CN108956733A - 基于表面重建螺旋型铂铱酶电极的葡萄糖生物传感器及其制备螺旋型铂铱酶电极的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了基于表面重建螺旋型铂铱酶电极的葡萄糖生物传感器及其制备螺旋型铂铱酶电极的方法，所述葡萄糖生物传感器以表面重建螺旋型铂铱酶电极为工作电极，其中，所述铂铱酶电极包括紧密盘绕的铂铱线圈，所述铂铱线圈表面沉积有花瓣状的铂纳米粒子并且涂覆有葡萄糖氧化酶膜和环氧聚氨酯半透膜，所述葡萄糖氧化酶膜包括戊二醛、葡萄糖氧化酶和牛血清蛋白；所述环氧聚氨酯半透膜包括四氢呋喃、聚氨酯和双组份环氧胶黏剂。本发明中的表面重建螺旋型铂铱酶电极的葡萄糖生物传感器，相对于裸铂铱酶电极传感器，明显提升对葡萄糖溶液计时电流检测的灵敏度和检测线性范围，传感器同时具有良好的稳定性和选择性。

Description

基于表面重建螺旋型铂铱酶电极的葡萄糖生物传感器及其制 备螺旋型铂铱酶电极的方法
技术领域
本发明涉及传感器技术领域，具体地说，涉及一种基于表面重建螺旋型铂铱酶电极的葡萄糖生物传感器及其制备表面重建螺旋型铂铱酶电极的方法。
背景技术
糖尿病是一种引起人体血糖水平异常升高的临床慢性疾病，它会诱发高血压、心血管、肾衰竭、手足坏死、神经紊乱等多种病症，对人的生命健康有极大危害。据世卫组织统计，全世界范围内每年有400万人直接或间接由糖尿病导致死亡，所以针对糖尿病患者血糖值应该严格有效的监控以避免一系列的并发症发生造成生命危险。葡萄糖生物传感器作为临床诊断糖尿病的重要手段，在全世界拥有着广泛的市场，每年的销量超过 100亿美金，并且逐年增长。
目前，国际市场上，美国的美敦力公司、德康公司和雅培公司，包括国内浙江湖州圣美迪诺公司均已推出了自己的动态血糖监测仪，但是它们普遍的工作寿命均不超过72h，这主要是由于目前市面上的动态血糖监测仪工作电极的设计为了减少器件植入后机体的防御和排斥反应，大多采用针式电极，葡萄糖氧化酶只能薄薄地沉积在管壁周围，担载的酶量极少，极易脱落，并且电极表面活性反应面积很小，导致此类传感器寿命小于一周。
因此，有必要开发一种响应电流高，稳定性、选择性好的可植入式葡萄糖生物传感器。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于表面重建螺旋型铂铱电极的葡萄糖生物传感器。使用螺旋型铂铱电极作为葡萄糖生物传感器的工作电极，相比较于针式电极可以担载更多葡萄糖氧化酶。对螺旋型铂铱电极表面进行化学腐蚀和沉积铂纳米粒子，前者可以增加电极表面酶附着位点和活性反应面积，后者由于控制铂纳米粒子的沉积液的组成、温度、 pH值和沉积时间，能够形成由片状纳米铂粒子组合成花瓣状的特殊形貌，均匀地分布在被腐蚀过的螺旋型铂铱电极的表面，显著增加了电极电化学活性表面积，并且对氧化酶催化葡萄糖生成的中间产物过氧化氢(H2O2)具有较好的电催化活性，能够有效地提高计时电流法对葡萄糖检测的灵敏度和检测线性范围，为长效植入式器件开发提供一种可行方案。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。
