CN107402245A - 一种ChOx‑ChE/GQDs/N‑F‑TNs光电化学生物传感器制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种ChOx‑ChE/GQDs/N‑F‑TNs光电化学生物传感器制备方法及其应用,其特征在于包括:1)用电化学阳极氧化法制备N/F/TiO2NTs电极;2)用高温裂解法制备GQDs并修饰N‑F‑TNs电极;3)用交联法构建ChOx‑ChE/GQDs/N‑F‑TNs光电化学生物传感器;本发明提供的ChOx‑ChE/GQDs/N‑F‑TNs光电化学生物传感器能够在可见光激发下产生光电流,以胆固醇(CHO)作为底物,经ChOx‑ChE催化水解所得的Ch和CE能够捕获光生空穴抑制光生空穴与光生电子的复合,从而提高了光电流。可对ChOx‑ChE酶活性损伤进行研究;可用于检测芦丁和齐墩果酸对胆固醇氧化酶活性的影响,为解决胆固醇过高导致疾病的研究治疗方法及酶生物传感技术方面提供了重要依据。
Description
技术领域
本发明涉及电化学分析技术领域,具体的涉及一种ChOx-ChE/GQDs/N-F-TNs光电化学生物传感器制备方法及其应用.
背景技术
胆固醇又称胆甾醇,是一种环戊烷多氢菲的衍生物。胆固醇在动物体内含量较多,特别是在神经组织和大脑中最丰富,在肾、肝、胆汁、皮肤和脾中的含量也较高。胆固醇的溶解性与脂肪相类似,不溶于水,易溶于氯仿、乙醚等有机溶剂。对于人类而言,体内的总胆固醇主要由游离胆固醇和酯化胆固醇两种形式组成,血清中正常胆固醇浓度范围是140-190mg/dL。当血清中胆固醇浓度过高时,会引起动脉粥样硬化、心脏病、糖尿病等疾病,因此测定血清中胆固醇含量己成为临床诊断中的一项重要参考指标。
齐墩果酸(oleanolic acid.简称OA),又名庆四紊,五环三萜类化合物,为白色结晶性粉末,无臭、无味。对酸碱不稳定,难溶于水,可溶于乙醚、氯仿、丙酮、甲醇、乙醇等。齐墩果酸广泛地存在于食物、医学草本植物和其他植物中。1975年,我国湖南医药工业研究所按1974年云南青叶胆疗效鉴定会的分工,进行了青叶胆抗肝炎有效成分的化学和药理研究,鉴定其中一单体为OA。据不完全统计,有126种植物含有OA。在常用的植物中,如丁香、太枣、川西獐牙菜、女贞子、牛膝、西洋参、苏合香、连翘、青叶胆、琵琶叶、柿叶、景天三七、人参、山芝麻、甘草、关木通、东北龙胆、雪胆、丰忽木、小茴香、夏枯草中都含有OA。OA在五加科、葫芦科、铁青树科、毛茛科等植物的根和根茎(如雪胆、忽木)中主要以皂苷形式存在。在木樨科、龙胆科、茜草科、苋科、毛茛科等植物的叶和果中(如女贞子),主要以游离形式存在。OA的药理作用不断被发现且逐渐深入,因而引起了广泛关注。经口灌胃给予OA可降低正常大鼠和高脂血症大鼠血清中甘油三酯、胆固醇和β脂蛋白含量旧。它还可以提高老龄小鼠血小板泳动速率,它将为改善老年人血小板的流动性、降低血液牯度、防治老年人的血栓疾病和动脉粥样硬化提供部分实验依据。
此外,山绿茶胶囊为单味药制剂,主要用于防治高血压症、降血酯、降胆固醇、口腔炎、慢性喉炎、妇科附件炎等症。芦丁为山绿茶的主要成分之一,芦丁具有较强的药理活性。因此研究芦丁和齐墩果酸对胆固醇的生理活性具有一定的社会意义。
目前临床检测胆固醇的方法主要有比色法、电化学法、气液色谱-质谱联用法、温度测定法、分子发光法和发光标记法等,其中比色法是目前使用最广泛的方法,其测试结果稳定可靠,但有需要样品剂量较多、速度慢、需要专业人员操作等缺点,而电化学法因其具有灵敏、迅速、简便等优点正在被越来越多的用户所接受。
发明内容
本发明的目的在于,针对现有技术中存在的上述问题,提供一种ChOx-ChE/GQDs/N-F-TNs光电化学生物传感器制备方法及其应用,能够在可见光激发下产生光电流,以胆固醇(CHO)作为底物,经ChOx-ChE催化水解所得的Ch和CE能够捕获光生空穴抑制光生空穴与光生电子的复合,从而提高了光电流。可对ChOx-ChE酶活性损伤进行研究;可用于检测芦丁和齐墩果酸对胆固醇氧化酶活性的影响,为解决胆固醇过高导致疾病的研究治疗方法及酶生物传感技术方面提供了重要依据。
