KR20190082599A

KR20190082599A - Nadh 측정을 위한 바이오센서용 전극 및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR20190082599A
Application number: KR1020180000408A
Authority: KR
Inventors: 이규홍
Original assignee: 한국화학연구원
Priority date: 2018-01-02
Filing date: 2018-01-02
Publication date: 2019-07-10
Also published as: US11782010B2; EP3736565A1; JP7037659B2; JP2021509719A; CN111542751A; WO2019135556A1; EP3736565A4; US20210055251A1; KR102029957B1

Abstract

본 발명은 NADH 측정용 바이오센서를 위한 전극 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 전극은 전기중합반응 시에 전류의 흐름이 안정되고, 개질된 물질의 접촉각을 현저하게 작게 만들어 표면의 개질 효율을 높이고, 수회 재사용할 수 있다는 장점이 존재한다. 또한, 본 발명의 상기 전극을 NADH 측정용 바이오센서에 적용하는 경우 간섭현상 없이 민감도 및 선택성을 높은 수준으로 유지함으로써, 극소량의 측정 물질이 존재하여 전처리 과정을 반드시 필요로 하는 혈액 또는 혈청(serum)에서도 목적하는 대상의 측정이 용이하다. 또한, 상기 전극을 NADH 측정용 바이오센서에 적용하는 경우 지속적 및 실시간의 세포 생존도 측정이 가능하여 세포 독성 평가 분야에 활용할 수 있고, 미토콘드리아 기능을 상실한 사멸 세포에서의 세포 생존도 측정을 가능하게 할 수 있다.

Description

NADH 측정을 위한 바이오센서용 전극 및 그의 제조방법{ELECTRODE FOR BIOSENSOR FOR NADH MEASURMENT AND MANUFACTURING METHOD THEREOF}

본 발명은 바이오센서용 전극 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 NADH (환원형 NAD, Reduced form of nicotinamide adenine dinucleotide) 측정용 바이오센서를 위한 전극 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

바이오 기술이 발전함에 따라, 보다 신속하고 정확한 분석 기술에 대한 요구와 필요성이 점차 증가하고 있다. 이러한, 분석 기술 중 최근 바이오센서에 대한 연구가 많이 진행되고 있다. 특히, 생물 기능을 모사하여 전자 공학을 응용함으로써, 외부로부터 받은 물리, 화학적 자극을 감지할 수 있는 생명소자인 바이오센서에 대한 수요가 지속적으로 증가하고 있다. 이러한 바이오센서는 측정 대상에 대한 선택성 면이나, 감도가 매우 민감하여 각광받고 있다.

현재까지 바이오센서에 대한 다양한 연구가 진행되고 있는데, 이런 바이오센서는 효소, 균류 및 동식물의 조직 등 생체 물질을 이용한 것으로 나뉘어볼 수 있다. 특정 분자를 인식하고, 그 농도에 비례하여 물리, 화학적 변화를 일으키게 하는 부분 및 이들 물질의 화학 변화를 전기 신호화하는 부위로 변환하는 부분으로 나뉘어 볼 수 있다. 이러한, 바이오센서는 특히, 시료 속의 특정 분자를 선택적으로 인식할 수 있으며, 별도로 분리 정제를 하지 않아도 되기 때문에 검출 시간이 매우 짧으며 정확도가 매우 높다는 장점이 존재한다.

전기 화학 기반의 바이오센서는 전기 화학적 방법이 지니는 분석 능력과 생물학적인 인식(biological recognition)의 특이성(specificity)을 결합시킨 것이다. 즉, 효소, 항원, 항체, 생화학 물질 등의 생물학적 특이성을 지니는 물질 (biospecific reagent)을 전극 표면에 고정시키거나 함유하게 함으로써, 생물학적 인식 현상을 전류 혹은 전위 변화로 검출한다. 이러한 전기 화학 기반의 바이오센서는 전극 자체의 저항과 전기 화학 반응이 일어나는 표면 특성이 매우 중요하다.