本发明提供了基于表面重建螺旋型铂铱酶电极的葡萄糖生物传感器，所述葡萄糖生物传感器以表面重建螺旋型铂铱酶电极为工作电极，所述铂铱酶电极包括紧密盘绕的铂铱线圈，所述铂铱线圈表面沉积有花瓣状的铂纳米粒子并且涂覆有葡萄糖氧化酶膜和环氧聚氨酯半透膜，
所述葡萄糖氧化酶膜包括戊二醛、葡萄糖氧化酶和牛血清蛋白；
所述环氧聚氨酯半透膜包括四氢呋喃、聚氨酯和双组份环氧胶黏剂。
在本发明的一优选实施方案中，所述花瓣状铂纳米粒子的粒径为100-500nm。
在本发明的一优选实施方案中，所述铂铱线圈是经过酸处理的，其中所述酸是王水、浓盐酸或浓硫酸中的一种或其组合。
在本发明的一优选实施方案中，铂铱线圈使用恒电位法进行沉积，沉积液温度为30– 70℃，pH值为4-7，在电极表面沉积铂纳米粒子时间为5-25min，沉积液为氯铂酸和电解质液的混合溶液，电解质液为硫酸、盐酸或氯化钾。
在本发明的一优选实施方案中，所述环氧聚氨酯半透膜进一步包括双组份环氧胶黏剂。
本发明还提供了一种制备表面重建螺旋型铂铱酶电极的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)螺旋型铂铱电极的制备
以医用铂铱丝为电极使用材料，沿着皮下注射针紧密盘旋缠绕5-8圈，获得紧密盘绕、质地均匀的铂铱线圈，并将纤维材料嵌入线圈内，制得螺旋型铂铱电极；
(2)螺旋型铂铱电极的表面腐蚀和电沉积铂纳米粒子
将步骤(1)中紧密缠绕的螺旋型铂铱电极剥离Teflon涂层部分后置于回流加热的酸中进行腐蚀，之后使用循环伏安法对电极进行清扫，然后将电极置于一定温度和pH值下的沉积液中，利用恒电位法在电极表面上沉积铂纳米粒子；
(3)螺旋型铂铱酶电极的制备
使用葡萄糖氧化酶溶液和环氧聚氨酯溶液(A)和(B)对步骤(2)中已沉积铂纳米粒子的螺旋型铂铱电极进行滴涂，形成对葡萄糖具有催化性能的表面重建螺旋型铂铱酶电极，
其中，所述葡萄糖氧化酶溶液是以4-6μL戊二醛为交联剂，将1.0-6.0mg葡萄糖氧化酶，10-15mg牛血清蛋白和300μL去离子水混合，并在摇床上使其均匀混合配制成的；
所述环氧聚氨酯溶液(A)是3-6mL四氢呋喃，25-30mg的聚氨酯，1mg十二烷基聚四氧乙烯醚和16-20mg双组份环氧胶黏剂的混合溶液；所述环氧聚氨酯溶液(B) 是3-6mL四氢呋喃，90-95mg的聚氨酯和90-95mg双组份环氧胶黏剂的混合溶液；
其中所述葡萄糖氧化酶溶液的滴涂方法是：将已沉积铂纳米粒子的螺旋型铂铱电极垂直悬挂在可移动胶带上，用10μL的移液枪移取2-8μL所述葡萄糖氧化酶溶液滴涂到电极上，间隔30min后，再滴涂同样体积的葡萄糖氧化酶溶液，然后将上述滴涂过葡萄糖氧化酶溶液的螺旋型铂铱电极在室温下干燥1h；所述环氧聚氨酯溶液(A)和(B)的滴涂方法是：移取2-12μL环氧聚氨酯溶液(A)滴涂到上述干燥过的螺旋型铂铱电极的四周，移取1-3 μL环氧聚氨酯溶液(B)涂覆在上述干燥过的螺旋型铂铱电极的螺旋线圈的首尾两端，然后将上述滴涂过环氧聚氨酯溶液(A)和(B)的螺旋型铂铱电极放置在室温下干燥30min，接着放置在80℃恒温干燥箱中固化20-60min，即得到表面重建螺旋型铂铱酶电极。
在本发明的一优选实施方案中，步骤(1)中所述纤维材料为医用棉花。
在本发明的一优选实施方案中，步骤(1)中所述皮下注射针为4.5-7号。
在本发明的一优选实施方案中，步骤(2)中所述酸是王水、浓盐酸或浓硫酸中的一种或其组合。
