CN104316585A - 一种用于nadh电化学检测的复合电极及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于NADH电化学检测的复合电极及其制备方法，所述复合电极是在金电极表面上修饰一层DNA四面体-氨基化石墨烯复合膜而制得的金-DNA四面体-氨基化石墨烯复合电极。其制备方法包括以下步骤：DNA四面体自组装，其中三条单链DNA的5’端修饰了巯基；石墨烯溶液分散；复合电极的制备。本发明实现了对NADH的高灵敏度、高线性检测范围、低检测限的检测，降低NADH氧化电压效果明显，有效抑制了电极表面副反应的发生，真正实现了对NADH快捷、简易以及高效的检测。
Description
技术领域
本发明属于电化学检测领域，涉及一种电化学检测的复合电极，尤其涉及一种用于NADH电化学检测的复合电极及其制备方法。
背景技术
NADH是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)的还原形式，可以促进多糖、蛋白、核酸的合成和代谢，在增加物质转运和调控的同时，能活化生物体内多酶系统，改善代谢功能[1][2]。在癌症肿瘤方面，Qianru[3]研究发现，乳腺癌细胞中NADH的聚集浓度是正常乳腺细胞的1.8倍，两种细胞中自由NADH和酶联NADH的比率也不同。Weihong[4]研究推测NADH可能是肿瘤化疗过程中的重要调节剂。Brambilla[5]等研究发现有机物叔丁基过氧化氢可导致细胞功能损失，而线粒体内NADH能抑制线粒体膜电位下降，对线粒体功能起保护作用。Fernande[6]等研究表明，NADH在与铬反应形成相对稳定的铬-NADH复合物后，可以抑制需氧细胞在代谢过程中对一系列活性氧簇(reactive oxygenspecies,ROS)的产生，进而保护细胞免受重金属铬酸盐诱导的血红蛋白氧化和过氧化损伤。同时，研究表明，NADH在延缓轴突变性的方面发挥着重要的作用[7]，而轴突变形是神经退行性疾病发病的重要原因之一。在对帕金森综合征患者的研究中发现，患者脑内四氢生物喋呤和二氢喋呤还原酶明显减少，这样也为临床上将NADH用于细胞保护治疗提供了相应的理论基础[8]。此外，单位菌体胞内NADH含量恒定[9][10]，细菌菌数与NADH含量应呈正相关关系，诸如发酵过程细胞浓度及其生长代谢状态状况的各种参数等则可通过测定NADH来监测[11]。NADH的含量已经证实对包括癌症肿瘤、帕金森综合症在内的多种疾病以及细胞衰竭与死亡、单体细菌菌数等有直接相关性。因此，对细胞内NADH含量进行高灵敏度的检测将为相关重大疾病的早期诊断和相关细菌的监控提供新的途径。
华东理工大学杨弋等人申请了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸基因编码荧光探针及其制备方法和应用的专利(申请号：CN201110288807.6)，该申请公开了一种遗传编码的NADH荧光探针，其内含有对环境内NADH敏感的多肽和通过光谱性质的改变对环境内NADH进行表现的部分，可以实现对NADH、NAD+和NADH/NAD+比率的检测，但是所需设备庞大且价格昂贵；沈阳药科大学邸欣等人申请了一种γ-氨基丁酸转氨酶抑制剂的筛选方法的专利(申请号：CN201310073528.7)，该申请利用毛细管电泳技术，对γ-氨基丁酸转氨酶的酶联反应产物NADH定量分析，筛选出中药中具γ-氨基丁酸转氨酶抑制作用的活性组分，该技术对于NADH的检测方法快速但是灵敏度低；中国科学院长春应用化学研究所由天艳等人申请了钯纳米颗粒/碳纳米纤维复合物、制法及其在电催化的应用的专利(申请号：CN200910067537.9)，该申请涉及钯纳米颗粒/碳纳米纤维复合物、制法及其在电催化中的应用，该复合物对NADH检测的线性范围为0.2μm-716.6μm，检测限为0.2μm，检测便捷却未能降低NADH的氧化电压，检测限较高。
受DNA折纸技术的启发，本发明则尝试利用DNA构建三维空间结构，并通过引入巯基将该三维结构固定在金电极表面以增加电极有效接触面积，从而降低NADH的氧化电压。