한편, 생명활동 중 반드시 필요로 하는 ATP 합성을 담당하는 세포의 소기관인 미토콘드리아의 항상성을 유지하는 것은 생명 활동 내에서 매우 중요하며, 이에 이상이 발생하는 경우 대사 관련 장애 및 뇌졸증 등의 동시다발적인 질병을 유발할 수 있다. 상기 미토콘드리아의 기능을 확인하기 위하여 일반적으로 많이 사용되는 것은 미토콘드리아 내 호흡 시 발생되는 조효소에 해당한다. 특히, 니코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드(Nicotinamide Adenine Dinucleotide, NAD)는 세포내에서 발견되는 중요한 조효소 중 하나로, 세포 호흡에서의 해당과정과 TCA회로에 널리 쓰이며, 상기 NAD의 환원 형태에 해당하는NADH(Reduced form of nicotinamide adenine dinucleotide)에 저장된 환원 잠재력은 전자전달계를 거치면서 ATP로 전환되거나, 동화반응에 사용된다.

따라서, 많은 연구들이 NADH 반응의 근본적인 과학적 적용에 초점을 맞추고 있으나, 혈중 내 NADH 측정은 기존 흡광법의 경우 간섭 현상이 매우 심하여 민감도가 낮고, 선택성이 현저하게 떨어지고, 시료의 소모량이 매우 많으며, 선 처리 과정이 복잡하기 때문에 간편한 측정하기 어렵다. 뿐만 아니라, 관련 기술의 WST-1 및 MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) 분석 방법은 화학물질을 투여한 뒤, NADH 인자와 발색 반응을 유도하여 특정 파장에서 흡광도를 측정하는 방식에 해당하나, 이러한 방식은 다량의 시료를 요구하고, 반응 시간이 오래 걸리며, 분해능이 뛰어나지 않아 지속적 및 실시간의 모니터링에 적합하지 않다. 또한, 전기화학적인 방법으로 NADH 를 측정하기 위해서는 효소 반응을 유도하거나, 전자전달을 활발히 해주는 촉매물질인 루데늄, 시안화나이드 이온의 매개체(mediator)를 넣어준 뒤, NADH의 산화 환원 전류를 측정하지만, 이경우 보통 1000 mV 이상의 전압값에서 산화, 환원이 일어나기 때문에 전극 표면이 손상을 입게 되어 반복적인 측정이 불가능하고, 분해능이 현저하게 감소한다는 단점이 존재한다.

본 발명자들은 바이오센서용 전극의 표면을 4-아미노싸이오페놀(4-aminothiophenol)로 개질하는 과정에 있어, 순환전압전류를 가하는 단계에서 전압을 가할 때 침지 시키는 용액의 농도를 달리하는 단계로 제조함으로써, 개질 효율을 현저하게 높일 수 있을 뿐만 아니라, 높은 민감도 및 선택성을 갖고, 수회 재사용 할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명에서,

a) 전극을 황산으로 세척하는 단계;

b) 상기 a) 단계의 전극을 4-아미노싸이오페놀(4-aminothiophenol; 4-ATP)에 넣고 배양한 뒤, 제1 용액에 침지시켜 전압을 가하는 단계; 및

c) 상기 b) 단계의 전극을 제2 용액에 침지시켜 전압을 가하는 단계를 포함하는 바이오센서용 전극 제조방법을 제공한다.

본 발명에서, 상기 b) 단계의 제1 용액은 인산완충액(phosphate buffer; PBS) 몰농도 90 mM 내지 100 mM인 것일 수 있다.

또한, 본 발명에서, 상기 c) 단계의 제2 용액은 인산완충액(phosphate buffer; PBS) 몰농도 5 mM 내지 15 mM인 것일 수 있다.

본 발명에서, 상기 b) 및 c) 단계에서 전압은 순환전압전류법(Cyclic votammetry)으로 가하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명에서, 상기 b) 및 c) 단계에서 순환전압전류법(Cyclic votammetry)으로 0.8 V 내지 -0.4 V 전위로 변화(sweep)하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명에서, 상기 전극은 금, 알루미늄, 백금, 니켈, 그래핀, 은 나노와이어 필름, 금속 그리드, 및 인듐주석산화물으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.

