JP7037659B2

JP7037659B2 - Ｎａｄｈ測定のためのバイオセンサー用電極及びその製造方法

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Publication number: JP7037659B2
Application number: JP2020536849A
Authority: JP
Inventors: ギュホンイ，
Original assignee: コリアリサーチインスティテュートオブケミカルテクノロジー
Priority date: 2018-01-02
Filing date: 2018-12-28
Publication date: 2022-03-16
Anticipated expiration: 2038-12-28
Also published as: WO2019135556A1; US20210055251A1; KR102029957B1; CN111542751A; EP3736565A1; JP2021509719A; KR20190082599A; EP3736565A4; US11782010B2

Description

本発明は、バイオセンサー用電極およびその製造方法に関するもので、具体的にＮＡＤＨ（還元型ＮＡＤ、Ｒｅｄｕｃｅｄｆｏｒｍｏｆｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅａｄｅｎｉｎｅｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）測定用バイオセンサーのための電極及びその製造方法に関するものである。

バイオ技術の発展に伴い、より迅速かつ正確な分析技術に対する要求と必要性が徐々に増加している。このような、分析技術の中で最近、バイオセンサーに対する研究が多く進められている。特に、生物機能を模写して電子工学を応用することで、外部から受けた物理的、化学的刺激を感知することができる生命素子であるバイオセンサーへの需要が継続的に増加している。これらのバイオセンサーは、測定対象に対する選択性の面や、感度が非常に敏感で脚光を浴びている。

現在までバイオセンサーに対する多様な研究が進められているが、このようなバイオセンサーは、酵素、菌類及び動植物の組織などの生体物質を利用したものに分けられる。特定の分子を認識し、その濃度に比例して物理的、化学的変化を起こさせる部分、及びこれらの物質の化学変化を電気信号化する部位に変換する部分に分けられる。このような、バイオセンサーは特に、試料中の特定の分子を選択的に認識することができ、別途分離精製をする必要がないため、検出時間は非常に短く、精度が非常に高いというメリットが存在する。

電気化学基盤のバイオセンサーは電気化学的方法が持つ分析能力と生物学的な認識（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）の特異性（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を結合させたものだ。すなわち、酵素、抗原、抗体、生化学物質などの生物学的特異性を持つ物質（ｂｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃｒｅａｇｅｎｔ）を電極表面に固定させたり含有させることにより、生物学的認識現象を電流あるいは電位変化で検出する。このような電気化学基盤のバイオセンサーは、電極自体の抵抗と電気化学反応が起こる表面特性が非常に重要である。

一方、生命活動の中で必ず必要とされるＡＴＰ合成を担当する細胞の小器官であるミトコンドリアの恒常性を維持することは、生命活動の中で非常に重要であり、これに異常が発生した場合、代謝関連の障害及び脳卒症などの同時多発的な病気の原因となることができる。前記のミトコンドリアの機能を確認するために一般的に多く使われるのは、ミトコンドリア内の呼吸時に発生する補酵素に該当する。特に、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅＡｄｅｎｉｎｅＤｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ＮＡＤ）は細胞内で発見される重要な補酵素の一つで、細胞呼吸における該当過程とＴＣＡ回路に広く使われ、前記ＮＡＤの還元形態に該当するＮＡＤＨ（Ｒｅｄｕｃｅｄｆｏｒｍｏｆｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅａｄｅｎｉｎｅｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）に保存された還元潜在力は、電子伝達系を経てＡＴＰに変換されたり、同化反応に使用されたりする。

したがって、多くの研究がＮＡＤＨ反応の根本的な科学的適用に焦点を合わせているが、血中内のＮＡＤＨの測定は、従来の吸光法の場合には、干渉現象が非常に激しいため感度が低く、選択性が著しく低下し、試料の消費量が非常に多く、前処理の過程が複雑なため簡単に測定するのは難しい。それだけではなく、関連技術のＷＳＴ－１及びＭＴＴ（３－（４，５－Ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）－２，５－ＤｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍＢｒｏｍｉｄｅ）分析方法は、化学物質を投与した後、ＮＡＤＨ因子と発色反応を誘導して、特定の波長で吸光度を測定する方法に該当するが、このような方式は、多量の試料を必要とし、反応時間が長くかかり、分解能が優れないため、持続的及びリアルタイムモニタリングに適していない。また、電気化学的な方法でＮＡＤＨを測定するためには、酵素反応を誘導したり、電子伝達を活発にしてくれる触媒物質であるルテニウム、シアン化物イオンの媒体（ｍｅｄｉａｔｏｒ）を入れた後、ＮＡＤＨの酸化還元電流を測定するが、この場合、通常１０００ｍＶ以上の電圧値で酸化、還元が起こるので、電極の表面が損傷を受け、繰り返し測定が不可能であり、分解能が著しく減少するという欠点が存在する。

