CN103149259A - AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器，包括Ag-N/F/TiO2NTs和乙酰胆碱酯酶；所述Ag-N/F/TiO2NTs包括氮氟掺杂的二氧化钛纳米管阵列、以及修饰在所述二氧化钛纳米管阵列上的银纳米粒子；所述乙酰胆碱酯酶以壳聚糖为交联剂修饰在所述Ag-N/F/TiO2NTs上。本发明还提出AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器的制备方法及其应用。本发明基于可见光激发可用于检测(R)-Sal和(R)-NMSal对AChE活性的抑制，为AChE在神经退行性疾病的致病机理、药物筛选以及酶生物传感技术等方面提供重要依据。
Description
技术领域
本发明属于电化学分析技术领域，涉及一种光电化学生物传感器的制备方法及其应用，特别涉及一种利用半导体复合纳米材料构建光电化学生物传感器及其制备方法和应用。
背景技术
乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase，AChE)是一种在胆碱能系统内神经信号传导过程中起着关键作用的丝氨酸水解酶，它能够将胆碱能神经递质乙酰胆碱(Acetylcholine，ACh)催化水解为胆碱(Choline，Ch)和乙酸，使ACh失活，从而中止神经冲动，保证胆碱能系统的止常功能。若AChE的活性受到抑制，会发生ACh过剩而集聚的现象，从而导致胆碱能神经的过度兴奋，引发多巴胺能和胆碱能系统平衡的破坏，进而引发中枢神经系统损伤疾病。因此，探讨乙酰胆碱酯酶的活性变化有助于进一步探究神经退行性疾病如帕金森症的致病机理。
目前，对帕金森氏病的发病机理的假说包括遗传学说、环境学说等。1983年Langston等发现1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)能引发帕金森氏病综合征，自此人们开始广泛关注神经毒素对帕金森氏病神经元的损伤机制。近年来，存在于生物体内的一类与MPTP结构十分类似的生物碱，内源性神经毒素(R)-salsolinol[(R)-Sal]和N-methyl-(R)-salsolinol[(R)-NMSal]受到了人们的高度关注。
有研究显示，在帕金森氏病患者的尿样及脑脊液中(R)-Sal和(R)-NMSal的含量明显高于止常人；另外，向大鼠脑纹状体内注射(R)-Sal和(R)-NMSal会引发大鼠脑神经细胞、黑质区多巴胺能神经元的选择性死亡，并产生与帕金森氏病相似的行为、生化、组织病理方面的异常。随着对帕金森氏病病理学研究的日益深入，越来越多证据表明内源性神经毒素是引发帕金森氏病的关键因素之一。本课题组之前的研究发现，内源性神经毒素不仅仅对多巴胺能神经元造成了损伤，对胆碱能系统也造成了一定的影响。因此，研究(R)-Sal和(R)-NMSal对AChE活性的影响，对深入研究内源性神经毒素对帕金森氏病的致病机理具有重要意义。
目前，乙酰胆碱酯酶活性检测最常用的方法主要包括：测压法、分光光度法、荧光法以及电化学分析法。这些方法都是基于乙酰胆碱酯酶能够水解不同的底物转化为一个可测信号的过程上面，产生的信号包括气压、吸光度、荧光、pH值以及电位或者电流等。这些方法虽然在乙酰胆碱酯酶的活性检测中发挥了巨大的作用，但是存在着灵敏度低、检测范窄等问题， 随着生物技术和生命科学的发展，传统方法在一定程度上已经不能满足现代检测的需要。
发明内容
本发明为了满足生物技术和生命科学的发展，克服现有技术存在的上述缺陷，提出了一种利用半导体复合纳米材料建立基于可见光激发的光电化学生物传感器，即，本发明提出了一种AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器及其制备方法，以及应用于乙酰胆碱酯酶活性检测的研究。
本发明提出了一种AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器，所述光电化学生物传感器是一种基于可见光激发的光电化学生物传感器，其包括Ag-N/F/TiO2NTs和乙酰胆碱酯酶(AChE)，其中，所述Ag-N/F/TiO2NTs包括氮氟掺杂的二氧化钛纳米管阵列、以及修饰在所述二氧化钛纳米管阵列上的银纳米粒子(AgNPs)；所述乙酰胆碱酯酶以壳聚糖为交联剂修饰在所述Ag-N/F/TiO2NTs上。