在本发明的一优选实施方案中，步骤(2)中回流加热的温度为180–240℃，螺旋型铂铱电极腐蚀的时间为0-60min。
在本发明的一优选实施方案中，步骤(2)中恒电位法电位设置为-0.2V，沉积液温度为 30–70℃，pH值为4-7，在电极表面沉积铂纳米粒子时间为5-25min，沉积液为氯铂酸和电解质液的混合溶液，电解质液为硫酸、盐酸或氯化钾。
一种基于表面重建螺旋型铂铱酶电极的葡萄糖生物传感器的制备方法，其具体步骤为：
(1)螺旋型铂铱电极的制备：
取长约5cm的医用级铂铱丝(Φ0.125mm，Pt:Ir＝9:1)，剥离去除末端1～1.5cm 左右的Teflon涂层，在超纯水中超声处理5min。用无水乙醇擦拭的镊子将上述铂铱丝沿着皮下注射针(4.5-7号)紧密盘旋缠绕5-8圈，获得外径约为0.7-0.95mm，内径约为0.45-0.7mm的Pt-Ir线圈。将一小股纤维材料嵌入线圈内，用以提高葡萄糖氧化酶(GOD)固定载量；
(2)螺旋型铂铱电极的表面腐蚀：
使用化学腐蚀的方法，将上述步骤(1)中制备的紧密缠绕的铂铱电极剥离Teflon涂层部分置于高温回流加热温度为180-240℃的王水(体积比，浓盐酸：浓硝酸＝3: 1)、浓硫酸或浓盐酸中进行腐蚀，腐蚀时间设置为0-60min；
(3)螺旋型铂铱电极电沉积前的清扫准备：
将上述步骤(2)腐蚀后的螺旋型铂铱电极置于0.5-1.0M的硫酸溶液中，采用电化学循环伏安法，以铂丝为对电极，饱和甘汞为参比电极，已腐蚀的螺旋型铂铱电极为工作电极，对电极表面进行清扫，清扫范围为-0.2-1.2V，扫速为100mV/s，扫描圈数为20-40圈。
(4)螺旋型铂铱电极电沉积铂纳米粒子：
电沉积铂纳米粒子采用恒电位法，以0.5-2.0mM氯铂酸与0.5-1.0M电解质液混合溶液为沉积液，电解质液为硫酸、盐酸或氯化钾，沉积液温度设置为30–70℃，沉积液pH值设置为4‐7，将上述步骤(3)清扫后的电极置于沉积液中，电位可设置为-0.2-0V，沉积时间设置为5-25min；
(5)采用经典的化学交联方法，以戊二醛(GA)为交联剂，采用多种GOD配比的酶配方，GOD含量优选为1.0-6.0mg，将GOD与牛血清蛋白(BSA)配制成葡萄糖氧化酶混合溶液，并在摇床上使其均匀混合；
(6)将四氢呋喃(THF)，聚氨酯(PU)，十二烷基聚四氧乙烯醚(Brij30)及双组份环氧胶黏剂(2-part epoxy adhesive)按比例配置成环氧聚氨酯(Epoxy-PU)溶液(A) 并且将四氢呋喃(THF)，聚氨酯(PU)及双组份环氧胶黏剂(Epoxy)按比例配置成 Epoxy-PU溶液(B)；
(7)铂纳米粒子/葡萄糖氧化酶/环氧聚氨酯酶电极的制备
将上述步骤(4)电沉积铂纳米粒子后的螺旋型铂铱电极垂直悬挂在可移动胶带上，用移液枪移取2-8μL步骤(5)中的葡萄糖氧化酶溶液滴涂到电极上面1-3次，其中滴涂前后间隔为30min，然后让上述滴涂后的电极在室温环境下干燥1h。将上述干燥完毕的电极，垂直悬挂在可移动胶带上，使用10μL的移液枪移取2～12μL上述步骤(6) 已制备好的Epoxy-PU溶液(A)，滴涂到上述电极的四周，移取1-3μL上述步骤(6)已制备好的Epoxy-PU溶液(B)仔细涂覆在上述电极的螺旋线圈的首尾两端，作为封装剂。将上述已修饰Epoxy-PU溶液(A)和(B)的电极放置在室温下干燥30min，然后放置在80 ℃恒温干燥箱中固化20-60min，即得到铂纳米粒子/葡萄糖氧化酶/环氧聚氨酯酶电极 (即表面重建的螺旋型铂铱酶电极)。
