KR20120085470A - 생체모방막 및 이를 이용한 ｎａｄｈ 검출용 바이오센서 - Google Patents

생체모방막 및 이를 이용한 ｎａｄｈ 검출용 바이오센서 Download PDF

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KR20120085470A
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부산대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 생체모방막 및 이를 이용한 NADH 검출용 바이오센서에 관한 것으로, 상기 생체모방막은 NADH에 의한 시토크롬 c의 환원공정을 개시할 수 있기 때문에 이러한 시토크롬 c의 생리학적 전자 전달 반응을 이용하여 낮은 전위에서도 높은 민감도로 선택적으로 NADH를 검출할 수 있는 NADH 검출용 바이오센서를 개발할 수 있으며, 특히 상기 생체모방막을 이용한 바이오센서는 NADH 외 다른 인자들에 의한 방해효과를 피할 수 있어 NADH 검출에 대한 선택성이 매우 높다.

Description

생체모방막 및 이를 이용한 ＮＡＤＨ 검출용 바이오센서 {Biomimetic membrane and biosensor for detecting NADH using the same}
본 발명은 시토크롬 c (cyt c)의 환원 반응을 개시할 수 있는 생체모방막 및 이를 이용하여 낮은 전위에서도 높은 민감도를 갖는 생리학적 전자 전달 반응을 이용하여 선택적으로 NADH를 검출할 수 있는 NADH 검출용 바이오센서에 관한 것이다.
환원형 β-니코틴아마이드 아데닌 디뉴클레오타이드 (NADH) 및 이의 산화형인 NAD+는 모든 살아있는 유기체의 세포의 에너지 생산/소비에서 중요한 역할을 수행하는 매우 중요한 조효소이다. NADH는 300개 이상의 탈수소효소를 통한 다양한 효소반응에 관여한다.
따라서, 많은 연구들이 NADH 반응의 근본적인 과학적 적용에 초점을 맞추고 있다. 이러한 적용 중에서, NADH의 전기화학적 반응은 전류측정 바이오센서에 대한 중요한 이슈로 부각되어 왔다. 그러나, 유리질 탄소, 금 또는 백금과 같은 기존에 알려진 전극에서는 NADH 산화에 의한 높은 과전압과 같은 피할 수 없는 문제점을 야기되며, 또한 반응 산물의 흡착을 통해 전극 표면의 파울링이 야기된다.
NADH 산화 관련 과전압을 감소시키고, 전극 표면의 개질을 통하여 파울링 효과를 회피하려는 많은 시도들이 있어왔다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 낮은 전위에서 NADH 검출을 위하여 카본 나노튜브(CNT), 키토산, 전도성 고분자 및 산화아연을 이용하여 개질할 수 있지만, NADH의 선택적인 검출에 효과적이지 못하였다.
따라서, 낮은 전위에서 높은 민감도를 갖는 생리학적 전자 전달 반응을 이용한 선택적인 NADH 센서의 개발이 여전이 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 세포막의 전자 전달 서열과 관련된 생체소재를 이용한 새로운 생체모방막을 개발하고, 이러한 생체모방막에서 시토크롬 c의 직접전자전달 반응에 대한 NADH의 역할을 규명함으로써 스크린인쇄전극 상에 Au 나노입자층, 전기전도성 고분자층 및 포스포에탄올아민, 시토크롬 및 유비퀴논을 고정시킨 생체모방막을 순차적으로 형성시켜 낮은 전위에서도 높은 민감도를 갖는 생리학적 전자 전달 반응을 이용하여 선택적으로 NADH를 검출할 수 있는 NADH 검출용 바이오센서를 제작하기에 이르렀다.
이에, 본 발명의 목적은 시토크롬 c의 환원 반응을 개시할 수 있는 생체모방막을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 낮은 전위에서도 높은 민감도를 갖는 생리학적 전자 전달 반응을 이용하여 선택적으로 NADH를 검출할 수 있는 NADH 검출용 바이오센서 및 이의 제조방법을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 포스포에탄올아민 0.2-0.8 mM, 시토크롬 c 0.4-1.0 mM 및 유비퀴논 0.2-0.8 mM을 포함하는 생체모방막을 제공한다.