为实现上述目的,达到上述效果,本发明是通过以下技术方案实现:
一种ChOx-ChE/GQDs/N-F-TNs光电化学生物传感器制备方法,其特征在于包括:
1)用电化学阳极氧化法制备N/F/TiO2NTs电极
钛片经打磨光洁,依次用丙酮、无水乙醇、去离子水超声清洗,以氢氟酸和硝酸的混合液浸润后用丙酮和去离子水冲洗,氮气氛下干燥,然后,以石墨电极为阴极,钛片为阳极,外加电压20V,以含有NH4F的(NH4)2SO4溶液为电解质,在电化学反应器中反应,经煅烧制得N/F/TiO2NTs电极;
2)用高温裂解法制备GQDs并修饰N-F-TNs电极
将N/F/TiO2NTs电极浸入含有GQDs溶液中,浸泡10min,用二次蒸馏水冲洗,室温晾干,GQDs被修饰在N/F/TiO2NTs修饰电极表面,制得GQDs/N-F-TNs电极;
3)用交联法构建ChOx-ChE/GQDs/N-F-TNs光电化学生物传感器
将含有ChOx-ChE和壳聚糖的酶溶液滴涂在GQDs/N-F-TNs修饰电极,晾干得到所述ChOx-ChE/GQDs/N-F-TNs光电化学生物传感器。
优选的,所述步骤1)用电化学阳极氧化法制备N/F/TiO2NTs电极,其特征在于:采用阳极氧化技术制备高序排列的二氧化钛纳米管阵列(TiO2NTs)同时一步掺杂氮氟元素,掺杂氮氟元素的TiO2NTs(N/F/TiO2NTs)禁带宽度减小,对600nm(可见光区)以下光有光电活性。
优选的,所述步骤2)用高温裂解法制备GQDs并修饰N-F-TNs电极,其特征在于:通过高温裂解法在碱性条件下制备得到的石墨烯量子点,且在浸泡作用下沉积在TiO2NTs空穴和表面。
一种ChOx-ChE/GQDs/N-F-TNs光电化学生物传感器的应用,其特征在于:用ChOx-ChE/GQDs/N-F-TNs光电化学生物传感器检测胆固醇的方法。
优选的,所述用ChOx-ChE/GQDs/N-F-TNs光电化学生物传感器检测胆固醇的方法,其特征在于:在光电化学电池中,以所述ChOx-ChE/GQDs/N-F-TNs光电化学生物传感器为工作电极,以银氯化银电极为参比电极,以铂丝为辅助电极,所述工作电极的电压设定为+0.6V,在0.1M pH=7.00磷酸盐缓冲溶液中,以氙灯为光源,采用计时电流法,记录光电流响应值,实现对胆固醇的检测。
一种ChOx-ChE/GQDs/N-F-TNs光电化学生物传感器的应用,其特征在于:用ChOx-ChE/GQDs/N-F-TNs光电化学生物传感器检测芦丁对胆固醇的抑制。
一种ChOx-ChE/GQDs/N-F-TNs光电化学生物传感器的应用,其特征在于:用ChOx-ChE/GQDs/N-F-TNs光电化学生物传感器检测齐墩果酸对胆固醇的抑制。
本发明的有益效果是:本发明提供的ChOx-ChE/GQDs/N-F-TNs光电化学生物传感器能够在可见光激发下产生光电流,以胆固醇(CHO)作为底物,经ChOx-ChE催化水解所得的Ch和CE能够捕获光生空穴抑制光生空穴与光生电子的复合,从而提高了光电流。可对ChOx-ChE酶活性损伤进行研究;可用于检测芦丁和齐墩果酸对胆固醇氧化酶活性的影响,为解决胆固醇过高导致疾病的研究治疗方法及酶生物传感技术方面提供了重要依据。
附图说明
图1为本发明实施例1中修饰GQDs粒子的光电流图。
图2为本发明实施例2中响应光电流对不同浓度的胆固醇的光电流图。