本发明AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器能够在可见光激发下产生光电流，以硫代乙酰胆碱(ATCh)作为底物，经AChE催化水解所得的硫代胆碱能够捕获光生空穴抑制光生空穴与光生电子的复合，从而提高了光电流。当修饰的AChE的含量恒定的时候，光电流的增加值与ATCh的含量成止比；当底物浓度恒定的时候，光电流的增加值与AChE活性的大小成止比。本发明传感器利用这一特性可对AChE酶活性损伤进行研究。本发明传感器与ATCh在5×10-8～1×10-4mol/L范围内呈良好线性，R2为99.42％，检测限为2×10-8mol/L。本发明传感器米氏常数Km＝5.861μM，比已报道文献小，表明本发明AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器对AChE有良好的生物兼容性。
本发明还提出了一种AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器的制备方法，通过电化学阳极氧化法在金属钛片上制备得到高序排列的氮氟同时掺杂的二氧化钛纳米管阵列(N/F/TiO2NTs)；通过微波辅助加热多元醇的方法制备银纳米粒子(AgNPs)并将其修饰到前述的二氧化钛纳米管阵列(N/F/TiO2NTs)上，形成Ag-N/F/TiO2NTs；然后，以该Ag-N/F/TiO2NTs作为电极基质材料，以壳聚糖为交联剂，将乙酰胆碱酯酶(AChE)修饰在Ag-N/F/TiO2NTs上，从而制备得到所述AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器。
本发明制备方法包括如下步骤：
(一)用电化学阳极氧化法制备N/F/TiO2NTs电极：
钛片经打磨光洁，依次用丙酮、乙二醇、去离子水超声清洗，以氢氟酸和硝酸的混合液浸润后用丙酮和去离子水冲洗，氮气分下干燥，然后，以石墨电极为阴极，外加电压20V，以含有0.1M NH4F的0.1M(NH4)2SO4溶液为电解质，在电化学反应器中反应，经煅烧，制得高 序排列的氮氟同时掺杂的N/F/TiO2NTs电极；
(二)用微波辅助加热法制备Ag-N/F/TiO2NTs电极：
将N/F/TiO2NTs电极浸入含有AgNO3和KOH的乙二醇溶液中，微波加热，冷却后取出电极，用丙酮冲洗，室温晾干，Ag纳米粒子被修饰在N/F/TiO2NTs修饰电极表面，制得Ag-N/F/TiO2NTs电极；
(三)用交联法构建AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器：
将含有AChE和壳聚糖的酶溶液滴涂在Ag-N/F/TiO2NTs修饰电极，晾干得到所述AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器。
本发明制备方法中，同时应用氮氟掺杂和贵金属沉积的方法对TiO2进行改性修饰，氮氟掺杂有利于减小TiO2禁带宽度，能够在可见光激发下产生光电流；微波辅助加热方法制备并将Ag纳米粒子修饰在电极表面，促进了光生电荷与空穴的分离，提高了光电流。
本发明制备方法中，采用阳极氧化技术制备高序排列的二氧化钛纳米管阵列(TiO2NTs)同时一步掺杂氮氟元素，掺杂氮氟元素的TiO2NTs(N/F/TiO2NTs)禁带宽度减小，对410nm(可见光区)以下光有光电活性。通过微波辐照加热多元醇法在碱性条件下还原制备得到粒径均匀的银纳米粒了(AgNPs)，且在微波的扰动作用下沉积在TiO2NTs空穴和表面。然后通过交联法来固定乙酰胆碱酯酶，制备成AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器。
本发明中，AgNPs的修饰提高了电极材料的光电转换效率，表现为修饰AgNP后同等测定条件下，光电流的增加了一倍，有利于提高传感器对ATCh检测的灵敏度。
本发明还提出一种用AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器检测硫代乙酰胆碱的方法，即，在光电化学电池中，以所述AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器为工作电极，以银氯化银电极为参比电极，以铂丝为辅助电极，所述工作电极的电压设定为+0.6V，在0.1MpH7.0磷酸盐缓冲溶液中，以氙灯为光源，采用计时电流法，记录光电流响应值，实现对硫代乙酰胆碱的检测。
本发明检测方法中，以所述AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器为工作电极，采用计时电流法测量流过工作电极的电流实现对AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器光电化学性质的研究。