본 발명에서, 상기 바이오센서용 전극은 NADH(Reduced form of nicotinamide adenine dinucleotide) 측정을 위한 것일 수 있다.

본 발명에 따른 제조방법에 의한 NADH 측정을 위한 바이오센서용 전극을 제공한다.

본 발명에 따른 전극을 포함하는 바이오센서를 제공한다.

이하, 본 발명에 따른 상기 NADH 측정을 위한 바이오센서용 전극에 대해 자세히 설명한다.

본 발명의 일 구현 예에서는 a) 전극을 황산으로 세척하는 단계; b) 상기 a) 단계의 전극을 4-아미노싸이오페놀(4-aminothiophenol; 4-ATP)에 넣고 배양한 뒤, 제1 용액에 침지시킨 뒤 전압을 가하는 단계; 및 c) 상기 b) 단계의 전극을 제2 용액에 침지시킨 뒤 전압을 가하는 단계를 포함하는 바이오센서용 전극 제조방법을 제공한다.

본 발명에서, 상기 a) 단계에서 전극을 황산으로 세척하는 단계는 1시간 내지 3시간 일 수 있고, 바람직하게는 2시간 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 전극을 1시간 미만 및 3시간 초과로 세척하는 경우, 전극의 표면의 식각(Etching)이 충분히 이루어질 수 없다.

본 발명에서, 상기 "바이오센서(Biosensor)"는 생물학적 요소 또는 분석 물질과 반응할 수 있는 물질과 물리화학적 탐지기를 결합한 분석을 위한 장치로, 분석물질의 탐색에 사용되는 것을 의미한다. 민감한 생물학적 요소, 생물학적으로 분획한 샘플 등을 공학적으로 설계함으로써, 분석 대상 물질과의 상호작용에 의해 발생한 신호를 더 쉽게 측정하고 정량화할 수 있도록 신호를 변환한다. 본 발명의 목적상 상기 분석 물질과 반응할 수 있는 물질은 NADH(Reduced form of nicotinamide adenine dinucleotide)을 측정하기 위한 N-페닐퀴논 디이민(N-phenylquinone diimine)일 수 있다.

또한, 본 발명에서, 상기 a) 단계에서 상기 황산은 몰농도 5 mM 내지 15 mM일 수 있고, 바람직하게는 10 mM 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 황산의 몰농도가 5 mM 미만 및 15 mM 초과인 경우에는 전극의 표면이 충분히 삭각 될 수 없거나 전극이 부식될 수 있다.

본 발명에서, 상기 "4-아미노싸이오페놀(4-aminothiophenol; 4-ATP)"은 전극의 표면에 자발적으로 입혀진 규칙적으로 잘 정렬된 유기 분자막인 자가조립막(Self-assembled monolayer)이 형성될 수 있는 유기물질로, NADH 산화 및 환원 과정 시에 발생되는 전자에 의해 상기 4-아미노싸이오페놀의 NH₂의 상태가 변화 하는 과정을 통해 시료 내 NADH가 포함되어 있는 정도를 측정할 수 있다.

본 발명에서, 상기 제1 용액 및 제2 용액은 인산완충액(phosphate buffer; PBS)일 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 제1 용액은 인산완충액(phosphate buffer; PBS) 몰농도 90 mM 내지 100 mM일 수 있고, 상기 제2 용액은 인산완충액(phosphate buffer; PBS) 몰농도 5 mM 내지 15 mM일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기와 같이, 제1 용액 및 제2 용액의 몰농도를 달리하여 전기중합반응을 수행하는 경우에는 전류의 흐름이 안정화되는 것을 통해 N-페닐퀴논 디이민과 전극의 접촉각이 48ㅀ에서 39ㅀ에 이를 수 있도록 할 수 있을 뿐만 아니라, 전극을 최대 20회 까지 재사용 할 수 있다. 또한, 본 발명에서, 상기 제1 용액의 몰농도가 90 mM 미만 및 100 mM 초과인 경우에는 충분히 이민(imine)이 생성될 수 없고, 상기 제2 용액의 몰농도가 5 mM 미만 및 15 mM 초과인 경우에는 접촉각을 본 발명이 목적하는 바와 같이 충분히 줄어들게 할 수 없다.