图3、4为本发明实施例3中ChOx-ChE/GQDs/N-F-TNs光电化学生物传感器在有无芦丁或齐墩果酸的体系中对胆固醇的光电流响应图。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图,对本发明作进一步的详细说明,本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下,本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中,并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等,除以下专门提及的内容之外,均为本领域的普遍知识和公知常识,本发明没有特别限制内容。
为实现上述目的,达到上述效果,本发明是通过以下技术方案实现:
一种ChOx-ChE/GQDs/N-F-TNs光电化学生物传感器制备方法,其特征在于包括:
1)用电化学阳极氧化法制备N/F/TiO2NTs电极
钛片经打磨光洁,依次用丙酮、无水乙醇、去离子水超声清洗,以氢氟酸和硝酸的混合液浸润后用丙酮和去离子水冲洗,氮气氛下干燥,然后,以石墨电极为阴极,钛片为阳极,外加电压20V,以含有NH4F的(NH4)2SO4溶液为电解质,在电化学反应器中反应,经煅烧制得N/F/TiO2NTs电极;
2)用高温裂解法制备GQDs并修饰N-F-TNs电极
将N/F/TiO2NTs电极浸入含有GQDs溶液中,浸泡10min,用二次蒸馏水冲洗,室温晾干,GQDs被修饰在N/F/TiO2NTs修饰电极表面,制得GQDs/N-F-TNs电极;
3)用交联法构建ChOx-ChE/GQDs/N-F-TNs光电化学生物传感器
将含有ChOx-ChE和壳聚糖的酶溶液滴涂在GQDs/N-F-TNs修饰电极,晾干得到所述ChOx-ChE/GQDs/N-F-TNs光电化学生物传感器。
其中,步骤1)用电化学阳极氧化法制备N/F/TiO2NTs电极,其特征在于:采用阳极氧化技术制备高序排列的二氧化钛纳米管阵列(TiO2NTs)同时一步掺杂氮氟元素,掺杂氮氟元素的TiO2NTs(N/F/TiO2NTs)禁带宽度减小,对600nm(可见光区)以下光有光电活性。
其中,步骤2)用高温裂解法制备GQDs并修饰N-F-TNs电极,其特征在于:通过高温裂解法在碱性条件下制备得到的石墨烯量子点,且在浸泡作用下沉积在TiO2NTs空穴和表面。
一种ChOx-ChE/GQDs/N-F-TNs光电化学生物传感器的应用,其特征在于:用ChOx-ChE/GQDs/N-F-TNs光电化学生物传感器检测胆固醇的方法。
其中,用ChOx-ChE/GQDs/N-F-TNs光电化学生物传感器检测胆固醇的方法,其特征在于:在光电化学电池中,以所述ChOx-ChE/GQDs/N-F-TNs光电化学生物传感器为工作电极,以银氯化银电极为参比电极,以铂丝为辅助电极,所述工作电极的电压设定为+0.6V,在0.1M pH=7.00磷酸盐缓冲溶液中,以氙灯为光源,采用计时电流法,记录光电流响应值,实现对胆固醇的检测。
一种ChOx-ChE/GQDs/N-F-TNs光电化学生物传感器的应用,其特征在于:用ChOx-ChE/GQDs/N-F-TNs光电化学生物传感器检测芦丁对胆固醇的抑制。
一种ChOx-ChE/GQDs/N-F-TNs光电化学生物传感器的应用,其特征在于:用ChOx-ChE/GQDs/N-F-TNs光电化学生物传感器检测齐墩果酸对胆固醇的抑制。
实施例1
制备ChOx-ChE/GQDs/N-F-TNs和ChOx-ChE/N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器
第一步:利用电化学阳极氧化技术制备N/F/TiO2NTs电极。在阳极氧化之前,钛片首先用不同的砂纸打磨,接着把它浸在蒸馏水中超声十分钟,依次用丙酮、无水乙醇、二次蒸馏水水超声清洗,然后把干净的钛片浸在氢氟酸和硝酸的混合液中1分钟,混合液的体积比例为HF:HNO3:H2O=1:4:5,之后钛片用丙酮和蒸馏水冲洗,在室温下晾干。
TiO2NTs电极是在柱状的电化学反应器(半径为30mm,高为70mm)里制备。在整个制备过程中以含有0.1M NH4F的1M(NH4)2SO4溶液用作电解质,石墨电极用作阴极,外加电压为20V。氧化以后的钛片在500℃干燥的有氧环境里煅烧1小时。加热和冷却速率保持在2.5℃min-1,制得N/FTiO2NTs电极,待用。
