的倒数，纵坐标为光暗电流差的倒数，实验结果表明ATCL与光电流存在一定的关系，从而侧面反映氯胺酮对乙酰胆碱酯酶的作用，从图6可以直观的看到，双倒数曲线在第二象限产生交集，抑制类型属于非竞争性抑制剂，即酶可以与底物和抑制剂同时结合，形成三元复合物，不会进一步降解产物，从而抑制酶促反应。抑制剂结合位点-底物结合位点不同。这些发现表明，基于制备的AchE/GQDs/N-F-TiO2Ns生物传感器的这种光电化学系统可用于检测ATCl并研究AchE的可能抑制剂。
本发明未详述之处，均为本技术领域技术人员的公知技术。最后说明的是，以上实施例仅用于说明解释本发明的技术方案而非限制，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种AchE/GQDs/N-F-TiO2Ns光电化学生物传感器，其特征在于：包括GQDs/N-F-TiO2Ns和AchE，所述GQDs/N-F-TiO2Ns包括氮氟掺杂的二氧化钛纳米管阵列、修饰在所述二氧化钛纳米管阵列上的石墨烯量子点；所述AchE交联修饰在所述GQDs/N-F-TiO2Ns上。
2.根据权利要求1所述的AchE/GQDs/N-F-TiO2Ns光电化学生物传感器，其特征在于：光电流响应最高的波长为365nm。
3.根据权利要求1或2所述的AchE/GQDs/N-F-TiO2Ns光电化学生物传感器，其特征在于：所述AchE通过壳聚糖交联修饰在所述GQDs/N-F-TiO2Ns上。
4.一种AchE/GQDs/N-F-TiO2Ns光电化学生物传感器制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)用电化学阳极氧化法制备N-F-TiO2Ns电极
用不同粒径的砂纸对钛片进行打磨清洁，依次用丙酮、无水乙醇、去离子水对钛片进行冲洗，将钛片置于抛光液中进行抛光，抛光1min后取出，用丙酮和去离子水依次冲洗，氮气氛下干燥；
以石墨电极为阴极，钛片为阳极，外加电压20V，以含有0.1mol/L NH4F和1mol/L (NH4)2SO4的溶液为电解质，阳极化进行2小时，煅烧1小时后制得N-F-TiO2Ns电极；
2)用高温裂解法制备GQDs并修饰在N-F-TiO2Ns电极上
将N-F-TiO2Ns电极浸入含有GQDs的溶液中，浸泡10min，用二次蒸馏水冲洗，室温晾干，GQDs被修饰在N-F-TiO2Ns的修饰电极表面，制得GQDs/N-F-TiO2Ns电极；
3)用交联法构建AchE/GQDs/N-F-TiO2Ns光电化学生物传感器
将含有AchE和壳聚糖的混合溶液滴涂在GQDs/N-F-TiO2Ns修饰电极上，晾干后得到AchE/GQDs/N-F-TiO2Ns光电化学生物传感器。所述AchE和壳聚糖的混合溶液，AchE的浓度为500U/mL，壳聚糖浓度为5.0mg/mL。
5.根据权利要求4所述的AchE/GQDs/N-F-TiO2Ns光电化学生物传感器制备方法，其特征在于：所述步骤1)中的抛光液的成分及体积比为：HF：HNO3：H2O＝1：4：5。
6.根据权利要求4所述的AchE/GQDs/N-F-TiO2Ns光电化学生物传感器制备方法，其特征在于：所述步骤1)中的石墨电极的制备方法是：
将石墨碳棒裁剪成半径0.4cm、长度5.5cm，制备相同规格的石墨碳棒4支；分别用铝片包裹住裁剪好的碳棒一端做电极帽，采用电焊的方式用三节长度为2.5cm的铜制导线将电极帽依次焊接成非闭合的矩形，选择大小合适的试剂瓶盖，在其中心打半径为0.5cm的圆孔，以圆孔圆心作为边长2.5cm正方形对角线的交点，并分别以正方形四个角顶点为圆心打半径为1.0cm的4个圆孔；制备好的石墨电极和打好孔的瓶盖进行组装即可。
7.权利要求1所述的AchE/GQDs/N-F-TiO2Ns光电化学生物传感器在研究氯胺酮对乙酰胆碱酯酶的抑制作用中的应用。
8.根据权利要求7所述的AchE/GQDs/N-F-TiO2Ns光电化学生物传感器在研究氯胺酮对乙酰胆碱酯酶的抑制作用中的应用，其特征在于：所述应用方法为：在光电化学电池中，以所述AchE/GQDs/N-F-TiO2Ns光电化学生物传感器为工作电极，以饱和甘汞电极为参比电极，以铂丝为辅助电极，所述工作电极的电压设定为+0.6V，在浓度为1M、pH为6.0的磷酸盐缓冲溶液中，以氙灯为光源，波长为365nm条件下，采用计时电流法，记录光电流响应值，实现氯胺酮对乙酰胆碱酯酶的动力学研究。
9.权利要求1所述的AchE/GQDs/N-F-TiO2Ns光电化学生物传感器的应用，其特征在于：氯胺酮对乙酰胆碱酯酶有抑制作用，抑制类型非竞争性抑制剂。
10.权利要求1所述的AchE/GQDs/N-F-TiO2Ns光电化学生物传感器在检测乙酰胆碱及乙酰胆碱的衍生物中的应用。
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