上述步骤(1)中，盘绕圈数优选8圈，纤维材料为医用棉花，皮下注射针优选4.5号。
上述步骤(2)中，腐蚀液优选王水，高温回流加热温度优选220℃，腐蚀时间优选30min。
上述步骤(4)中，氯铂酸和电解质液的浓度分别优选为1mM和0.5mM，电解质液优选为硫酸，沉积液温度优选为55–70℃，pH值优选设置为5.5–6，电沉积时间优选10min。
上述步骤(7)中，滴涂到螺旋线圈型酶电极的四周的Epoxy-PU溶液(A)优选6μL。
与现有技术相比，本发明的积极效果是：
本发明采用铂纳米粒子/葡萄糖氧化酶/环氧聚氨酯酶电极(螺旋型铂铱酶电极)作为葡萄糖生物传感器的工作电极，相比较于针式电极，该器型螺旋孔道结构可以担载更多葡萄糖氧化酶，提供更多的活性反应位点。对螺旋型铂铱酶电极表面进行化学腐蚀和沉积铂纳米粒子，前者可以增加电极表面酶附着位点和活性反应面积，后者发现不同的沉积条件能够形成不同形貌和大小的铂纳米粒子，准确控制沉积液的组成、温度和pH，以及最优沉积时间为10min，能够形成由片状纳米粒子组合成花瓣状的特殊形貌，均匀地分布在被腐蚀过的螺旋型铂铱电极的表面，显著增加了电极电化学活性表面积，对氧化酶催化葡萄糖生成的中间产物过氧化氢(H2O2)具有较好的电催化活性，能够有效地提高对于葡萄糖检测的响应信号电流、灵敏度和检测范围。因此选取最佳的腐蚀时间和电沉积条件，构建表面重建铂纳米粒子/葡萄糖氧化酶/环氧聚氨酯酶电极，以此为基础构建响应电流高，稳定性、选择性好的可植入式葡萄糖生物传感器。该传感器计时电流检测表明，酶电极表面重建后传感器线性范围扩大为2mmol/L-45mmol/L，优于裸铂铱酶电极传感器，并明显提升电流响应值和灵敏度，传感器同时具有良好的稳定性和选择性。
附图说明
图1为实施例1制得的电极表面腐蚀时间为30min的扫描电镜(SEM)图。
图2为实施例1制得的电极表面腐蚀时间为30min，氯铂酸和电解质液的浓度分别优选为1mM和0.5mM，电解质液为硫酸，沉积液温度为55–70℃，pH值设置为5.5– 6，电沉积铂纳米粒子时间为10min的扫描电镜(SEM)图。
图3为实施例2制得的铂纳米粒子(PtNPs)/葡萄糖氧化酶(GOD)/环氧聚氨酯(Epoxy-PU)酶电极实物图。
图4为实施例5制得的不同时间腐蚀后的电极对H2O2的定量检测图。
图5为实施例6制得的相同腐蚀时间，不同电沉积时间的电极对H2O2的定量检测图。
图6为实施例7中分别以PtNPs/GOD/Epoxy-PU酶电极与裸铂铱酶电极为工作电极的传感器对葡萄糖溶液的定量检测图。
图7实施例8中PtNPs/GOD/Epoxy-PU酶电极的长期稳定性测试。
图8实施例9中PtNPs/GOD/Epoxy-PU酶电极的抗干扰测试。
具体实施方式
以下提供本发明一种基于表面重建螺旋型铂铱电极的葡萄糖生物传感器的制备的具体实施方式。
实施例1表面重建的螺旋型铂铱电极的制备