상기 생체모방막 중 포스포에탄올아민의 함량이 상기 범위를 벗어나면 생체모방막 안정성에 문제가 야기될 수 있으며, 시토크롬 c의 함량이 상기 범위를 벗어나면 NADH 검출 반응 능력에 문제가 야기될 수 있고, 유비퀴논의 함량이 상기 범위를 벗어나면 포스포에탄올아민 지질층의 안정성 및 시토크롬 c의 산화환원 반응성에 문제가 야기될 수 있다.
또한, 상기 생체모방막에 카디오리핀 0.5 mg/mL 내지 1.0 mg/mL를 더 포함시켜 지질이중층을 형성할 수 있다. 만약, 카디오리핀의 함량이 상기 범위를 벗어나면 NADH 검출 및 L-아스코르브산, 요산, NADPH 등 다른 생체분자에 의한 방해 효과 등의 문제가 야기될 수 있다.
또한, 본 발명은 Au 나노입자층을 전착시킨 스크린인쇄전극; 상기 Au 나노입자층 상단에 형성된 전기전도성 고분자층; 및 상기 전기전도성 고분자층 상단에 포스포에탄올아민, 시토크롬 c 및 유비퀴논을 고정시킨 생체모방막을 포함하는 NADH 검출용 바이오센서를 제공한다.
상기 바이오센서는 상기 생체모방막 상단에 형성된 지질층을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 지질층은 카디오리핀(cardiolipin)으로 이루어지는 것이 바람직하다. 이러한 지질층 형성을 통해 NADH와 공존하는 L-아스코르빈산, 우레산 및 NADPH의 영향을 회피할 수 있다.
상기 Au 나노입자층은 바이오센서의 민감도를 향상시키는 역할을 수행한다.
상기 전기전도성 고분자층은 전기전도성을 향상시키는 역할을 수행하며, 전기전도성 고분자는 카르복실기가 활성화된 폴리터티오펜계 고분자일 수 있으며, 카보디이미드 또는 N-히드록시숙신이미드로 카르복실기가 활성화된 폴리-5,2':5',2"-터티오펜-3'-카르복실산인 것이 보다 바람직하다.
특히, 상기 활성화된 전기전도성 고분자의 카르복실기와 포스포에탄올아민 및 시토크롬 c의 아민기 간의 공유결합을 형성시킴과 동시에 유비퀴논을 고정시켜 생체모방막을 형성한다. 이러한 생체모방막 형성을 통해 바이오센서의 성능을 향상시킨다.
이때, 상기 생체모방막은 포스포에탄올아민 0.2-0.8 mM, 시토크롬 c 0.4-1.0 mM 및 유비퀴논 0.2-0.8 mM로 구성되는 것이 바람직하다. 만약, 상기 함량범위를 벗어나면 반응성 및 검출력에 문제가 야기될 수 있다.
또한, 본 발명은 스크린인쇄전극 표면에 Au 나노입자층을 전착시키는 단계; 상기 Au 나노입자층 표면에 카르복실기가 활성화된 전기전도성 고분자를 코팅하는 단계; 및 상기 전기전도성 고분자의 카르복실기와 포스포에탄올아민 및 시토크롬 c의 아민기 간의 공유결합을 형성시킴과 동시에 유비퀴논을 고정시켜 생체모방막을 형성시키는 단계를 포함하는 NADH 검출용 바이오센서의 제조방법을 제공한다.
특히, 상기 생체모방막 상단에 카디오리핀으로 이루어진 지질층을 형성시키는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 랑뮤어 블라젯 (Langmuir-Blodgett) 기술을 통해 지질층을 형성하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 NADH 검출용 바이오센서는 0.35 내지 0.65μM의 검출한계로 생체 시료 중의 NADH를 검출할 수 있다.