本発明者等は、バイオセンサー用電極の表面を４－アミノチオフェノール（４－ａｍｉｎｏｔｈｉｏｐｈｅｎｏｌ）に改質する過程において、循環電圧電流を加える段階で電圧を加えた際に浸漬させる溶液の濃度を異にする段階で製造することにより、改質効率を著しく向上させることができるだけでなく、高い感度及び選択性を持ち、数回再利用することができることを発見し、本発明を完成した。

本発明では、
ａ）電極を硫酸で洗浄する段階と、
ｂ）前記ａ）段階の電極を４－アミノチオフェノール（４－ａｍｉｎｏｔｈｉｏｐｈｅｎｏｌ；４－ＡＴＰ）に入れて培養した後、第１溶液に浸漬させた後に電圧を加える段階と、
ｃ）前記ｂ）段階の電極を第２溶液に浸漬させた後に電圧を加える段階と
を含むバイオセンサー用電極の製造方法を提供する。

本発明では、前記ｂ）段階の第１溶液は、モル濃度９０ｍＭ乃至１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒ；ＰＢＳ）であることができる。

また、本発明では、前記ｃ）段階の第２溶液は、モル濃度５ｍＭ乃至１５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒ；ＰＢＳ）であることができる。

本発明では、前記ｂ）及びｃ）段階で、電圧は循環電圧電流法（Ｃｙｃｌｉｃｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｙ）で加えることができる。

また、本発明では、前記のｂ）及びｃ）段階で、循環電圧電流法（Ｃｙｃｌｉｃｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｙ）は０．８Ｖ乃至－０．４Ｖ電位に変化（ｓｗｅｅｐ）させることができる。

また、本発明では、前記電極は、金、アルミニウム、白金、ニッケル、グラフェン、銀ナノワイヤーフィルム、金属グリッド、および酸化インジウムスズで構成された群から選択される１種以上であることができる。

本発明では、前記バイオセンサー用電極は、ＮＡＤＨ（Ｒｅｄｕｃｅｄｆｏｒｍｏｆｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅａｄｅｎｉｎｅｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を測定するためのものであることができる。

本発明に係る製造方法によるＮＡＤＨの測定のためのバイオセンサー用電極を提供する。

本発明に係る電極を含むバイオセンサーを提供する。

以下、本発明に係る前記ＮＡＤＨの測定のためのバイオセンサー用電極について詳しく説明する。

本発明の一実施例では、ａ）電極を硫酸で洗浄する段階と、ｂ）前記ａ）段階の電極を４－アミノチオフェノール（４－ａｍｉｎｏｔｈｉｏｐｈｅｎｏｌ、４－ＡＴＰ）に入れて培養した後、第１溶液に浸漬させた後に電圧を加える段階と、ｃ）前記ｂ）段階の電極を第２溶液に浸漬させた後に電圧を加える段階とを含むバイオセンサー用電極の製造方法を提供する。

本発明では、前記ａ）段階で電極を硫酸で洗浄する段階は、１時間乃至３時間であることができ、望ましくは２時間であるが、これらに限定されるものではない。前記電極を１時間未満、及び３時間を超えて洗浄する場合には、電極の表面のエッチング（Ｅｔｃｈｉｎｇ）が十分に行われない。

本発明では、前記バイオセンサー用電極は、ＮＡＤＨ（Ｒｅｄｕｃｅｄｆｏｒｍｏｆｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅａｄｅｎｉｎｅｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）の測定のためのものであることができる。

本発明では、前記「バイオセンサー（Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）」は、生物学的要素または分析物質と反応できる物質と物理化学的検出器を結合した分析のための装置であり、分析物質の探索に使用されることを意味する。敏感な生物学的要素、生物学的に分画したサンプルなどを工学的に設計することにより、分析対象物質との相互作用によって発生した信号をより簡単に測定し、定量化することができるように信号を変換する。本発明の目的上、前記分析物質と反応できる物質は、ＮＡＤＨ（Ｒｅｄｕｃｅｄｆｏｒｍｏｆｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅａｄｅｎｉｎｅｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を測定するためのＮ－フェニルキノンジイミン（Ｎ－ｐｈｅｎｙｌｑｕｉｎｏｎｅｄｉｉｍｉｎｅ）であることができる。