본 발명에서, 상기와 같이 N-페닐퀴논 디이민의 접촉각이 줄어드는 경우 전극 표면에 결합될 수 있는 N-페닐퀴논 디이민이 현저하게 증가함으로써, NADH와의 반응이 활발해지고 이는 전극의 민감도로 이어져 시료 내 NADH가 극소량 존재하는 경우에도 검출할 수 있다는 장점이 존재한다.

본 발명에서, 상기 "순환전압전류법"은 전극표면에서 어떠한 반응이 일어나고 있는가를 직접적으로 파악할 수 있는 방법 중에 하나로, 시간에 비례하여 전위를 변화시킬 때, 흐르는 전류를 전류-전위 곡선으로 기록하는 방법을 여러번 반복해서 전위 주사하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 b) 단계 및 c) 단계에서 전압을 가하는 단계는 순환전압전류법(Cyclic votammetry)으로 수행되는 것일 수 있고, 바람직하게는 0.8 내지 -0.4 V 전위로 변화(Sweep)하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체 예에서, 본 발명에 따른 상기 전극은 금, 알루미늄, 백금, 니켈, 그래핀(graphene), 은 나노와이어 필름, 탄소, 금속 그리드 및 인듐주석산화물로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 전극은 금일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 구현 예에서는 본 발명에 따른 제조방법에 의해 제조된 NADH 측정을 위한 바이오센서용 전극을 제공한다.

본 발명의 상기 에서 전극, 바이오센서, 순환전압전류법, 제1 용액 및 제2 용액에 관한 내용은 상기 제조방법에서 기재한 바와 중복되어, 이하 구체적인 기재를 생략한다.

본 발명의 또 다른 구현 예에서는 본 발명에 따른 상기 전극을 포함하는 바이오센서(Biosensor)를 제공한다.

본 발명의 상기 바이오센서에서 전극, 바이오센서, 순환전압전류법, 제1 용액 및 제2 용액에 관한 내용은 상기 제조방법에서 기재한 바와 중복되어, 이하 구체적인 기재를 생략한다.

본 발명에서, 상기 바이오센서는 본 발명의 목적상 NADH(Reduced form of nicotinamide adenine dinucleotide)를 측정하는데 보다 적합한 것일 수 있다.

본 발명의 상기 바이오센서는 본 발명에 따른 상기 전극 이외에, 일반적으로 바이오센서에 포함될 수 있는 바이오변환기, 증폭기, 가공기계 및 화면을 포함한 전자 시스템 등을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체 예에서 상기 바이오 센서는 시료 내 포함되어 있는 NADH가 산화되는 과정에 발생되는 전자를 통해 전극의 표면에 결합되어 있는 N-페닐퀴논디이민의 이민(imine)을 아민(Amine)으로 변환시킨 뒤, 다시 이민으로 변환되면서 발생되는 전자를 측정하여 정량화 할 수 있는 값으로 변경하는 과정을 통하여 시료 내 NADH 값을 측정할 수 있다. 상기와 같은 측정 방식에 의해, 본 발명에 따른 제조방법에 의해 제조된 전극은 wst-1 또는 MTT 분석 방법과 같은 발색 반응을 통해 미토콘드리아 내부에 있는 탈수 효소와의 반응을 통해 NADH의 산화 환원 반응이 측정되는 관련 기술의 경우 미토콘드리아의 온전한 기능이 전제가 되어야 하였으나, 상기 바이오센서의 측정 방식이 효소 반응이 아닌 1차 반응에 해당하여 탈수효소가 필요 없으므로, 세포 사멸 시 배양액(media)내로 배출되는 NADH의 정량적인 측정을 통한 세포 생존도의 측정이 가능할 수 있다.