(1)取长约5cm的医用级铂铱丝(Φ0.125mm，Pt:Ir＝9:1)，剥离去除末端1.5 cm左右的Teflon涂层，在超纯水中超声处理5min。用无水乙醇擦拭的镊子将上述铂铱丝沿着皮下注射针(4.5号)紧密盘旋缠绕，获得外径约为0.7mm，内径约为0.45mm 的Pt-Ir线圈。将一小股纤维材料嵌入线圈内，用以提高GOD固定载量；
(2)将上述紧密缠绕的铂铱丝剥离Teflon涂层部分置于高温回流加热温度为220℃的王水中(体积比，浓盐酸：浓硝酸＝3:1)进行腐蚀，腐蚀时间设置为30min；
(3)将上述经过腐蚀的螺旋型铂铱丝置于0.5M的硫酸溶液中，以铂丝为对电极，饱和甘汞为参比电极，已腐蚀的螺旋型铂铱丝为工作电极，对电极表面进行清扫，清扫范围为-0.2-1.2V，扫速为100mV/s，扫描圈数为30圈；
(4)电沉积铂纳米粒子，采用恒电位法，以1mM氯铂酸与0.5M硫酸混合溶液为沉积液，沉积液温度为55–70℃，pH值设置为5.5–6，将上述清扫后的电极置于沉积液中，电位设置为-0.2V，沉积时间设置为10min，制得表面重建的螺旋型铂铱电极；
从图2中可以看出，花瓣状铂纳米粒子的粒径为100-500nm。
实施例2 PtNPs/GOD/Epoxy-PU酶电极(即螺旋型铂铱酶电极)的制备
(1)葡萄糖氧化酶溶液的制备
采用经典的化学交联方法，以5μL GA为交联剂，将2.5mg GOD，12mg BSA和300μL去离子水混合，并在摇床上使其均匀混合，配制成葡萄糖氧化酶溶液。
(2)环氧聚氨酯溶液的制备
将4mL THF，26.7mg PU，1mg Brij30及17.8mg Epoxy混合成Epoxy-PU溶液(A)；将4mL THF，91.2mg PU，92.5mg Epoxy混合成Epoxy-PU溶液(B)。
(3)PtNPs/GOD/Epoxy-PU酶电极的制备
将实施例1中已沉积铂纳米粒子的螺旋型铂铱电极垂直悬挂在可移动胶带上，用10 μL的移液枪移取8μL实施例2中已制备好的葡萄糖氧化酶溶液滴涂到电极上，间隔30min后，再滴涂同样体积的葡萄糖氧化酶溶液，然后将上述已滴涂葡萄糖氧化酶溶液的电极在室温环境下干燥1h，得到螺旋线圈型酶电极。将上述干燥完毕的螺旋线圈型酶电极垂直悬挂在可移动胶带上，使用10μL的移液枪移取6μL上述已制备好的Epoxy-PU 溶液(A)，滴涂到所述螺旋线圈型酶电极的四周，移取1μL上述已制备好的Epoxy-PU溶液(B)仔细涂覆在所述螺旋线圈型酶电极的螺旋线圈的首尾两端，作为封装剂。将上述已涂覆Epoxy-PU溶液(A)和(B)的螺旋线圈型酶电极放置在室温下干燥30min，然后放置在80℃恒温干燥箱中固化20min，即得到基于表面重建的PtNPs/GOD/Epoxy-PU酶电极(即螺旋型铂铱酶电极)。
实施例3不同腐蚀时间的螺旋型铂铱酶电极的制备
在实施例1的步骤(2)中，除腐蚀时间设置为30min外，可以将腐蚀时间设置为0min、15min、60min中的一种，其他步骤和条件都与实施例1和实施例2相同，具体条件在发明内容限定的范围内作相应的变动和调整，可以得到不同腐蚀时间的螺旋型铂铱酶电极。
实施例4不同电沉积条件的铂纳米粒子的螺旋型铂铱酶电极的制备
在实施例1的步骤(4)中，除沉积时间设置为10min外，可设置不同的电沉积时间，包括0min、5min、15min、20min或25min中的一种，其他步骤和条件都与实施例1和实施例2相同，具体条件在发明内容限定的范围内作相应的变动和调整，可以得到不同电沉积条件的螺旋型铂铱酶电极。