本发明检测方法中，在以所述AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学传感器为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝为辅助电极的光电化学电池中实现。具体步骤包括：
确定硫代乙酰胆碱与AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学传感器的光电流的依从关系：
以AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝为辅助电极，光电化学电池中工作电极的电压设定为+0.6V，在pH7.4的磷酸盐缓冲溶 液中，以紫外灯为光源，采用计时电流法，根据光电化学电池中每次增加一定浓度的硫代乙酰胆碱而产生的光电流变化做出光电流-硫代乙酰胆碱浓度曲线：将硫代乙酰胆碱浓度及其对应的工作电极响应的光电流值所对应的坐标点描绘在直角坐标纸上，直角坐标的两个坐标分别为AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器的响应光电流的电流值和硫代乙酰胆碱浓度，依次逐点连接直角坐标纸上的所有坐标点，得到响应光电流-硫代乙酰胆碱浓度曲线，该曲线为直线，确定硫代乙酰胆碱浓度与AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器的响应光电流的依从关系为线性关系。
本发明制备方制备得到的光电化学传感器与ATCh在5×10-8～1×10-4mol/L范围内呈良好线性，R2为99.42％，检测限为2×10-8mol/L。所述光电化学传感器米氏常数Km＝5.861μM，比已报道文献小，表明本发明对AChE有良好的生物兼容性。
本发明还提出利用半导体复合纳米材料建立的光电分析方法考察内源性神经毒素(R)-NMSal和(R)-Sal对AChE的抑制情况。即，本发明还提出AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器应用于检测内源性神经毒素(R)-Sal对硫代乙酰胆碱的抑制。本发明还提出AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器应用于检测内源性神经毒素(R)-NMSal对硫代乙酰胆碱的抑制。
本发明中，在光电化学电池中，以所述AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器为工作电极，以饱和甘汞电极为参比电极，以铂丝为辅助电极，采用计时电流法测量流过工作电极的光电流来分别检测(R)-NMSal和(R)-Sal在加入AChE/Ag-N/F/TiO2NTs体系前后的光电流值的变化，从而实现对(R)-NMSal和(R)-Sal对AChE活性抑制作用的光电化学研究。具体步骤包括：
考察内源性神经毒素(R)-Sal和(R)-NMSal对AChE的抑制情况：
以AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝为辅助电极，光电化学电池中工作电极的电压设定为+0.6V，在pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中，以紫外灯为光源，采用计时电流法，根据AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器中有无内源性神经毒素((R)-Sal或(R)-NMSal时对硫代乙酰胆碱产生的光电流变化来考察内源性神经毒素(R)-Sal和(R)-NMSal对AChE的抑制情况。
第一步：在无(R)-Sal或(R)-NMSal的AChE/Ag-N/F/TiO2NTs体系中，加入0.10mM硫代乙酰胆碱，测定光电流值。
第二步：将(R)-Sal或(R)-NMSal分别加入加入AChE/Ag-N/F/TiO2NTs体系中后，加入0.10mM硫代乙酰胆碱，测定光电流值。
进一步地，本发明在上述步骤之后，可以将AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器 重新置于一个无(R)-Sal或(R)-NMSal存在的环境中，加入0.10mM硫代乙酰胆碱，测定光电流值。可见，本发明AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器具有很好的稳定性，反复多次使用仍保留良好的检测灵敏性。同时，实验结果表明内源性神经毒素(R)-Sal和(R)-NMSal对AChE活性的抑制作用均是可逆性的。