도 7은 본 발명에 따른 바이오 센서를 사용한 시료 내 NADH 측정 과정의 모식도를 나타낸 것으로, 도면을 기준으로 이하 구체적으로 설명한다.

도 7의 (a)에 나타난 바와 같이, 혈중 내 NADH 존재 여부를 측정하기 위하여, 목적하는 대상의 시료를 추출한 뒤, 별도의 시료 전 처리 과정을 거치지 않고 본 발명에 따른 상기 전극을 포함하는 바이오센서로 방출되는 전자의 양을 측정하여 이를 정량화 하는 과정을 수행할 수 있다.

또한, 도 7의 (b)에 나타난 바와 같이, 세포 사멸(apoptosis)에 따라 발생되는 NADH 양을 측정하기 위하여, 목적하는 세포의 배양액(media)을 본 발명에 따른 상기 전극을 포함하는 바이오센서에 투여한 뒤, 방출되는 전자의 양을 측정하여 이를 정량화 하는 과정을 수행하여 세포 사멸(apoptosis) 정도를 측정할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 제조방법에 의해 제조된 전극은 관련 기술의 전극에 비하여 N-페닐퀴논디아민이 결합된 정도가 현저하게 높아 시료 내 포함되어 있는 적은 양의 NADH도 측정할 수 있을 정도로 민감도가 높아, 앞서 언급한 과정과 같이 별도의 시료 전 처리 과정을 거치지 아니하고도 가능하다는 장점이 존재한다.

본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 전극은 전기중합반응 시, 전류의 흐름이 안정화될 뿐만 아니라, 접촉각이 현저하게 적어짐으로써 표면의 개질 효율을 높일 수 있었다. 또한, 이와 같은 과정을 통해 바이오센서에 사용되는 전극을 수회 재사용 할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 상기 전극을 바이오센서에 사용하는 경우, 간섭현상 없이 민감도 및 선택성을 유지함으로써, 극소량에 해당하는 전처리 과정을 수행하지 않은 혈액 또는 혈청(Serum)에서도 목적하는 대상의 측정이 가능하고, 지속적 및 실시간으로 세포 생존도의 측정이 가능하며, 이를 세포 독성 분야에 적용 가능할 수 있다는 장점이 존재한다. 또한, 미토콘드리아의 기능을 상실한 사멸된 세포에서 혈청으로 분비된 NADH의 측정을 통해 세포 생존도의 측정이 가능하다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 전극의 개질된 표면의 모식도 및 친수성 정도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 표면 개질 시 나타나는 이민(imine)의 접촉각을 측정한 그래프를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 인산완충용액의 농도에 따른 순환전압전류 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 전극의 표면을 SEM으로 이미지 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 전극의 표면을 SEM으로 이미지 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 전극을 이용한 농도별 NADH 측정값을 나타낸 것이다.
도 7의 (a) 및 (b)는 본 발명의 일 실시예에 따른 NADH 측정용 바이오센서를 이용한 NADH 측정 과정의 모식도를 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

[제조예] NADH 측정을 위한 바이오센서용 전극 제조

NADH 측정을 위한 바이오센서에 적합한 전극을 하기 단계를 수행하여 전극을 제조하였다.

금(Au) 전극을 몰농도 10 mM에 해당하는 황산(H₂SO₄)을 이용하여 세척하였다. 그 뒤, 자가조립막 형성을 위하여 상기 전극을 몰농도 10 mM으로 제조된 4-아미노싸이오페놀(4-aminothiophenol)에 침지시킨 뒤, 2시간 동안 배양하였다. 그 후, 인산완충용액 몰농도 100 mM(고농도)에 상기 전극을 침지시키고 순환전압전류(Cyclivoltametry) 0.8 V 에서 -0.4 V 전위로 전압을 변화(Sweep)시키는 과정을 통해 N-페닐퀴논 디이민(N-phenylquinone diimine, 이하 'NPQD'라 함)을 형성하였다. 상기 NPQD가 형성된 전극을 인산완충용액 몰농도 10 mM(저농도)에 침지시킨 뒤, 상기 100 mM의 인산완충용액에서 NPQD를 형성하는 단계와 동일한 전압을 가하여 다시 한번 전압을 변화(Sweep)시키는 과정을 수행하여 최종적으로 본 발명에 따른 전극을 제조하였다.