实施例5不同时间腐蚀后的电极对H2O2的定量检测
使用计时电流法对H2O2进行定量检测，工作电位设置为0.5V，将不同腐蚀时间的螺旋型铂铱电极和Ag/AgCl参比电极置于8mL磷酸盐缓冲液(PBS)底液中，向溶液中加入2mMH2O2 3次，可以观察到每次加入H2O2后都会在3s内出现阶梯图形，表明以实施例3中经过不同时间腐蚀后的螺旋型铂铱电极为工作电极的传感器对H2O2有着快速响应，并且观察到在同一浓度下，经过腐蚀的螺旋型铂铱电极相比裸铂铱电极响应电流明显增加。其中腐蚀时间为30min相较于15min和60min的电流响应最大，说明腐蚀时间为30min的电极能够提供更多的反应位点催化过氧化氢分解，
其中上述裸铂铱电极的制备如下：取长约5cm的医用级铂铱丝(Φ0.125mm，Pt:Ir＝9:1)，剥离去除末端1～1.5cm左右的Teflon涂层，在超纯水中超声处理5min。用无水乙醇擦拭的镊子将上述铂铱丝沿着皮下注射针(4.5-7号)紧密盘旋缠绕5-8圈，将一小股纤维材料嵌入线圈内，获得外径约为0.7-0.95mm，内径约为0.45-0.7mm的裸铂铱电极。
实施例6相同腐蚀时间，不同电沉积条件的电极对H2O2的定量检测
使用计时电流法对H2O2进行定量检测，工作电位设置为0.5V，将腐蚀时间为30min，电沉积时间(0min、5min、10min、15min、20min和25min)(其他步骤和条件都与实施例1和实施例2相同)不同的螺旋型铂铱酶电极(即实施例4中的螺旋型铂铱酶电极)和Ag/AgCl参比电极置于8mL PBS底液中，向溶液中加入50μM H2O2 3次，观察到以实施例4中的螺旋型铂铱酶电极为工作电极的传感器对单位浓度过氧化氢的响应电流明显增大，其中电沉积时间为10min的电极对过氧化氢的响应电流最大，说明电沉积时间为10min的电极能够提供更多的反应位点催化过氧化氢分解。
实施例7以PtNPs/GOD/Epoxy-PU酶电极为工作电极的传感器对葡萄糖溶液的定量检测
在电化学反应池中，以PBS(pH＝7.4)缓冲溶液模拟人体皮下组织液作为支持电解质，用计时电流法测试分别以实施例2所制备的PtNPs/GOD/Epoxy-PU酶电极和裸铂铱酶电极为工作电极的传感器在不同的葡萄糖浓度下响应电流，计时电流测试的控制电位为0.6V，
其中上述裸铂铱酶电极的制备如下：
(1)取长约5cm的医用级铂铱丝(Φ0.125mm，Pt:Ir＝9:1)，剥离去除末端1～1.5cm左右的Teflon涂层，在超纯水中超声处理5min。用无水乙醇擦拭的镊子将上述铂铱丝沿着皮下注射针(4.5-7号)紧密盘旋缠绕5-8圈，将一小股纤维材料嵌入线圈内，获得外径约为0.7-0.95mm，内径约为0.45-0.7mm的裸铂铱电极。
(2)采用经典的化学交联方法，以5μL GA为交联剂，将2.5mg GOD，12mg BSA 和300μL去离子水混合，并在摇床上使其均匀混合，配制成葡萄糖氧化酶溶液，将4mL THF，26.7mgPU，1mg Brij30及17.8mg Epoxy混合成Epoxy-PU半透膜溶液(A)；将4mL THF，91.2mg PU，92.5mg Epoxy混合成Epoxy-PU半透膜溶液(B)。
