CN107422006A - 一种AChE/GC‑HBAP/Pty/TNs光电化学酶传感器的制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种AChE/GC‑HBAP/Pty/TNs光电化学酶传感器的制备方法和应用，其特征在于包括：1)TNs电极的制备；2)单分子GC‑HBAP纳米颗粒的制备；3)AChE/GC‑HBAP/Pty/TNs复合体系的建立；通过交联剂固定乙酰胆碱酯酶制备了具有可见光活性的光电化学酶传感器,并应用于氯氮平对AChE活性影响的研究，发现氯氮平对AChE活性的影响具有底物依赖性，且在一定浓度范围内表现为激活效应。研究结果为进一步研究AChE活性及其在有AChE活性变化引起疾病的致病机理、药物开发、诊断以及用药剂量指导等方面提供了有意义的实验依据。

Description

一种AChE/GC-HBAP/Pty/TNs光电化学酶传感器的制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及电化学分析技术领域，具体的涉及一种AChE/GC-HBAP/Pty/TNs光电化学酶传感器的制备方法和应用。
背景技术
在人口老龄化以及老年疾病年轻化的趋势下，中枢神经损伤所致的神经退行性疾病发病率不断攀高。涉及医学、生命科学、化学等领域的研究工作者开展了对此类疾病致病机理、药物研发与筛选、治疗与预防等多方面的研究工作，其中对致病机理的研究成为核心内容。在此类疾病发病机理的研究中发现乙酰胆碱酯酶活性的异常变化与中枢神经系统损伤疾病密切相关，位于神经突触间隙中的乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，AChE,EC3.1.1.7)在胆碱能系统中的主要功能是将神经递质ACH快速水解，使神经冲动的传递终止从而起到保证胆碱能神经系统正常生理功能。当乙酰胆碱酯酶活性被抑制时，其对神经递质ACH的水解效能减弱，导致ACH在胆碱能神经突触的大量累积，从而引起ACH与DA之间的平衡被破坏。因此，乙酰胆碱酯酶的活性变化是影响胆碱能神经系统中信号传导的关键因素。
临床研究发现，PD和AD患者老年病人在患病后期往往伴随精神症状出现，25％的早期AD患者和50％以上的中晚期AD患者有精神行为症状，20％以上的PD患者有幻觉症状。临床中采用非典型性抗精神病药物对AD和PD等所伴有的老年人精神症状均能有效治疗。氯氮平(Clozapine)系二苯二氮类非典型抗精神病药，自1985年Seholz等首次使用氯氮平治愈PD所致精神障碍以来，陆续有治疗成功的案例报道。美国神经病学会认为氯氮平是治疗帕金森氏病药物性精神病最有效的药物，在控制AD精神症状上也有明显的疗效。氯氮平治疗PD和AD的剂量范围各家报道不一，主要为两类，一类是小剂量(12～20mg/日)长期服用治疗；一类是大剂量(60～65mg/日)短期干预，症状缓解即停药或减量。尽管剂量不一，但均认为对精神症状疗效好，对震颤麻痹症状尤其是震颤和肌张力高亦有效。目前，氯氮平治疗最有效和可耐受的剂量范围及最佳疗程，尚无统一标准。
有报道认为氯氮平作为精神分裂症患者常用的药物，它导致血清胆碱脂酶活力下降，即氯氮平具有抗胆碱脂酶活力的作用，从而提高乙酰胆碱的浓度使DA与ACH在较高水平建立新的平衡。同时亦有报道认为氯氮平能够改善患者的阴性症状以及认知功能障碍，但对于额叶中AChE活性的影响并不突出。因此，氯氮平对乙酰胆碱酯酶活性影响的机制尚不明确，有必要进行深入的研究，为神经退行性疾病尤其是AD并发精神行为症的致病机理、检测防御、药物筛选与开发、用药剂量等方面提供实验依据。