本发明还提出AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器应用于检测石杉碱甲对AChE活性的抑制，即AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器可应用于石杉碱甲(HupA)对AChE活性抑制的动力学研究。AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器的检测结果显示，HupA对AChE的抑制作用与内源性神经毒素(R)-Sal和(R)-NMSal对AChE的抑制作用相似，表现为可逆性混合型。表明本发明光电化学生物传感器可应用于酶的活性研究。
本发明首次提出应用光电分析方法研究两种内源性神经毒素(R)-Sal和(R)-NMSal对AChE的活性损伤。研究结果表明(R)-Sal和(R)-NMSal对AChE呈混合可逆抑制作用，并测定了(R)-Sal和(R)-NMSal对AChE的抑制常数，分别为0.35μM，0.12μM。通过对HupA对照试验表明本发明光电化学传感器应用于研究内源性神经毒素对AChE活性所伤是可行的。
本发明采用微波辅助加热法将Ag纳米颗粒嵌入高序排列的氮氟掺杂二氧化钛纳米管阵列(N/F/TiO2NTs)，然后通过交联法来固定乙酰胆碱酯酶，制备成AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器，在可见光激发下放大电流信号，并应用于两种内源性神经毒素(R)-Sal和(R)-NMSal对AChE活性抑制作用的研究。本发明利用电化学阳极氧化技术制备了高序排列的氮氟同时掺杂二氧化钛纳米管阵列(N/F/TiO2NTs)，通过微波辐照多元醇还原法制备并沉积在N/F/TiO2NTs中，以所得的Ag-N/F/TiO2NTs为电极基质材料，利用交联法将乙酰胆碱酯酶(AChE)固定到纳米管上，制得AChE-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器，并将其应用于内源性神经毒素1(R)-甲基-6，7-二羟基-1，2，3，4-四氢异喹啉([(R)-Sal])和1(R)，2-二甲基-6，7-二羟基-1，2，3，4-四氢异喹啉[(R)-NMSal]对对乙酰胆碱酯酶(AChE)活性抑制的作用机理研究。本发明基于可见光激发AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器用于(R)-Sal和(R)-NMSal对AChE活性抑制作用的研究是有效可行的，这为AChE在神经退行性疾病的致病机理、药物筛选以及酶生物传感技术等方面提供重要的依据。
附图说明
图1为实施例1中N/F/TiO2NTs在修饰前后的SEM图。其中，图1a所示为用电化学阳极氧化法在纯的钛片上制得的高度有序的N/FTiO2NTs；图1b所示为沉积了Ag纳米颗粒(AgNPs)后的Ag-N/FTiO2NTs；图1c所示是修饰了AChE后的Ag-N/FTiO2NTs的SEM图，即AChE/Ag-N/F/TiO2NTs的SEM图。
图2为实施例2中修饰Ag纳米粒子前后的光电流图。
图3为实施例2中响应光电流对不同浓度的硫代乙酰胆碱的光电流图。
图4为实施例3中AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器在有无内源性神经毒素(R)-Sal或(R)-NMSal的体系中对硫代乙酰胆碱的光电流响应图。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
具体地，本发明制备方法包括如下操作步骤：
第一步：N/F/TiO2NTs电极的制备
利用电化学阳极氧化技术制备N/F/TiO2NTs电极。在阳极氧化之前，钛片首先用不同的砂纸打磨，接着把它浸在蒸馏水中超声十分钟，然后把干净的钛片浸在氢氟酸和硝酸的混合液中1分钟(混合的体积比例HF∶HNO3∶H2O＝1∶4∶5)，之后钛片用丙酮和蒸馏水冲洗，在室温下晾干。N/F/TiO2NTs电极是在柱状的电化学反应器里制备(半径为30mm，高为70mm)。在整个过程中含有0.1M NH4F的1M(NH4)2SO4溶液用作电解质，铂电极用作阴极，外加电压为20V。氧化以后的钛片在500℃干燥的有氧环境里煅烧1小时。加热和冷却速率保持在2.5℃min-1，制得TiO2NTs电极，待用；