(3)将上述(1)已制备好的裸铂铱电极垂直悬挂在可移动胶带上，用10μL的移液枪移取8μL实施例2中已制备好的葡萄糖氧化酶溶液滴涂到电极上，间隔30min后，再滴涂同样体积的葡萄糖氧化酶溶液，然后将上述已滴涂葡萄糖氧化酶溶液的电极在室温环境下干燥1h，得到螺旋线圈型酶电极。将上述干燥完毕的螺旋线圈型酶电极垂直悬挂在可移动胶带上，使用10μL的移液枪移取6μL上述已制备好的Epoxy-PU溶液(A)，滴涂到所述螺旋线圈型酶电极的四周，移取1μL上述已制备好的Epoxy-PU溶液(B)仔细涂覆在所述螺旋线圈型酶电极的螺旋线圈的首尾两端，作为封装剂。将上述已涂覆 Epoxy-PU溶液(A)和(B)的螺旋线圈型酶电极放置在室温下干燥30min，然后放置在80℃恒温干燥箱中固化20min，即得到裸铂铱酶电极
实施例8 PtNPs/GOD/Epoxy-PU酶电极的长期稳定性测试
使用计时电流响应进行电极的长期稳定性测试，其检测电位为0.6V。每隔七天进行实验，向均匀搅拌的PBS(pH＝7.4)溶液中加入不同浓度的葡萄糖溶液。体外长期稳定性测试表明，以实施例2所制备的PtNPs/GOD/Epoxy-PU酶电极为工作电极的传感器在前两周内能够保持良好的稳定性，之后稳定性下降，但是响应电信号在30天内仍保持100％，表明电极的长期稳定性良好。
实施例9 PtNPs/GOD/Epoxy-PU酶电极的抗干扰测试
使用计时电流响应进行实施例2中的PtNPs/GOD/Epoxy-PU酶电极的抗干扰性测试，其检测电位为0.6V，设置了常见于体内四种干扰物质分别为抗坏血酸、多巴胺、尿酸和果糖，将抗干扰实验设置为每隔一定时间依次注入5mM葡萄糖(Glu)，尿酸(Uric acid)、多巴胺(Dopamine)、抗坏血酸(Ascorbic acid)和果糖(Fructose)和5mM 葡萄糖(Glucose)。实验表面各种干扰物质与5mM的葡萄糖相比仅仅产生可以忽略不计的电流响应，干扰电流响应小于Glu响应电流的5％，表明表面重建螺旋型铂铱酶电极对葡萄糖的检测具有良好的选择性和抗干扰性。
以上实施例的说明仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于所述技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也应视为本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.基于表面重建螺旋型铂铱酶电极的葡萄糖生物传感器，所述葡萄糖生物传感器以表面重建螺旋型铂铱酶电极为工作电极，其特征在于，所述铂铱酶电极包括紧密盘绕的铂铱线圈，所述铂铱线圈表面沉积有花瓣状的铂纳米粒子并且涂覆有葡萄糖氧化酶膜和环氧聚氨酯半透膜，
所述葡萄糖氧化酶膜包括戊二醛、葡萄糖氧化酶和牛血清蛋白；
所述环氧聚氨酯半透膜包括四氢呋喃、聚氨酯和双组份环氧胶黏剂。
2.如权利要求1所述的基于表面重建螺旋型铂铱酶电极的葡萄糖生物传感器，其特征在于，所述花瓣状的铂纳米粒子的粒径为100–500nm。
3.如权利要求1所述的基于表面重建螺旋型铂铱酶电极的葡萄糖生物传感器，其特征在于，所述铂铱线圈是经过酸处理的，其中所述酸是王水、浓盐酸或浓硫酸中的一种或其组合。