目前，乙酰胆碱酯酶活性检测最常用的方法有以下几种：测压法、分光光度法、荧光法以及电化学分析法等。现代生命科学、医学的飞速发展要求分析化学能够提供更多的快速、高灵敏的方法以适应研究的需要。光电化学传感器利用了半导体纳米材料在光电化学过程中对电流信号的放大作用，因而具有较高的灵敏度，引起了研究工作者的广泛关注，已成为当今传感器的研究热点之一。我们在研究工作中利用单分子聚合物纳米颗粒-二氧化钛纳米管阵列构建了高灵敏的光电化学传感器，并进行了氯氮平对乙酰胆碱酯酶活性影响的研究。
超支化聚合物是一类高度分支化且具有准球形结构的人工大分子化合物，其结构特点是含有丰富的内部空穴，且在末端带有大量活性功能团，因而表现出溶解度高，易于进一步进行功能化修饰的化学性能。基于其独特的分子结构与化学性质，可将超支化聚合物应用于对生物活性物质的固定化。
发明内容
本发明的目的在于，针对现有技术中存在的上述问题，提供一种AChE/GC-HBAP/Pty/TNs光电化学酶传感器的制备方法和应用，首先制备了GC-HBAP单分子纳米颗粒，将其修饰在功能化的TNs表面，通过交联剂固定乙酰胆碱酯酶制备了具有可见光活性的光电化学酶传感器，并应用于氯氮平对乙酰胆碱酯酶活性影响的研究。
为实现上述目的，达到上述效果，本发明是通过以下技术方案实现：
一种AChE/GC-HBAP/Pty/TNs光电化学酶传感器的制备方法，其特征在于包括：
1)TNs电极的制备
将金属钛片打磨至镜面，依次浸在丙酮、乙醇、蒸馏水中超声十分钟，再浸在氢氟酸和硝酸的混合液中进行化学抛光分钟，取出立刻用丙酮和蒸馏水依次冲洗，在室温下晾干，电极在自制的柱状电解池里中制备钛片为阴极，四支呈对称分布的石墨电极为阳极；
所述氢氟酸和硝酸的混合液为VHF：VHNO3：VH2O＝1:4:5；
2)单分子GC-HBAP纳米颗粒的制备
a合成金胶体溶液(GC)：参考Duff法合成GC；
b单分子聚合物纳米颗粒的合成；
c单分子纳米颗粒GC-HBAP的合成；
3)AChE/GC-HBAP/Pty/TNs复合体系的建立
采用循环伏安法在TNs表面电聚合酪胺，三电极系统：工作电极为所制备的TNs电极，辅助电极为铂丝电极，参比电极为饱和甘汞电极(SCE)；以含有0.3mol酪胺和0.04gNaOH(0.1M)的10mL甲醇溶液为电解液，进行电聚合酪胺，电聚合电位为0～1.5V，扫速为50mV/s，扫描15圈，取出电极，用蒸馏水冲洗干净，晾干，得到Pty/TNs修饰电极，在电极表面两侧各滴涂10μL GC-HBAP溶液，于4℃冰箱中晾干，制得GC-HBAP/Pty/TNs修饰电极。最后取10μL酶溶液(1.0mg/mL AChE，5.0mg/mL壳聚糖)滴涂于电极一侧，4℃晾干，制得AChE/GC-HBAP/Pty/TNs光电化学传感器。
优选的，所述步骤1)TNs电极的制备，其特征在于：电解液为：1M(NH4)2SO4中含有0.1M NH4F和1/12M H2C2O4，向电解池回路输送20V外加电压进行2小时的阳极氧化。阳极氧化结束以后，立即取出钛片并用二次蒸馏水冲净，并用氮气N2吹干，将干燥好的钛片转入马弗炉中，在500℃氧气氛保护下，退火1小时，升温和冷却速率均为2.5℃/min。
优选的，所述步骤2)中单分子聚合物纳米颗粒的合成，其特征在于：每次取摩尔比为1：2.5的200mg HBAP(200mg)与PTMP(12.2mg)以0.8mg/mL的THF溶解定容到250mL，混合均匀后投入催化剂1-十二胺(10wt％，1mg)，室温搅拌2小时，取反应真空条件下以乙酸乙酯为沉淀剂进行沉淀，沉淀完全后至于棕色真空干燥器中，室温下干燥24小时以上。
优选的，所述步骤2)单分子纳米颗粒GC-HBAP的合成，其特征在于：将GC溶液和单分子聚合物纳米颗粒分别用水和丙酮稀释：20mL丙酮溶液中含有1mg单分子聚合物；GC溶液按体积比1：15稀释，氮气保护条件下，快速搅拌稀释后的GC溶液，将聚合物病容溶液逐滴加入，加完后的混合溶液室温下过夜反应，试液离心取沉淀用三蒸水洗涤，反复操作3-4次，最后留用沉淀：单分子GC-HBAP纳米颗粒。