また、本発明では、前記ａ）段階において、前記硫酸は、モル濃度５ｍＭ乃至１５ｍＭであることができ、望ましくは１０ｍＭであることができるが、これらに限定されるものではない。硫酸のモル濃度が５ｍＭ未満及び１５ｍＭ超過の場合には、電極の表面を十分にエッチングすることができなかったり、電極が腐食されたりする恐れがある。

本発明では、前記「４－アミノチオフェノール（４－ａｍｉｎｏｔｈｉｏｐｈｅｎｏｌ；４－ＡＴＰ）」は、電極の表面に自発的に塗布され、規則的によく整列された有機分子膜の自己組織化単分子膜（Ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｅｄｍｏｎｏｌａｙｅｒ）を形成できる有機物質であり、ＮＡＤＨ酸化及び還元過程の際に発生する電子により、前記４－アミノチオフェノールＮＨ_２の状態が変化する過程を通じて、試料内のＮＡＤＨが含まれている程度を測定することができる。

本発明では、前記第１溶液及び第２溶液は、リン酸緩衝液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒ；ＰＢＳ）であることができる。本発明の目的上、前記第１溶液は、モル濃度９０ｍＭ乃至１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒ；ＰＢＳ）であることができ、前記第２溶液は、モル濃度５ｍＭ乃至１５ｍＭのリン酸緩衝液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒ；ＰＢＳ）であることができるが、これらに限定されるものではない。前記のように、第１溶液及び第２溶液のモル濃度を異にして電気重合反応を行う場合には、電流の流れが安定化されることを通じてＮ－フェニルキノンジイミンと電極の接触角が４８°から３９°に至るようにすることができるだけでなく、電極を最大２０回まで再利用することができる。また、本発明では、前記第１溶液のモル濃度が９０ｍＭ未満及び１００ｍＭ超過の場合には、十分なイミン（ｉｍｉｎｅ）が生成できず、前記第２溶液のモル濃度が５ｍＭ未満及び１５ｍＭ超過の場合には、接触角を本発明が目的とするように十分に減らすことができない。

本発明では、前記のようにＮ－フェニルキノンジイミンの接触角が減少する場合、電極の表面に結合できるＮ－フェニルキノンジイミンが著しく増加することにより、ＮＡＤＨとの反応が活発化し、これは電極の感度につながり、試料内のＮＡＤＨが極少量存在する場合にも検出できるという利点が存在する。

本発明では、前記「循環電圧電流法」は、電極表面でどのような反応が起こっているのかを直接に把握できる方法の一つであり、時間に比例して電位を変化させると、流れる電流を電流－電位曲線で記録する方法を何度も繰り返して電位走査することを意味する。本発明の目的上、前記ｂ）段階及びｃ）段階で電圧を加える段階は、循環電圧電流法（Ｃｙｃｌｉｃｖｏｔａｍｍｅｔｒｙ）によって行うことができ、望ましくは０．８乃至－０．４Ｖ電位に変化（Ｓｗｅｅｐ）する可能性があるが、これらに限定されるものではない。

本発明の一実施例において、本発明に係る前記電極は、金、アルミニウム、白金、ニッケル、グラフェン（ｇｒａｐｈｅｎｅ）、銀ナノワイヤーフィルム、炭素、金属グリッド及び酸化インジウムスズで構成された群から選択される１種以上であることができる。望ましくは、前記電極は金であるが、これに限定されるものではない。

本発明の他の実施例では、本発明に係る製造方法によって製造されたＮＡＤＨの測定のためのバイオセンサー用電極を提供する。

本発明の前記において、電極、バイオセンサー、循環電圧電流法、第１溶液及び第２溶液に関する内容は、前記製造方法で記載したことと重複し、以下の具体的な記載を省略する。

本発明の他の実施例では、本発明に係る前記電極を含むバイオセンサー（Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）を提供する。

本発明の前記バイオセンサーでは、電極、バイオセンサー、循環電圧電流法、第１溶液及び第２溶液に関する内容は、前記製造方法で記載したことと重複し、以下の具体的な記載を省略する。