第二步：Ag-N/F/TiO2NTs电极的制备
采用微波辅助加热法将Ag纳米颗粒嵌入N/F/TiO2NTs中。将N/F/TiO2NTs电极浸入30ml含有2.0ml0.05M的AgNO3和1.0ml0.4M的KOH的乙二醇溶液中，在微波炉内(500W)微波加热50s，冷却后，取出电极，用丙酮冲洗，室温晾干，Ag纳米粒子即被修饰在N/F/TiO2NTs修饰电极表面。即得Ag-N/F/TiO2NTs修饰电极。
第三步：AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器的建立
利用交联法将AChE固定在修饰了Ag-N/F/TiO2NTs修饰电极上。将制得的酶溶液(1.0mgmL-1AChE，1.2mg mL-1BSA，5.0mg/mL壳聚糖)滴涂到Ag-N/F/TiO2NTs修饰电极的一侧，晾干，得到AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器。
实施例1制备AChE/Ag-N/F/TiO2NTs和AChE/N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器
第一步：利用电化学阳极氧化技术制备N/F/TiO2NTs电极。在阳极氧化之前，钛片首先用不同的砂纸打磨，接着把它浸在蒸馏水中超声十分钟，依次用丙酮、乙二醇、去离子水超 声清洗，然后把干净的钛片浸在氢氟酸和硝酸的混合液中1分钟，混合液的体积比例为HF∶HNO3∶H2O＝1∶4∶5，之后钛片用丙酮和蒸馏水冲洗，在室温下晾干。
TiO2NTs电极是在柱状的电化学反应器(半径为30mm，高为70mm)里制备。在整个制备过程中以含有0.1M NH4F的1M(NH4)2SO4溶液用作电解质，铂电极用作阴极，外加电压为20V。氧化以后的钛片在500℃干燥的有氧环境里煅烧1小时。加热和冷却速率保持在2.5℃min-1，制得N/FTiO2NTs电极，待用。
本发明中，电解液(含有0.1M NH4F的1M(NH4)2SO4溶液)可通过阳极氧化技术实现对二氧化钛纳米管的氮氟同时掺杂，对比了不同阳极氧化时间下所得电极的光电流强度，发现氧化时间为2小时时电极的光生电流强度最大。
第二步：采用微波辅助加热法将Ag纳米颗粒嵌入N/F/TiO2NTs中。将N/F/TiO2NTs电极浸入30ml含有2.0ml0.05M的AgNO3和1.0ml0.4M的KOH的乙二醇溶液中，在微波炉内(500W)微波加热50s，冷却后，取出电极，用丙酮冲洗，室温晾干，Ag纳米粒子即被修饰在N/FTiO2NTs修饰电极表面。即得Ag-N/FTiO2NTs修饰电极。
第三步：利用交联法将AChE固定在修饰了Ag-N/F/TiO2NTs和N/F/TiO2NTs修饰电极上。将制得的酶溶液(1.0mg mL-1AChE，1.2mg mL-1BSA，5.0mg/mL壳聚糖)滴涂到Ag-N/FTiO2NTs和N/F/TiO2NTs修饰电极的一侧，晾干，得到AChE/Ag-N/F/TiO2NTs和AChE/N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器。
本实施例制备得到的AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器，是通过过阳极氧化技术在金属钛片上制备得到氮氟掺杂的二氧化钛纳米管阵列(TiO2NTs)，通过微波辅助加热多元醇的方法制备银纳米粒子(AgNPs)并将其修饰到二氧化钛纳米管阵列上(Ag-N/F/TiO2NTs)，以壳聚糖为交联剂将乙酰胆碱酯酶(AChE)修饰在Ag-N/F/TiO2NTs上制备得AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器。氮氟掺杂减小了TiO2的禁带宽度使该传感器能在可见光激发下产生光电流，Ag纳米粒子的修饰提高了光生电流强度，提高了对ATCh的检测限。
图1所示为AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器制备过程中N/F/TiO2NTs在修饰前后的SEM图。图1a所示为用电化学阳极氧化法在纯的钛片上制得的高密度、有序的、整齐的N/FTiO2NTs，管径大约为50-65nm。图1b所示为沉积了Ag纳米颗粒(AgNPs)后的Ag-N/FTiO2NTs，AgNPs直径从20-30nm不等。图1c所示是修饰了AChE后的Ag-N/FTiO2NTs的SEM图，即AChE/Ag-N/F/TiO2NTs的SEM图，通过壳聚糖作为交联剂，AChE被成功地固定在Ag-N/FTiO2NTs上。