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发明内容
本发明针对已有NADH检测技术的局限性，通过电化学检测的方式，搭建复合电极，利用传统“三电极”结构实现对NADH快捷、简易以及高效的检测。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种用于NADH电化学检测的复合电极，所述复合电极是在金电极表面上修饰一层DNA四面体-氨基化石墨烯复合膜而制得的金-DNA四面体-氨基化石墨烯复合电极；其中，所述DNA四面体-氨基化石墨烯复合膜是通过金-硫键固定在电极表面上的，该复合膜增加了电极的导电性。
本发明中所述DNA四面体是由四条单链DNA自组装而成，其中三条单链DNA的5’端修饰了巯基，组装成的四面体的三个顶点含有巯基，与金电极通过金-硫键键连，从而固定在电极表面上。
本发明中所述氨基化石墨烯是通过超声分散石墨烯溶液后离心沉降，得到与所述DNA四面体尺寸相适应的尺寸的氨基化石墨烯碎片。
如图1所示，本发明中所述DNA四面体-氨基化石墨烯复合膜是将合适尺寸的氨基化石墨烯碎片滴加在金电极-DNA四面体复合电极上，由于DNA带负电，氨基化石墨烯带正电，通过正负电荷相互吸引使得氨基化石墨烯碎片附着在DNA四面体间隙制备而成。
具体地，本发明提供的复合电极的制备方法包括以下步骤：
步骤一、DNA四面体自组装，其中三条单链DNA的5’端修饰了巯基；
步骤二、石墨烯溶液分散；
步骤三、复合电极的制备。
优选地，步骤一中所述DNA四面体的边长可以通过改变DNA碱基配对数来调整。优选地，所述DNA四面体为正四面体。
优选地，步骤一中所述自组装的方式为将四条DNA单链分别溶于缓冲液中，经95℃加热后迅速冷却到4℃，保持一段时间后获得DNA四面体溶液。其中，缓冲液优选为TCEP/TM缓冲液；95℃加热时间优选为2分钟，加热后优选为在30秒内冷却至4℃；在4℃保持的时间优选为10分钟以上。
优选地，步骤二中所述石墨烯为氨基化石墨烯TEPA粉末。
优选地，步骤二的具体操作方法为：将石墨烯粉末溶于去离子水中制成石墨烯溶液，用超声粉碎机超声粉碎，粉碎时间根据碎片尺寸的需要而定(图2-5显示了碎片尺寸随超声分散时间的变化)，然后离心，取上清液。其中，所述石墨烯溶液的浓度优选为0.25mg/mL；超声粉碎的时间优选为4-8小时；离心转速优选为3000r/min，离心时间优选为20分钟。
优选地，步骤三的电极制备过程为：将处理好的金电极浸泡在步骤一制得的四面体溶液中一段时间后取出，然后取一定体积的步骤二分散好的石墨烯溶液均匀滴加在金-DNA四面体复合电极上，静候一段时间，再次滴加石墨烯溶液，这样重复多次后，即完成金-DNA四面体-石墨烯复合电极的制备。
优选地，上述过程中金电极的处理方法为：先用氧化铝粉末打磨电极表面氧化层，然后将其浸泡在食人鱼溶液中一段时间后，用去离子水冲洗干净，然后在去离子水中超声清洗，再将电极浸泡在乙腈溶液中超声清洗，最后用循环伏安法在稀硫酸中扫描后取出。其中，所述氧化铝粉末优选为0.3μm，在食人鱼溶液中浸泡的时间优选为10分钟，稀硫酸的浓度优选为1mol/L；循环伏安法的扫描电压范围优选为0-1.5V，扫面速率优选为100mV/s，优选扫描20圈。
优选地，石墨烯溶液每次滴加在金-DNA四面体复合电极上体积为10μL，静候时间为15分钟，共滴加4次。
采用本发明的金-DNA四面体-氨基化石墨烯复合电极作为工作电极，铂片电极作为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极构成经典三电极结构可检测NADH的浓度。优选地，采用微分脉冲伏安法检测NADH的浓度。
本发明首创这种DNA四面体-氨基化石墨烯复合的有机/无机复合膜，将其修饰在金电极表面上，用该复合结构成功实现了对NADH的高灵敏度、高线性检测范围、低检测限的检测，同时复合结构对于降低NADH氧化电压效果明显，有效抑制了电极表面副反应的发生，真正实现了对NADH快捷、简易以及高效的检测。