本発明では、前記バイオセンサーは、本発明の目的上、ＮＡＤＨ（Ｒｅｄｕｃｅｄｆｏｒｍｏｆｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅａｄｅｎｉｎｅｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を測定するのにもっと適したものであることができる。

本発明の前記バイオセンサーは、本発明による前記電極以外に、一般的に、バイオセンサーに含まれるバイオ変換機、増幅器、加工機械及び画面を含む電子システムなどをさらに含むことができる。

本発明の一実施例では、前記バイオセンサーは、試料内に含まれているＮＡＤＨが酸化する過程で発生する電子を通じて、電極の表面に結合しているＮ－フェニルキノンジイミンのイミン（ｉｍｉｎｅ）をアミン（Ａｍｉｎｅ）に変換させた後、再びイミンに変換することによって発生する電子を測定して、定量化できる値に変換する過程を通じて、試料内のＮＡＤＨの値を測定することができる。前記のような測定方式により、本発明に係る製造方法によって製造された電極は、ｗｓｔ－１またはＭＴＴ分析方法のような発色反応を通じて、ミトコンドリア内にある脱水酵素との反応を通じてＮＡＤＨの酸化還元反応が測定される関連技術の場合、ミトコンドリアの完全な機能が前提とされるべきであったが、前記バイオセンサーの測定方式が酵素反応ではなく、１次反応に該当し、脱水酵素が必要ないため、細胞死の時に培養液（ｍｅｄｉａ）内に排出されるＮＡＤＨの定量的な測定を通じた細胞生存率の測定が可能となる。

図７は、本発明に係るバイオセンサーを使用した試料内のＮＡＤＨ測定プロセスの模式図を示したものであり、図面に基づいて以下具体的に説明する。

図７の（ａ）に示すように、血中内にＮＡＤＨが存在するかどうかを測定するために、目的とする対象の試料を抽出した後、別の試料前処理過程を経ずに、本発明に係る前記電極を含むバイオセンサーで放出される電子の量を測定し、これを定量化する過程を行うことができる。

また、図７の（ｂ）に示すように、細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）によって発生されるＮＡＤＨの量を測定するために、目的とする細胞の培養液（ｍｅｄｉａ）を、本発明に係る前記電極を含むバイオセンサーに投与した後、放出される電子の量を測定し、これを定量化する過程を実行して、細胞死（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）の程度を測定することができる。

本発明に係る前記製造方法によって製造された電極は、関連技術の電極に比べてＮ－フェニルキノンジアミンが結合した程度が著しく高く、試料内に含まれている少量のＮＡＤＨも測定することができる程度に感度が高く、前述した過程のように、別の試料の前処理過程を経なくても可能であるという長所が存在する。

本発明に係る方法によって製造された電極は、電気重合反応時、電流の流れが安定するだけでなく、接触角が著しく少なくなることにより、表面の改質効率を向上させることができた。また、このような過程を経て、バイオセンサーに使用される電極を数回再利用することができる。

また、本発明に係る前記電極をバイオセンサーに使用する場合には、干渉現象なしに感度及び選択性を維持することにより、極少量に該当する前処理を実行していない血液または血清（Ｓｅｒｕｍ）でも目的とする対象の測定が可能であり、持続的及びリアルタイムで細胞生存率の測定が可能であり、これを細胞毒性分野に適用できるという利点が存在する。また、ミトコンドリアの機能を喪失した死滅細胞から血清に分泌されたＮＡＤＨの測定を通じて細胞生存率の測定が可能である。

本発明の一実施形態に係る電極の改質された表面の模式図及び親水性の程度を測定した結果を示したものである。本発明の一実施形態に係る表面改質時に表示されるイミン（ｉｍｉｎｅ）の接触角を測定したグラフを示したものである。本発明の一実施形態に係るリン酸緩衝溶液の濃度による循環電圧電流の測定結果を示したものである。本発明の一実施形態に係る電極の表面をＳＥＭでイメージ解析を行った結果を示したものである。本発明の一実施形態に係る電極の表面をＳＥＭでイメージ解析を行った結果を示したものである。本発明の一実施形態に係る電極を用いた濃度別のＮＡＤＨ測定値を示したものである。（ａ）と（ｂ）は、本発明の一実施形態に係るＮＡＤＨ測定用バイオセンサーを用いたＮＡＤＨ測定プロセスの模式図を示したものである。