实施例2AChE/Ag-N/F/TiO2NTs和AChE/N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器对硫代乙酰胆 碱的光电流响应
以实施例1中制备的AChE/Ag-N/FTiO2NTs或AChE/N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝为辅助电极，光电化学电池中工作电极的电压设定为+0.6V，在pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中，以500W氙灯为灯源，以410nm波长光为激发光源，采用计时电流法，记录加入不同浓度的硫代乙酰胆碱后的光电流响应值。
图2所示为AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器制备过程中修饰Ag纳米粒子前后电极的光生电流图。图2中，曲线a为AChE/N/F/TiO2NTs在无底物时的基底电流，曲线b为AChE/Ag-N/F/TiO2NTs在无底物时的基底电流，曲线c为AChE/TiO2NTs在底物浓度为0.1mM时的光生电流，曲线d为AChE/N/F/TiO2NTs在底物浓度为0.1mM时光生电流。通过比较曲线a、b说明修饰Ag纳米粒子后电极的光电转换效率提高，通过比较曲线c、d说明修饰Ag纳米粒子后对底物的响应电流增加。
以AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器根据硫代乙酰胆碱的浓度及测得的光电流响应的光电流值为横纵坐标进行作图，如图3所示。图3所示为响应光电流对不同浓度的硫代乙酰胆碱的光电流图，随着硫代乙酰胆碱浓度的增加，光电流响应也随之上升。
实施例3AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器检测内源性神经毒素(R)-Sal、(R)-NMSal对AChE的抑制
以实施例1制备的AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝为辅助电极，光电化学电池中工作电极的电压设定为+0.6V，在pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中，以紫外灯为光源，采用计时电流法，根据AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器中有无(R)-Sal或(R)-NMSal时对硫代乙酰胆碱产生的光电流变化来考察内源性神经毒素(R)-Sal和(R)-NMSal对AChE的抑制情况。
第一步：在无(R)-Sal或(R)-NMSal的AChE/Ag-N/F/TiO2NTs体系中，加入0.10mM硫代乙酰胆碱，测定光电流响应。
第二步：将0.1μM(R)-Sal或(R)-NMSal加入AChE/Ag-N/F/TiO2NTs体系中后，加入0.10mM硫代乙酰胆碱，测定光电流响应。
以上实验表明，两种内源性神经毒素对AChE均有抑制作用，且相同浓度条件下(R)-NMSal的抑制作用大于(R)-Sal。
进一步地，在上述步骤之后，可以将AChE/Ag-N/F/TiO2NTs重新置于一个无(R)-Sal或(R)-NMSal存在的环境中，加入0.10mM硫代乙酰胆碱，测定光电流响应。
图4所示为AChE-N/FTiO2NTs光电化学生物传感器在有无内源性神经毒素(R)-Sal或(R)-NMSal的体系中对硫代乙酰胆碱的光电流响应图。图4中，曲线a为不存在抑制剂时传 感器的光电流响应，曲线b为加入0.1μM(R)-Sal时的光电流，移除抑制剂后光电流得到恢复如曲线c所示；加入0.1μM(R)-NMSal时的光电流如曲线d所示，移除抑制剂后光电流得到恢复如曲线e所示。数据表明移除抑制剂后传感器对ATCh的响应电流均大于加入抑制剂前传感器光生电流响应值的96％。实验数据显示(R)-Sal和(R)-NMSal对AChE活性的抑制作用均为可逆性的，且(R)-NMSal对AChE的抑制作用强于(R)-Sal。
实施例4：用AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器考察石杉碱甲(HupA)对AChE活性抑制的动力学研究。