一种AChE/GC-HBAP/Pty/TNs光电化学酶传感器的应用，其特征在于：AChE/GC-HBAP/Pty/TNs光电化学酶传感器应用于氯氮平对AChE活性影响的研究，发现氯氮平对AChE活性的影响具有底物依赖性，且在一定浓度范围内表现为激活效应。
本发明的有益效果是：本发明AChE/GC-HBAP/Pty/TNs光电化学酶传感器，通过交联剂固定乙酰胆碱酯酶制备了具有可见光活性的光电化学酶传感器,并应用于氯氮平对AChE活性影响的研究，发现氯氮平对AChE活性的影响具有底物依赖性，且在一定浓度范围内表现为激活效应。研究结果为进一步研究AChE活性及其在有AChE活性变化引起疾病的致病机理、药物开发、诊断以及用药剂量指导等方面提供了有意义的实验依据。
附图说明
图1为本发明所述AChE/GC-HBAP/Pty/TNs光电化学酶传感器的制备流程图；
图2为本发明实施例中AChE/GC-HBAP/Pty/TNs光电化学传感器制备中电极表面形貌的SEM图；(A为TNs，B为Pty/TNs,C为GC-HBAP/Pty/TNs,D为AChE/GC-HBAP/Pty/TNs)
图3为本发明实施例中AChE/GC-HBAP/Pty/TNs传感器制备过程的UV-Vis漫反射光谱图。(曲线a、b、c和d分标表示：TNs、Pty/TNs、GC-HBAP/Pty/TNs和AChE/GC-HBAP/Pty/TNs修饰电极的吸收线)
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例
一种AChE/GC-HBAP/Pty/TNs光电化学酶传感器的制备方法，其特征在于包括：
1)TNs电极的制备
将金属钛片打磨至镜面，依次浸在丙酮、乙醇、蒸馏水中超声十分钟，再浸在氢氟酸和硝酸的混合液中进行化学抛光分钟，取出立刻用丙酮和蒸馏水依次冲洗，在室温下晾干，电极在自制的柱状电解池里中制备钛片为阴极，四支呈对称分布的石墨电极为阳极；
所述氢氟酸和硝酸的混合液为VHF：VHNO3：VH2O＝1:4:5；
所述电解液为：1M(NH4)2SO4中含有0.1M NH4F和1/12MH2C2O4，向电解池回路输送20V外加电压进行2小时的阳极氧化。阳极氧化结束以后，立即取出钛片并用二次蒸馏水冲净，并用氮气N2吹干，将干燥好的钛片转入马弗炉中，在500℃氧气氛保护下，退火1小时，升温和冷却速率均为2.5℃/min。
2)单分子GC-HBAP纳米颗粒的制备
a合成金胶体溶液(GC)：参考Duff法合成GC；
b单分子聚合物纳米颗粒的合成
每次取摩尔比为1：2.5的200mg HBAP(200mg)与PTMP(12.2mg)以0.8mg/mL的THF溶解定容到250mL，混合均匀后投入催化剂1-十二胺(10wt％，1mg)，室温搅拌2小时，取反应真空条件下以乙酸乙酯为沉淀剂进行沉淀，沉淀完全后至于棕色真空干燥器中，室温下干燥24小时以上；
c单分子纳米颗粒GC-HBAP的合成
将GC溶液和单分子聚合物纳米颗粒分别用水和丙酮稀释：20mL丙酮溶液中含有1mg单分子聚合物；GC溶液按体积比1：15稀释，氮气保护条件下，快速搅拌稀释后的GC溶液，将聚合物病容溶液逐滴加入，加完后的混合溶液室温下过夜反应，试液离心取沉淀用三蒸水洗涤，反复操作3-4次，最后留用沉淀：单分子GC-HBAP纳米颗粒。
3)AChE/GC-HBAP/Pty/TNs复合体系的建立
采用循环伏安法在TNs表面电聚合酪胺，三电极系统：工作电极为所制备的TNs电极，辅助电极为铂丝电极，参比电极为饱和甘汞电极(SCE)；以含有0.3mol酪胺和0.04gNaOH(0.1M)的10mL甲醇溶液为电解液，进行电聚合酪胺，电聚合电位为0～1.5V，扫速为50mV/s，扫描15圈，取出电极，用蒸馏水冲洗干净，晾干，得到Pty/TNs修饰电极，在电极表面两侧各滴涂10μL GC-HBAP溶液，于4℃冰箱中晾干，制得GC-HBAP/Pty/TNs修饰电极。最后取10μL酶溶液(1.0mg/mL AChE，5.0mg/mL壳聚糖)滴涂于电极一侧，4℃晾干，制得AChE/GC-HBAP/Pty/TNs光电化学传感器。