본 발명에 따른 생체모방막은 NADH에 의한 시토크롬 c의 환원공정을 개시할 수 있기 때문에 이러한 시토크롬 c의 생리학적 전자 전달 반응을 이용하여 낮은 전위에서도 높은 민감도로 선택적으로 NADH를 검출할 수 있는 NADH 검출용 바이오센서를 개발할 수 있으며, 특히 상기 생체모방막을 이용한 바이오센서는 NADH 외 다른 인자들에 의한 방해효과를 피할 수 있어 NADH 검출에 대한 선택성이 매우 높다.
도 1은 본 발명에 따른 NADH 검출용 바이오센서의 개념도를 나타낸 것이고,
도 2는 poly-TTCAE/AuNPs/SPCE 표면 상에 DOPE (a) 및 cyt c (b) 고정화에 따른 진동수 변화 (Δf)를 나타낸 것이고,
도 3은 poly-TTCAE/AuNPs/SPCE (●), DOPE/poly-TTCAE/AuNPs/SPCE (○), UQ10/poly-TTCAE/AuNPs/SPCE (▲), DOPE+UQ10/poly-TTCAE/AuNPs/SPCE (□) 및 cyt c:DOPE+UQ10/poly-TTCAE/AuNPs/SPCE (■)에 대한 임피던스 분광분석의 Nyquist 플롯을 나타낸 것이고,
도 4는 poly-TTCAE/AuNPs/SPCE (a), DOPE+UQ10/poly-TTCAE/AuNPs/SPCE (b), cyt c:DOPE+UQ10/poly-TTCAE/AuNPs/SPCE (c) 및 CL/cyt c:DOPE+UQ10/poly-TTCAE/AuNPs/SPCE (d)에 대한 XPS 분석 스펙트럼을 나타낸 것이고,
도 5는 cyt c:DOPE + UQ10/poly-TTCA/AuNPs/SPCE에 관한 순환 전압전류 결과를 0.1M PBS (pH 7.0) 단독 (도 5a) 또는 다양한 농도의 NADH (0.0-5.0 mM)를 함유한 0.1M PBS(pH 7.0)(도 5b)에서 측정한 것이고,
도 6은 물-공기 계면에서 카디오리핀 (CL) 단일층의 π-A 등온곡선을 나타낸 것이고,
도 7은 CL/cyt c:DOPE+UQ10/poly-TTCAE/AuNPs/SPCE를 이용한 NADH 검출에 있어서 최적 pH (a), 최적 온도 (b), 최적 DOPE:UQ10 몰비율 (c) 및 최적 적용 전위 (d)를 분석한 것이고,
도 8은 CL/cyt c:DOPE+UQ10/poly-TTCAE/AuNPs/SPCE를 이용하여 얻어진 NADH 농도와 전류검출형 전류 간의 선형 검량선을 나타낸 것이고,
도 9는 다양한 부피의 실제 시료에 대한 CL/cyt c:DOPE+UQ10/poly-TTCAE/AuNPs/SPCE를 이용하여 얻어진 전류 검출형 반응을 나타낸 것이다.
이하, 하기 실시 예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시 예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 생체모방막 및 NADH 검출용 바이오센서 제작
1. 스크린인쇄전극 (SPCE) 준비
일체형 스크린인쇄전극 (SPCE)을 이용한 3전극 상에서 이하의 전기화학적 실험을 수행하였다. 개질 카본 (면적=0.07 cm2), Ag/AgCl 및 카본을 작동전극, 참조전극 및 반대전극으로 각각 사용하였다. 카본 및 실버 잉크를 스크린인쇄 공정에 사용하였다. 스크린 프린터를 이용하여 폴리스티렌 베이스 필름상에 SPCE를 인쇄하였다.