以实施例1制备的AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝为辅助电极，光电化学电池中工作电极的电压设定为+0.6V，在pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中，以紫外灯为光源，采用计时电流法，根据AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器在测定体系中存在HupA时对硫代乙酰胆碱产生的光电流变化来考察其对AChE的抑制情况。结果显示，HupA对AChE的抑制作用与内源性神经毒素(R)-Sal和(R)-NMSal的相似，均表现为可逆性混合型的。HupA是一种对AChE抑制作用表现为可逆混合型的典型抑制剂，实验表明本发明AChE-N/FTiO2NTs光电化学生物传感器可应用于酶的活性研究的可行性。
Claims (8)
1.一种AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器，其特征在于，所述光电化学生物传感器是基于可见光激发产生光电流，其包括Ag-N/F/TiO2NTs和乙酰胆碱酯酶，其中，所述Ag-N/F/TiO2NTs包括氮氟掺杂的二氧化钛纳米管阵列、以及修饰在所述二氧化钛纳米管阵列上的银纳米粒子；所述乙酰胆碱酯酶交联修饰在所述Ag-N/F/TiO2NTs上。
2.如权利要求1所述的AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器，其特征在于，所述乙酰胆碱酯酶以壳聚糖为交联剂修饰在所述Ag-N/F/TiO2NTs上。
3.一种AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，通过电化学阳极氧化法在金属钛片上制备得到氮氟掺杂的二氧化钛纳米管阵列；通过微波辅助加热多元醇还原法制备银纳米粒子并将其修饰在所述二氧化钛纳米管阵列上，得到Ag-N/F/TiO2NTs；以壳聚糖为交联剂，将乙酰胆碱酯酶修饰在所述Ag-N/F/TiO2NTs上，制备得到如权利要求1所述的AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(一)用电化学阳极氧化法制备N/F/TiO2NTs电极：
钛片经打磨光洁，依次用丙酮、乙二醇、去离子水超声清洗，以氢氟酸和硝酸的混合液浸润后用丙酮和去离子水冲洗，氮气分下干燥，然后，以石墨电极为阴极，外加电压，以含有NH4F的(NH4)2SO4溶液为电解质，在电化学反应器中反应，经煅烧制得N/F/TiO2NTs电极；
(二)用微波辅助加热法制备Ag-N/F/TiO2NTs电极：
将N/F/TiO2NTs电极浸入含有AgNO3和KOH的乙二醇溶液中，微波加热，冷却后取出电极，用丙酮冲洗，室温晾干，Ag纳米粒子被修饰在N/F/TiO2NTs修饰电极表面，制得Ag-N/F/TiO2NTs电极；
(三)用交联法构建AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器：
将含有AChE和壳聚糖的酶溶液滴涂在Ag-N/F/TiO2NTs修饰电极，晾干得到所述AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器。
5.一种用AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器检测硫代乙酰胆碱的方法，其特征在于，在光电化学电池中，以如权利要求1所述的AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器为工作电极，以银氯化银电极为参比电极，以铂丝为辅助电极，以氙灯为光源，采用计时电流法，记录光电流响应值，实现对硫代乙酰胆碱的检测。
6.AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器应用于检测内源性神经毒素(R)-Sal对AChE活性的抑制。
7.AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器应用于检测内源性神经毒素(R)-NMSal对AChE活性的抑制。
8.AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器应用于检测石杉碱甲对AChE活性的抑制。
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