本发明中,电解液(含有0.1M NH4F的1M(NH4)2SO4溶液)可通过阳极氧化技术实现对二氧化钛纳米管的氮氟同时掺杂,对比了不同阳极氧化时间下所得电极的光电流强度,发现氧化时间为2小时时电极的光生电流强度最大。
第二步:采用高温裂解及浸泡法将石墨烯量子点嵌入N/F/TiO2NTs中。将N/F/TiO2NTs电极浸入5mL pH=7.00的石墨烯量子点溶液中,浸泡十分钟,取出电极,用二次蒸馏水冲洗,室温晾干,石墨烯量子点即被修饰在N/FTiO2NTs修饰电极表面。即得GQDs-N/FTiO2NTs修饰电极。
第三步:利用交联法将ChOx-ChE固定在修饰了GQDs/N-F-TNs和N/F/TiO2NTs修饰电极上。将制得的酶溶液10ul(500U/mL ChOx-ChE,5.0mg/mL壳聚糖)滴涂到GQDs-N/FTiO2NTs和N/F/TiO2NTs修饰电极的一侧,晾干,得到ChOx-ChE/GQDs/N-F-TNs和ChOx-ChE/N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器。
本实施例制备得到的ChOx-ChE/GQDs/N-F-TNs光电化学生物传感器,是通过过阳极氧化技术在金属钛片上制备得到氮氟掺杂的二氧化钛纳米管阵列(TiO2NTs),通过高温裂解及浸泡法制备石墨烯量子点并将其修饰到二氧化钛纳米管阵列上(GQDs-N/F/TiO2NTs),以壳聚糖为交联剂将胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶(ChOx-ChE)修饰在GQDs-N/F/TiO2NTs上制备得ChOx-ChE/GQDs-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器。氮氟掺杂减小了TiO2的禁带宽度使该传感器能在可见光激发下产生光电流,石墨烯量子点的修饰提高了光生电流强度,提高了对CHO的检测限。
实施例2
ChOx-ChE/GQDs/N-F-TNs和ChOx-ChE/N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器对胆固醇的光电流响应
以实施例1中制备的ChOx-ChE/GQDs-N/FTiO2NTs或ChOx-ChE/N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器为工作电极,银氯化银电极为参比电极,铂丝为辅助电极,光电化学电池中工作电极的电压设定为+0.6V,在pH=7.00的磷酸盐缓冲溶液中,以500W氙灯为灯源,以600nm波长光为激发光源,采用计时电流法,记录加入不同浓度的胆固醇后的光电流响应值。
图1所示为ChOx-ChE/GQDs/N-F-TNs光电化学生物传感器制备过程中修饰石墨烯量子点、酶及胆固醇电极的光生电流图。图1中,曲线a为N-F-TNs的光电流检测图,曲线b为GQDs/N-F-TNs的光电流检测图,曲线c为ChOx-ChE/GQDs/N-F-TNs的光电流检测图,曲线d为ChOx-ChE/GQDs/N-F-TNs在底物浓度为0.1mM时光生电流。通过比较曲线a、b、c、d说明修饰石墨烯量子点、酶后对底物的响应电流增加。
以ChOx-ChE/GQDs/N-F-TNs光电化学生物传感器根据胆固醇的浓度及测得的光电流响应的光电流值为横纵坐标进行作图,如图2所示。图2所示为响应光电流对不同浓度的胆固醇的光电流图,随着胆固醇浓度的增加,光电流响应也随之上升。
实施例3ChOx-ChE/GQDs-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器检测芦丁和齐墩果酸对ChOx-ChE的抑制