以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。これらの実施例は、ただ本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨に基づいて、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されないということは、当業界で通常の知識を有する者にとって自明である。

［製造例］ＮＡＤＨの測定のためのバイオセンサー用電極の製造

ＮＡＤＨの測定のためのバイオセンサーに適した電極を下記の段階を行い、製造した。

金（Ａｕ）電極をモル濃度１０ｍＭに該当する硫酸（Ｈ_２ＳＯ_４）を用いて洗浄した。その後、自己組織化単分子膜形成のために前記電極をモル濃度１０ｍＭに調製された４－アミノチオフェノール（４－ａｍｉｎｏｔｈｉｏｐｈｅｎｏｌ）に浸漬させた後、２時間の間培養した。その後、モル濃度１００ｍＭ（高濃度）のリン酸緩衝溶液に前記電極を浸漬させ、循環電圧電流（Ｃｙｃｌｉｖｏｌｔａｍｅｔｒｙ）０．８Ｖから－０．４Ｖ電位に電圧を変化（Ｓｗｅｅｐ）させる過程を通じてＮ－フェニルキノンジイミン（Ｎ－ｐｈｅｎｙｌｑｕｉｎｏｎｅｄｉｉｍｉｎｅ、以下「ＮＰＱＤ」という。）を形成した。前記ＮＰＱＤが形成された電極をモル濃度１０ｍＭ（低濃度）のリン酸緩衝溶液に浸漬させた後、前記１００ｍＭのリン酸緩衝溶液でＮＰＱＤを形成する段階と同じ電圧を加え、再び電圧を変化（Ｓｗｅｅｐ）させる過程を行い、最終的に、本発明に係る電極を製造した。

［比較例］電極製造

前記製造例と比較するために、高濃度のリン酸緩衝溶液のみを用いて電極表面を改質する過程を行った。具体的には、金（Ａｕ）電極をモル濃度１０ｍＭに該当する硫酸（Ｈ_２ＳＯ_４）を用いて洗浄した。その後、自己組織化単分子膜形成のために前記電極をモル濃度１０ｍＭに調製された４－アミノチオフェノール（４－ａｍｉｎｏｔｈｉｏｐｈｅｎｏｌ）に浸漬させた後、２時間の間培養した。その後、モル濃度１００ｍＭ（高濃度）のリン酸緩衝溶液に前記電極を浸漬させ、循環電圧電流（Ｃｙｃｌｉｖｏｌｔａｍｅｔｒｙ）０．８Ｖから－０．４Ｖ電位に電圧を変化（Ｓｗｅｅｐ）させる過程を通じてＮＰＱＤを形成した。

［実施例１］４－アミノチオフェノール（４－ａｍｉｎｏｔｈｉｏｐｈｅｎｏｌ；４－ＡＴＰ）の接触角測定

前記製造例による電極の表面に形成されたＮＰＱＤの接触角の変化を確認した。具体的には、常温（ＲｏｏｍＴｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）、４６％の湿度条件で、前記製造例の電極の上に１０μｌの蒸留水（ＤｉｓｔｉｌｌｅｄＷａｔｅｒ）を落とした後、それぞれの電極の写真を撮影して、ＩＭＡＧＥＪソフトウェアを通じてメーカーが提供する方法で接触角測定分析を行い、その結果を図１および図２に示した。

図１及び図２に示すように、製造例の表面に結合しているＮＰＱＤが、表面にさらに多くの量が結合し、これにより、電極の表面がより親水性に変換されたことが分かった。特に、図２に示すように、比較例は、４－アミノチオフェノールのみを結合させた場合とその接触角の変化がほとんどない反面、製造例の場合、接触角が５５°から３９°に著しく低くなった。

前記結果を通じて、本発明に係る製造例は、高濃度及び低濃度のリン酸緩衝溶液との二段階の反応を通じてＮＰＱＤの接触角を著しく下げ、表面を親水化することができることがわかった。

［実施例２］電流値の安定化可否の測定比較

高濃度のリン酸緩衝溶液（１００ｍＭ）及び低濃度のリン酸緩衝溶液（１０ｍＭ）の電流値安定化可否を比較するために、ＣＨ１０４０Ｃシリーズのマルチポテンショスタット装置を用いて、電気化学的な分析をメーカーが提供するプロトコルによって行い、その結果を図３に示した。