借助微流控技术，可以将本发明的修饰工作电极的核心技术应用于微流控芯片上，可制成NADH检测芯片，实现对细胞内NADH含量的快速、便捷和高灵敏度的检测，为包括癌症肿瘤、帕金森综合症在内的多种疾病的早期诊断和相关细菌的检测提供有效途径。
附图说明
图1是本发明的技术原理示意图；
图2是超声分散4小时后得到的石墨烯碎片的电镜图；
图3是超声分散6小时后得到的石墨烯碎片的电镜图；
图4是超声分散8小时后得到的石墨烯碎片的电镜图；
图5是石墨烯碎片平均尺寸随超声分散时间的均值变化图；
图6是复合电极在不同浓度NADH溶液中的微分脉冲伏安法图(减去复合电极在PBS中的微分脉冲伏安法曲线)；其中，曲线a NADH浓度为10μM；曲线b NADH浓度为1μM；曲线c NADH浓度为100nM；曲线d NADH浓度为10nM；曲线e NADH浓度为1nM；曲线f NADH浓度为0.1nM；
图7是复合电极对NADH的检测性能线性拟合图；
图8是复合电极在PBS配制的1nM NADH中与用PBS稀释的细胞裂解液配制的1nM NADH中的微分脉冲伏安法图(减去复合电极在PBS中的微分脉冲伏安法曲线)。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1 复合电极的构建
步骤一、DNA四面体自组装
组成DNA四面体三维纳米结构的四条单链的碱基序列分别为：
A链：
5’-ACATTCCTAAGTCTGAAACATTACAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCATAGTA-3’
B链：
5’-HS-C6-TATCACCAGGCAGTTGACAGTGTAGCAAGCTGTAATAGATGCGAGGGTCCAATAC-3’
C链：
5’-HS-C6-TCAACTGCCTGGTGATAAAACGACACTACGTGGGAATCTACTATGGCGGCTCTTC-3’
D链：
5’-HS-C6-TTCAGACTTAGGAATGTGCTTCCCACGTAGTGTCGTTTGTATTGGACCCTCGCAT-3’
将4条DNA单链(ABCD)溶于TM缓冲液(20mM Tris，50mM MgCl2，pH8.0)，配置成100μM的50μL溶液，将上述4种单链溶液各取2μL，与37μL的TM缓冲液和5μL 30mM的TCEP溶液混合，振荡2分钟，然后在95℃加热2分钟并在30秒内迅速冷却到4℃，保持10min以上。
步骤二、石墨烯溶液分散
取5mg氨基化石墨烯TEPA(四氨基)粉末，溶于20mL去离子水中，配制0.25mg/mL氨基化石墨烯溶液，用超声粉碎机超声粉碎8小时，然后用转速3000r/min离心20分钟，取上清液。
步骤三、复合电极的制备
用0.3μm氧化铝粉末打磨金电极表面氧化层，直到电极表面如镜面般光滑。将物理打磨好的金工作电极浸泡在食人鱼溶液中10分钟后用去离子水冲洗干净，然后将电极浸泡在去离子水中，超声清洗5分钟后，再将电极浸泡在乙腈溶液中，超声清洗5分钟。最后，将处理好的电极置于1mol/L的稀硫酸中，采用循环伏安法，扫描电压范围0-1.5V，扫面速率100mV/s，扫描20圈，将成功打磨好的电极浸泡在0.25μM带巯基的DNA四面体溶液中，180分钟后取出，每次取10μL分散好的石墨烯溶液，均匀滴加在金-DNA四面体复合电极上，静候15min，共滴加4次，即可完成金-DNA四面体-石墨烯复合电极的搭建。
实施例2 复合电极对NADH检测
依次取10mL成功配制的0.1nM、1nM、100nM、1μM、10μM的NADH溶液作为电解液，用实施例1中成功搭建的金-DNA四面体-氨基化石墨烯复合电极作为工作电极，铂片电极作为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极构成经典三电极结构，采用微分脉冲伏安法，扫面电压范围为0-0.5V，比较分析所得微分脉冲伏安法曲线，结果如图6所示，复合电极成功将NADH的氧化电压降低至0.3V左右，极大减少了副反应的发生。取NADH浓度做横坐标，峰值电流做纵坐标，可得散点分布图如图7所示，做直线拟合后分析可知，金电极-DNA四面体-氨基化石墨烯复合电极对于NADH浓度的检测下限为0.1nM，上限为1μM，线性检测范围为1nM至1μM，灵敏度为0.226(μA/lg(CNADH)×cm2)。