以实施例1制备的ChOx-ChE/GQDs-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器为工作电极,银氯化银电极为参比电极,铂丝为辅助电极,光电化学电池中工作电极的电压设定为+0.6V,在pH=7.00的磷酸盐缓冲溶液中,以氙灯为光源,采用计时电流法,根据ChOx-ChE/GQDs-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器中有无芦丁或齐墩果酸时对胆固醇产生的光电流变化来考察芦丁和齐墩果酸对ChOx-ChE的抑制情况。
第一步:在无芦丁或齐墩果酸的ChOx-ChE/GQDs-N/F/TiO2NTs体系中,加入0.10mM胆固醇,测定光电流响应。
第二步:将0.5μM芦丁或10.0μM齐墩果酸加入ChOx-ChE/GQDs-N/F/TiO2NTs体系中后,加入0.10mM胆固醇,测定光电流响应。
以上实验表明,芦丁对ChOx-ChE有抑制作用,齐墩果酸对ChOx-ChE有激活作用。
进一步地,在上述步骤之后,可以将ChOx-ChE/GQDs-N/F/TiO2NTs重新置于一个无芦丁或齐墩果酸存在的环境中,加入0.10mM胆固醇,测定光电流响应。
图3所示为ChOx-ChE-N/FTiO2NTs光电化学生物传感器在有无芦丁的体系中对胆固醇的光电流响应图。图3中,曲线a为不存在底物胆固醇时传感器的光电流响应,曲线b为加入加入0.10mM胆固醇时的光电流,加入0.5μM芦丁时的光电流如曲线c所示;弃除芦丁时的光电流如曲线d所示。数据表明加入抑制剂后传感器光电流减少16.34%,最后再弃除抑制剂芦丁d,光电流与b相差4.8%,在误差允许范围内。实验数据显示芦丁和胆固醇对ChOx-ChE活性的抑制作用类型属于可逆抑制中的非竞争性抑制。
图4所示为ChOx-ChE-N/FTiO2NTs光电化学生物传感器在有无齐墩果酸的体系中对胆固醇的光电流响应图。图4中,曲线a为不存在底物胆固醇时传感器的光电流响应,曲线b为加入加入0.10mM胆固醇时的光电流,加入10.0μM齐墩果酸时的光电流如曲线c所示;弃除齐墩果酸时的光电流如曲线d所示。数据表明加入10.0μM的齐墩果酸,光电流增加13.1%,最后再弃除齐墩果酸(d),光电流与(b)基本一致。实验结果说明齐墩果酸在这一浓度范围内对底物胆固醇有激活的作用。
对所公开的实施例的上述说明,使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的,本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下,在其它实施例中实现。因此,本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例,而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (7)
1.一种ChOx-ChE/GQDs/N-F-TNs光电化学生物传感器制备方法,其特征在于包括:
1)用电化学阳极氧化法制备N/F/TiO2NTs电极
钛片经打磨光洁,依次用丙酮、无水乙醇、去离子水超声清洗,以氢氟酸和硝酸的混合液浸润后用丙酮和去离子水冲洗,氮气氛下干燥,然后,以石墨电极为阴极,钛片为阳极,外加电压20V,以含有NH4F的(NH4)2SO4溶液为电解质,在电化学反应器中反应,经煅烧制得N/F/TiO2NTs电极;
2)用高温裂解法制备GQDs并修饰N-F-TNs电极
将N/F/TiO2NTs电极浸入含有GQDs溶液中,浸泡10min,用二次蒸馏水冲洗,室温晾干,GQDs被修饰在N/F/TiO2NTs修饰电极表面,制得GQDs/N-F-TNs电极;
3)用交联法构建ChOx-ChE/GQDs/N-F-TNs光电化学生物传感器将含有ChOx-ChE和壳聚糖的酶溶液滴涂在GQDs/N-F-TNs修饰电极,晾干得到所述ChOx-ChE/GQDs/N-F-TNs光电化学生物传感器。