[비교예] 전극 제조

상기 제조예와의 비교를 위하여, 고농도의 인산완충용액만을 이용하여 전극 표면을 개질하는 과정을 수행하였다. 구체적으로, 금(Au) 전극을 몰농도 10 mM에 해당하는 황산(H₂SO₄)을 이용하여 세척한다. 그 뒤, 자가조립막 형성을 위하여 상기 전극을 몰농도 10 mM으로 제조된 4-아미노싸이오페놀(4-aminothiophenol)에 침지시킨 뒤, 2시간 동안 배양하였다. 그 후, 인산완충용액 몰농도 100 mM(고농도)에 상기 전극을 침지시키고 순환전압전류(Cyclivoltametry) 0.8 V 에서 -0.4 V 전위로 전압을 변화(Sweep)시키는 과정을 통해 NPQD를 형성하였다.

[실시예 1] 4-아미노싸이오페놀(4-aminothiophenol; 4-ATP) 접촉각 측정

상기 제조예에 따른 전극의 표면에 형성된 NPQD의 접촉각의 변화를 확인하였다. 구체적으로, 실온(Room Temperature), 46%의 습도 조건에서 상기 제조예의 전극 위에 10 ㎕ DI 물(Distilled Water)을 떨어뜨린 후, 각각의 전극을 사진을 촬영하고 IMAGE J 소프트웨어를 통해 제조사에서 제공하는 방법으로 접촉각 측정 분석을 수행하여, 그 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다.

도 1 및 도 2에서 보는 바와 같이, 제조예의 표면에 결합되어 있는 NPQD가 표면에 더 많은 양이 결합될 수 있었으며, 이를 통해 전극의 표면이 더욱 친수성으로 변환된 것을 알 수 있다. 특히, 도 2에서 보는 바와 같이, 비교예는 4-아미노싸이오페놀만을 결합 시킨 경우와 그 접촉각의 변화가 거의 없는 반면, 제조예의 경우 접촉각이 55°에서 39°로 현저하게 낮아졌다.

상기 결과를 통해 본 발명에 따른 제조예는 고농도 및 저농도의 인산완충용액과의 두 단계의 반응을 통하여 NPQD의 접촉각을 현저하게 낮춰 표면을 친수성화 할 수 있음을 알 수 있다.

[실시예 2] 전류값 안정화 여부 측정 비교

고농도의 인산완충용액(100 mM) 및 저농도의 인산완충용액(10 mM)의 전류값 안정화 여부를 비교하기 위하여, CH1040C 시리즈의 멀티 포텐시오스탯 장치를 이용하여 전기화학적인 분석을 제조사에서 제공하는 프로토콜에 의해 수행하여, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 보는 바와 같이, 고농도의 인산완충용액에서는 비교적 측정된 전류값이 불안정한 것에 비하여, 저농도에 해당하는 10 mM의 인산완충용액에서는 그 전류값이 매우 안정적인 그래프를 나타내었다.

상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 제조예의 제조 시 고농도 및 저농도의 조건에서 단계를 달리하여 중합 반응을 수행하는 것이 전류값의 안정화를 가져올 수 있음을 알 수 있다.

[실시예 3] 전극 표면 측정

제조예 및 비교예를 포함하는 바이오센서에서 NADH를 여러번 측정하였을 때, 전극 표면의 변화를 주사 전자 현미경(Scanning electron microscope; SEM)으로 측정하여, 그 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다. 단, 전극은 주사 전자 현미경 측정을 위하여 10 nm의 두께로 스퍼터(sputter) 과정을 수행하였다.