図３に示すように、高濃度のリン酸緩衝溶液では比較的測定された電流値が不安定だったのに対して、低濃度に該当する１０ｍＭのリン酸緩衝溶液では、その電流値が非常に安定したグラフを示す。

前記結果から、本発明に係る製造例の製造時に、高濃度及び低濃度の条件で段階を異にして重合反応を行うことが電流値の安定化をもたらすことがわかる。

［実施例３］電極表面の測定

製造例及び比較例を含むバイオセンサーで、ＮＡＤＨを複数回測定した際、電極表面の変化を走査電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＳＥＭ）で測定し、その結果を図４及び図５に示した。ただし、電極は、走査電子顕微鏡の測定のために、１０ｎｍの厚さでスパッタ（ｓｐｕｔｔｅｒ）過程を実施した。

また、バイオセンサーを用いたＮＡＤＨの測定は、ＮＡＤＨが含まれている試料サンプルをバイオセンサーに投入させた後、－６００ｍＶの電圧を１０秒間かけて発生する電流の最終値を測定する過程で行われた。

図４に示すように、比較例は、基準電極（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｅｌｅｃｔｒｏｄｅ；ＲＥ）及び作用電極（Ｗｏｒｋｉｎｇｅｌｅｃｔｒｏｄｅ；ＷＥ）の部位の両方でＮＰＱＤがよく生成されていることが分かったが、２０回再利用した後に測定した場合、基準電極及び作用電極部位の両方で、ＮＡＤＨの測定に多数使用された場合、表面が急激に変質した。

一方、図５に示すように、製造例の場合、基準電極及び作用電極部位の両方でＮＰＱＤがうまく生成されただけでなく、２０回再利用した後に測定しても、表面の変質程度が著しく低かった。

前記結果から、本発明に係る製造例の電極は、バイオセンサーに適用された場合、測定に多数回再使用できることがわかる。

［実施例４］ＮＡＤＨ感度の測定結果

製造例及び比較例のＮＡＤＨの測定感度を比較するために、前記実施例３の方法と同じ方法を使用して、試料内のＮＡＤＨを測定し、その結果を図６に示した。

図６に示すように、製造例の場合、１００μＭのＮＡＤＨ測定値が約１４０％であるのに対し、比較例は、１１０％に該当する値が測定され、１４０μＭのＮＡＤＨ測定値が製造例の場合、約１５５％であるのに対し、比較例の場合、著しく低い程度の約１２０％で測定された。

前記結果から、本発明に係る製造例を電極として使用してＮＡＤＨを測定する場合には、比較例に比べて感度が著しく高いことがわかる。

以上、本発明について詳細に説明したが、本発明の権利範囲はこれに限定されるものではなく、請求の範囲に記載された本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で多様な修正及び変形が可能であることは、当技術分野の通常の知識を有する者には自明のことである。

Claims

ａ）電極を硫酸で洗浄する段階と、
ｂ）上記ａ）段階を経た電極を４－アミノチオフェノール（４－ａｍｉｎｏｔｈｉｏｐｈｅｎｏｌ；４－ＡＴＰ）と反応させた後、モル濃度９０ｍＭ乃至１００ｍＭのリン酸緩衝溶液である第１溶液に浸漬させた後に循環電圧電流法（Ｃｙｃｌｉｃｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｙ）で電圧を加える段階と、
ｃ）上記ｂ）段階を経た電極をモル濃度５ｍＭ乃至１５ｍＭのリン酸緩衝溶液である第２溶液に浸漬させた後に循環電圧電流法（Ｃｙｃｌｉｃｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｙ）で電圧を加える段階とを含む
ＮＡＤＨ（Ｒｅｄｕｃｅｄｆｏｒｍｏｆｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅａｄｅｎｉｎｅｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を測定するためのバイオセンサー用電極の製造方法。
上記ｂ）及びｃ）段階で、循環電圧電流法（Ｃｙｃｌｉｃｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｙ）は０．８乃至－０．４Ｖ電位に変化（ｓｗｅｅｐ）させることを特徴とする請求項１に記載の電極の製造方法。
上記電極は、金、アルミニウム、白金、ニッケル、グラフェン、銀ナノワイヤーフィルム、金属グリッド、炭素、および酸化インジウムスズで構成された群から選択される１種以上であることを特徴とする請求項１または２に記載の電極の製造方法。