2.如权利要求1所述的一种ChOx-ChE/GQDs/N-F-TNs光电化学生物传感器制备方法,其特征在:所述步骤1)用电化学阳极氧化法制备N/F/TiO2NTs电极,其特征在于:采用阳极氧化技术制备高序排列的二氧化钛纳米管阵列(TiO2NTs)同时一步掺杂氮氟元素,掺杂氮氟元素的TiO2NTs(N/F/TiO2NTs)禁带宽度减小,对600nm(可见光区)以下光有光电活性。
3.如权利要求1所述的一种ChOx-ChE/GQDs/N-F-TNs光电化学生物传感器制备方法,其特征在:所述步骤2)用高温裂解法制备GQDs并修饰N-F-TNs电极,其特征在于:通过高温裂解法在碱性条件下制备得到的石墨烯量子点,且在浸泡作用下沉积在TiO2NTs空穴和表面。
4.如权利要求1-3制备的一种ChOx-ChE/GQDs/N-F-TNs光电化学生物传感器,其应用在于:用ChOx-ChE/GQDs/N-F-TNs光电化学生物传感器检测胆固醇的方法。
5.如权利要求4所述的一种ChOx-ChE/GQDs/N-F-TNs光电化学生物传感器的应用,其特征在于:在光电化学电池中,以所述ChOx-ChE/GQDs/N-F-TNs光电化学生物传感器为工作电极,以银氯化银电极为参比电极,以铂丝为辅助电极,所述工作电极的电压设定为+0.6V,在0.1M pH=7.00磷酸盐缓冲溶液中,以氙灯为光源,采用计时电流法,记录光电流响应值,实现对胆固醇的检测。
6.如权利要求1-3制备的一种ChOx-ChE/GQDs/N-F-TNs光电化学生物传感器的应用,其特征在于:用ChOx-ChE/GQDs/N-F-TNs光电化学生物传感器检测芦丁对胆固醇的抑制。
7.如权利要求1-3制备的一种ChOx-ChE/GQDs/N-F-TNs光电化学生物传感器的应用,其特征在于:用ChOx-ChE/GQDs/N-F-TNs光电化学生物传感器检测齐墩果酸对胆固醇的抑制。
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CN201710652819.XA Pending CN107402245A (zh) | 2017-08-02 | 2017-08-02 | 一种ChOx‑ChE/GQDs/N‑F‑TNs光电化学生物传感器制备方法及其应用 |
Country Status (1)
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CN (1) | CN107402245A (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN110161092A (zh) * | 2019-03-28 | 2019-08-23 | 玉溪师范学院 | 一种AchE/GQDs/N-F-TiO2Ns光电化学生物传感器制备方法及其应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103149259A (zh) * | 2013-02-20 | 2013-06-12 | 华东师范大学 | AChE/Ag-N/F/TiO2NTs光电化学生物传感器及其制备方法和应用 |
CN105651846A (zh) * | 2015-12-29 | 2016-06-08 | 东莞市青麦田数码科技有限公司 | 基于智能手机的胆固醇检测装置 |
-
2017
- 2017-08-02 CN CN201710652819.XA patent/CN107402245A/zh active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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