또한, 바이오센서를 이용한 NADH의 측정은 NADH가 포함되어 있는 시료 샘플을 바이오센서에 투입시킨 뒤, - 600 mV 의 전압을 10초 동안 가하여 발생되는 전류의 최종값을 측정하는 과정을 통해 수행하였다.

도 4에서 보는 바와 같이, 비교예는 기준전극 (Reference electrode; RE) 및 작업전극 (Working electrode; WE) 부위 모두에서 NPQD가 잘 생성 된 것을 알 수 있었으나, 20회 재사용한 후에 측정하는 경우 기준전극 및 작업전극 부위 모두에서 NADH 측정에 다수 사용된 경우 표면이 급격하게 변질되었다.

반면, 도 5에서 보는 바와 같이 제조예의 경우 기준전극 및 작업전극 부위 모두에서 NPQD가 잘 생성되었을 뿐만 아니라, 20회 재사용한 후에 측정하여도 표면의 변질 정도가 현저하게 낮았다.

상기 결과를 통해 본 발명에 따른 제조예인 전극은 바이오센서에 적용되었을 때, 측정에 다수 회 재사용될 수 있는 것을 알 수 있다.

[실시예 4] NADH 민감도 측정 결과

제조예 및 비교예의 NADH 측정 민감도를 비교하기 위하여, 상기 실시예 3의 방법과 동일한 방법을 통해 시료 내 NADH를 측정하여, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에서 보는 바와 같이, 제조예의 경우 100 μM의 NADH 측정 값이 약 140%에 해당하는 반면, 비교예는 110%에 해당하는 값이 측정되었으며, 140 μM의 NADH 측정 값이 제조예의 경우 약 155%에 해당하는 반면, 비교예의 경우 현저하게 낮은 정도인 약 120%로 측정되었다.

상기 결과를 통해 본 발명에 따른 제조예를 전극으로 사용하여 NADH를 측정하는 경우, 비교예에 비하여 민감도가 현저하게 높은 것을 알 수 있다.

이상에서 본 발명에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.

Claims

a) 전극을 황산으로 세척하는 단계;
b) 상기 a) 단계의 전극을 4-아미노싸이오페놀(4-aminothiophenol; 4-ATP)에 넣고 배양한 뒤, 제1 용액에 침지시킨 뒤 전압을 가하는 단계; 및
c) 상기 b) 단계의 전극을 제2 용액에 침지시킨 뒤 전압을 가하는 단계를 포함하는 바이오센서용 전극 제조방법.
제 1항에 있어서,
상기 b) 단계의 제1 용액은 몰농도 90 mM 내지 100 mM인 인산완충용액인 것인, 전극 제조방법.
제 1항에 있어서,
상기 c) 단계의 제2 용액은 몰농도 5 mM 내지 15 mM인 인산완충용액인 것인, 전극 제조방법.
제 1항에 있어서,
상기 b) 및 c) 단계에서 전압은 순환전압전류법(Cyclic votammetry)으로 가하는 것인, 전극 제조방법.
제 4항에 있어서,
상기 b) 및 c) 단계에서 순환전압전류법(Cyclic votammetry)은 0.8 내지 -0.4 V 전위로 변화(sweep)시키는 것인, 전극 제조방법.
제 1항에 있어서,
상기 바이오센서용 전극은 NADH(Reduced form of nicotinamide adenine dinucleotide ) 측정을 위한 것인, 전극 제조방법.
제 1항에 있어서,
상기 전극은 금, 알루미늄, 백금, 니켈, 그래핀, 은 나노와이어 필름, 금속 그리드, 탄소, 및 인듐주석산화물으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 전극 제조방법.
제 1항 내지 7항 중 어느 한 항에 따른 제조방법에 의한 NADH 측정을 위한 바이오센서용 전극.
제 1항 내지 7항 중 어느 한 항에 따른 전극을 포함하는 바이오센서.