光电传感器制备过程的表征
SEM表征传感器制备过程表面形貌变化
传感器构建过程中其表面形态的变化可通过SEM进行表征。如图2：光电化学传感器制备中电极表面形貌的SEM图；阳极氧化制备得到均有序的TNs(如图2A所示)，电聚合酪胺后，其SEM图中出现了云状结构(如图2B所示)，由于膜层较薄，TNs的管状结构隐约可见。修饰GC-HBAP后，膜层厚度增加，使得TNs管状结构的清晰度小于修饰前，图中的光亮点有可能是GC-HBAP中的GC(如图2C所示)。通过壳聚糖将AChE固定在电极表面后的表面形貌如图2D所示，由于膜层的阻挡TNs管状结构消失。上述现象说明Pty、GC-HBAP和AChE依次修饰在TNs表面，构建了AChE/GC-HBAP/Pty/TNs传感器。
传感器制备过程的紫外-可见漫反射光谱表征
通过紫外-可见漫反射光谱研究了传感器制备过程中电极表面的谱学性质，结果如图3所示。从图中可以看出TNs修饰电极在波长约为275nm和405nm处有两个强峰，说明该修饰电极不仅能够吸收紫外光，还能够吸收可见光(曲线a)。电聚合修饰酪胺后，Pty/TNs修饰电极的反射率减小，且可见光区的吸收峰发生红移(如曲线b所示)。说明聚酪胺对TNs的敏化促进了复合纳米半导体材料对可见光的吸收。进一步修饰单分子聚合物纳米材料后GC-HBAP/Pty/TNs的反射率进一步减小且可见光区的吸收峰略有红移，说明单分子聚合物GC-HBAP有助于复合半导体纳米材料对可见光的吸收。此外也可能是由于GC-HBAP中的AuNPs表面等离子共振增加了对可见光的利用率，同时也说明GC-HBAP成功修饰在电极表面。将AChE修饰到电极表面后，由于酶与壳聚糖层对光产生阻挡和散射，使复合材料对光的吸收有所下降，而反射率增大(如曲线d所示)，说明酶分子成功的修饰在电极表面。上述现象说明所构建的GC-HBAP/Pty/TNs半导体复合纳米材料具有可见光活性，实验中以紫外截止片滤去紫外光后辐照电极仍能实现对半导体复合纳米材料(GC-HBAP/Pty/TNs)的激发，产生光生电子/空穴对。
氯氮平对AChE活性抑制作用的研究
研究0.5mg/L、1mg/L两个水平的氯氮平作用下对AChE活性的影响，由于血液占人体体重的7.5-8％，密度在1.05-1.06g/mL之间，60kg体重的成人体内血液量约为4.5L，以上氯氮平浓度相当于临床治疗中用药剂量分别为：6.75mg/d(day)、13.5mg/d。
为方便讨论光电检测中AChE活性的变化，定义相对活性IR：
IR＝IATCh/I0×100％
公式中IATCh、I0分别表示有、无氯氮平作用下加入一定浓度底物ATCh时光电流的增量。
表1不同氯氮平浓度水平下AChE相对活性变化
通过体外实验考察了氯氮平浓度为0.5mg/L、1mg/L两个水平下对AChE活性的影响，研究发现，氯氮平对AChE活性的影响体现了底物浓度依赖的特征，如表1所示，当底物浓度较低时(0.05mM)IR<100％，说明其对AChE活性的影响表现为抑制。底物浓度增大10倍后，两个氯氮平浓度水平下的相对活性均大于100％，表现为激活。随着浓度的增大，相对活性又开始减小。此外还观察到，当同一支传感器在进行氯氮平对酶损伤实验过程中会出现活性异常增大，随后骤然减小的情况。推测，有可能是AChE在反复激活的机制下出现构型改变导致酶失活。这有可能是临床中氯氮平用于辅助治疗AD和PD患者晚期并发精神症状中对AD和PD症状的机制之一。实验结果一定程度上解释了临床中采用短时高剂量治疗法和长时低计量法进行辅助治疗的原因。此外推测亦可能是氯氮平的代谢产物对AChE活性产生抑制所致。研究结果为进一步研究AChE活性及其在有AChE活性变化引起疾病的致病机理、药物开发、诊断以及用药剂量指导等方面提供了有意义的实验依据。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (6)