实施例3
将实施例1中的复合电极置于用PBS稀释的细胞裂解液配制的1nM NADH中，用与实施例2同样的方法进行检测。由图8知，在模拟细胞环境中，复合电极对于NADH检测结果与在实验环境中结果一致，二者的微分脉冲伏安法图吻合，证明复合电极对于NADH的选择性良好，检测过程中不会受到常与NADH共存的干扰物的影响。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种用于NADH电化学检测的复合电极，其特征在于，所述复合电极是在金电极表面上修饰一层DNA四面体-氨基化石墨烯复合膜而制得的金-DNA四面体-氨基化石墨烯复合电极。
2.根据权利要求1所述的用于NADH电化学检测的复合电极，其特征在于，所述DNA四面体-氨基化石墨烯复合膜是通过金-硫键固定在金电极表面上的。
3.根据权利要求2所述的用于NADH电化学检测的复合电极，其特征在于：
所述DNA四面体是由四条单链DNA自组装而成，其中三条单链DNA的5’端修饰了巯基，组装成的四面体的三个顶点含有巯基；
所述氨基化石墨烯是通过超声分散石墨烯溶液后离心沉降，得到与所述DNA四面体尺寸相适应的尺寸的氨基化石墨烯碎片；
所述DNA四面体-氨基化石墨烯复合膜是将所述氨基化石墨烯碎片滴加在金电极-DNA四面体复合电极上，通过正负电荷相互吸引使得氨基化石墨烯碎片附着在DNA四面体间隙制备而成。
4.一种制备用于NADH电化学检测的复合电极的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、DNA四面体自组装，其中三条单链DNA的5’端修饰了巯基；
步骤二、石墨烯溶液分散；
步骤三、复合电极的制备。
5.根据权利要求4所述的制备用于NADH电化学检测的复合电极的方法，其特征在于，步骤一中所述DNA四面体的边长通过改变DNA碱基配对数来调整。
6.根据权利要求4所述的制备用于NADH电化学检测的复合电极的方法，其特征在于，步骤一中所述自组装的方式为将四条DNA单链分别溶于缓冲液中，经95℃加热后迅速冷却到4℃，保持一段时间后获得DNA四面体溶液。
7.根据权利要求4所述的制备用于NADH电化学检测的复合电极的方法，其特征在于，步骤二中所述石墨烯为氨基化石墨烯TEPA粉末。
8.根据权利要求4所述的制备用于NADH电化学检测的复合电极的方法，其特征在于，步骤二的具体操作方法为：将石墨烯粉末溶于去离子水中制成石墨烯溶液，用超声粉碎机超声粉碎，粉碎时间根据碎片尺寸的需要而定(图2-5显示了碎片尺寸随超声分散时间的变化)，然后离心，取上清液。
9.根据权利要求4所述的制备用于NADH电化学检测的复合电极的方法，其特征在于，步骤三的电极制备过程为：将处理好的金电极浸泡在步骤一制得的四面体溶液中一段时间后取出，然后取一定体积的步骤二分散好的石墨烯溶液均匀滴加在金-DNA四面体复合电极上，静候一段时间，再次滴加石墨烯溶液，这样重复多次后，即完成金-DNA四面体-石墨烯复合电极的制备。
10.一种检测NADH的电化学方法，其特征在于，采用权利要求1或2所述的金-DNA四面体-氨基化石墨烯复合电极作为工作电极，铂片电极作为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极构成经典三电极结构检测NADH的浓度。
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|---|---|
| CN104316585B (zh) | 2017-05-24 |
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