4.如权利要求1所述的基于表面重建螺旋型铂铱酶电极的葡萄糖生物传感器，其特征在于，所述环氧聚氨酯半透膜进一步包括双组份环氧胶黏剂。
5.制备表面重建螺旋型铂铱酶电极的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)螺旋型铂铱电极的制备
以医用铂铱丝为电极使用材料，沿着皮下注射针紧密盘旋缠绕5-8圈，获得紧密盘绕、质地均匀的铂铱线圈，并将纤维材料嵌入线圈内，制得螺旋型铂铱电极；
(2)螺旋型铂铱电极的表面腐蚀和电沉积铂纳米粒子
将步骤(1)中紧密缠绕的螺旋型铂铱电极剥离Teflon涂层部分后置于回流加热的酸中进行腐蚀，之后使用循环伏安法对电极进行清扫，然后将电极置于一定温度和pH值下的沉积液中，利用恒电位法在电极表面上沉积铂纳米粒子；
(3)螺旋型铂铱酶电极的制备
使用葡萄糖氧化酶溶液和环氧聚氨酯溶液(A)和(B)对步骤(2)中已沉积铂纳米粒子的螺旋型铂铱电极进行滴涂，形成对葡萄糖具有催化性能的表面重建螺旋型铂铱酶电极，
其中，所述葡萄糖氧化酶溶液是以4-6μL戊二醛为交联剂，将1.0-6.0mg葡萄糖氧化酶，10-15mg牛血清蛋白和300μL去离子水混合，并在摇床上使其均匀混合配制成的；
所述环氧聚氨酯溶液(A)是3-6mL四氢呋喃，25-30mg的聚氨酯，1mg十二烷基聚四氧乙烯醚和16-20mg双组份环氧胶黏剂的混合溶液；所述环氧聚氨酯溶液(B)是3-6mL四氢呋喃，90-95mg的聚氨酯和90-95mg双组份环氧胶黏剂的混合溶液；
其中所述葡萄糖氧化酶溶液的滴涂方法是：将已沉积铂纳米粒子的螺旋型铂铱电极垂直悬挂在可移动胶带上，用10μL的移液枪移取2-8μL所述葡萄糖氧化酶溶液滴涂到电极上，间隔30min后，再滴涂同样体积的葡萄糖氧化酶溶液，然后将上述滴涂过葡萄糖氧化酶溶液的螺旋型铂铱电极在室温下干燥1h；所述环氧聚氨酯溶液(A)和(B)的滴涂方法是：移取2-12μL环氧聚氨酯溶液(A)滴涂到上述干燥过的螺旋型铂铱电极的四周，移取1-3μL环氧聚氨酯溶液(B)涂覆在上述干燥过的螺旋型铂铱电极的螺旋线圈的首尾两端，然后将上述滴涂过环氧聚氨酯溶液(A)和(B)的螺旋型铂铱电极放置在室温下干燥30min，接着放置在80℃恒温干燥箱中固化20-60min，即得到表面重建螺旋型铂铱酶电极。
6.如权利要求5所述的制备表面重建螺旋型铂铱酶电极的方法，其特征在于，步骤(1)中所述纤维材料为医用棉花。
7.如权利要求5所述的制备表面重建螺旋型铂铱酶电极的方法，其特征在于，步骤(1)中所述皮下注射针为4.5-7号。
8.如权利要求5所述的制备表面重建螺旋型铂铱酶电极的方法，其特征在于，步骤(2)中所述酸是王水、浓盐酸或浓硫酸中的一种或其组合。
9.如权利要求5所述的制备表面重建螺旋型铂铱酶电极的方法，其特征在于，步骤(2)中回流加热的温度为180–240℃，螺旋型铂铱电极腐蚀的时间为0-60min。
10.如权利要求5所述的制备表面重建螺旋型铂铱酶电极的方法，其特征在于，步骤(2)中恒电位法电位设置为-0.2V，沉积液温度为30–70℃，pH值为4-7，在电极表面沉积铂纳米粒子时间为5-25min，沉积液为氯铂酸和电解质液的混合溶液，电解质液为硫酸、盐酸或氯化钾。
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