1.一种AChE/GC-HBAP/Pty/TNs光电化学酶传感器的制备方法，其特征在于包括：
1)TNs电极的制备
将金属钛片打磨至镜面，依次浸在丙酮、乙醇、蒸馏水中超声十分钟，再浸在氢氟酸和硝酸的混合液中进行化学抛光分钟，取出立刻用丙酮和蒸馏水依次冲洗，在室温下晾干，电极在自制的柱状电解池里中制备钛片为阴极，四支呈对称分布的石墨电极为阳极；
2)单分子GC-HBAP纳米颗粒的制备
a合成金胶体溶液(GC)：参考Duff法合成GC；
b单分子聚合物纳米颗粒的合成；
c单分子纳米颗粒GC-HBAP的合成；
3)AChE/GC-HBAP/Pty/TNs复合体系的建立
采用循环伏安法在TNs表面电聚合酪胺，三电极系统：工作电极为所制备的TNs电极，辅助电极为铂丝电极，参比电极为饱和甘汞电极(SCE)；以含有0.3mol酪胺和0.04g NaOH(0.1M)的10mL甲醇溶液为电解液，进行电聚合酪胺，电聚合电位为0～1.5V，扫速为50mV/s，扫描15圈，取出电极，用蒸馏水冲洗干净，晾干，得到Pty/TNs修饰电极，在电极表面两侧各滴涂10μL GC-HBAP溶液，于4℃冰箱中晾干，制得GC-HBAP/Pty/TNs修饰电极，最后取10μL酶溶液(1.0mg/mL AChE，5.0mg/mL壳聚糖)滴涂于电极一侧，4℃晾干，制得AChE/GC-HBAP/Pty/TNs光电化学传感器。
2.如权利要求1所述的AChE/GC-HBAP/Pty/TNs光电化学酶传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤1)TNs电极的制备，氢氟酸和硝酸的混合液为VHF：VHNO3：VH2O＝1:4:5。
3.如权利要求1所述的AChE/GC-HBAP/Pty/TNs光电化学酶传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤1)TNs电极的制备，电解液为：1M(NH4)2SO4中含有0.1M NH4F和1/12M H2C2O4，向电解池回路输送20V外加电压进行2小时的阳极氧化，阳极氧化结束以后，立即取出钛片并用二次蒸馏水冲净，并用氮气N2吹干，将干燥好的钛片转入马弗炉中，在500℃氧气氛保护下，退火1小时，升温和冷却速率均为2.5℃/min。
4.如权利要求1所述的AChE/GC-HBAP/Pty/TNs光电化学酶传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中单分子聚合物纳米颗粒的合成，每次取摩尔比为1：2.5的200mg HBAP(200mg)与PTMP(12.2mg)以0.8mg/mL的THF溶解定容到250mL，混合均匀后投入催化剂1-十二胺(10wt％，1mg)，室温搅拌2小时，取反应真空条件下以乙酸乙酯为沉淀剂进行沉淀，沉淀完全后至于棕色真空干燥器中，室温下干燥24小时以上。
5.如权利要求1所述的AChE/GC-HBAP/Pty/TNs光电化学酶传感器的制备方法，其特征在于：所述步骤2)单分子纳米颗粒GC-HBAP的合成，将GC溶液和单分子聚合物纳米颗粒分别用水和丙酮稀释：20mL丙酮溶液中含有1mg单分子聚合物；GC溶液按体积比1：15稀释，氮气保护条件下，快速搅拌稀释后的GC溶液，将聚合物病容溶液逐滴加入，加完后的混合溶液室温下过夜反应，试液离心取沉淀用三蒸水洗涤，反复操作3-4次，最后留用沉淀：单分子GC-HBAP纳米颗粒。
6.如权利要求1-5所制备的AChE/GC-HBAP/Pty/TNs光电化学酶传感器的应用，其特征在于：AChE/GC-HBAP/Pty/TNs光电化学酶传感器应用于氯氮平对AChE活性影响的研究，发现氯氮平对AChE活性的影响具有底物依赖性，且在一定浓度范围内表现为激活效应。
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