2. AuNPs/SPCE 준비
+1.4 V 내지 +0.5 V에서 전위주사를 이용하여 0.001 % HAuCl4을 함유한 0.5 M H2SO4 용액에서 AuNP를 SPCE 상에 전착시켰다. 이때, 전착시간은 60 초, 전착전위는 -1.0 V, 주사속도는 0.1 V/s, 전위주기는 3회로 하여 전착을 수행하였다. 이렇게 SPCE 표면에 AuNP층을 형성함에 따라 AuNP층이 형성되지 않은 것과 비교하여 3352.0 Ωcm2에서 733.2 Ωcm2로 임피던스의 감소를 야기하여 AuNP 처리를 통해 전극의 전도성이 크게 향상됨을 알 수 있었다.
3. poly-TTCA/AuNPs/SPCE 준비
이전에 알려진 방법 (Biosens Bioelectron 2003; 18: 773-80)에 따라 poly-TTCA층을 AuNPs/SPCE 상에 형성시켰다. 즉, 디(프로필렌 글리콜)메틸 에테르 (di(propylene glycol)methyl ether)와 트리(프로필렌 글리콜)메틸 에테르 (tri(propylene glycol)methyl ether)가 1:1의 비율로 혼합된 용매를 포함하는 1.0 mM 5,2':5',2"-터티오펜-3'-카르복실산 (TTCA) 단량체 용액에 AuNPs/SPCE를 침지시키고, 용매를 건조시킨 후, SPCE 표면에서 중합반응이 일어났다. 이때, 상기 사용된 TTCA 단량체는 이전에 알려진 방법에 따라 합성하였으며 (Synth. Met., 126, 105, 2002), 0.1 M PBS (pH 7.0)에서 0.1 V/s의 주사속도로 0.0 내지 +1.4 V (vs. Ag/AgCl)에서 2회 전위주사를 통해 전극 상에 고분자 필름을 형성시켰다.
4. cyt c:DOPE + UQ 10 /poly-TTCA/AuNPs/SPCE 준비
poly-TTCA/AuNPs/SPCE을 12시간 동안 10.0 mM 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 [EDC] 및 10.0 mM NHS (N-hydroxysuccinimide)의 혼합용액을 함유한 0.1 M PBS (pH 7.0)에 담구어 poly-TTCA의 카르복실기를 활성화하였다. 그 후, 활성화된 poly-TTCA/AuNPs/SPCE을 10.0 mM PBS (pH 7.0)로 세정한 후, 고분자층 표면에 클로로포름에 용해된 0.5 mM 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine; DOPE, C18:1(Δ 9-cis)]와 0.5 mM 데실유비퀴논 (Decylubiquinone, UQ10) 혼합물 1.5 ㎕를 떨어뜨렸다. DOPE 및 UQ10은 4 ℃에서 48 시간 동안 0.4 mM cyt c를 함유한 10.0 mM PBS (pH 7.0)에서 동시에 반응시켰으며, 10.0 mM PBS으로 다시 세정하였다.
이때, 사용된 시토크롬 c (cyt c, from equine heart; 분자량: 12,384 Da, Sigma Co.)는 다음과 같이 정제하여 사용하였다. 즉, cyt c를 과량의 K3Fe(CN)6의 첨가를 통해 완전히 산화시킨 후, pH 7.0에서 10.0 mM 인산완충액에 용해된 0.5 M NaCl로 용출시킨와트만 CM-32 컬럼 상에서 이온교환 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 정제된 단백질을 함유한 용출물은 Amicon YM-3 멤브레인을 이용하여 한외여과하여 농축한 후, 광범위한 투석을 통해 인산을 제거하였다.
5. CL/cyt c:DOPE + UQ 10 /poly-TTCA/AuNPs/SPCE 준비
cyt c:DOPE + UQ10/poly-TTCA/AuNPs/SPCE 상에 제2지질층을 형성시키기 위하여, LB 기술을 사용하였다. 즉, 카디오리핀 (cardiolipin; CL, 1.0 mg/mL)을 클로로포름에 용해시켜 준비하였으며, 20ㅁ0.1 ℃에서 정제수 상에 분무하였다. 클로로포름을 20 분 동안 증발시켜 CL 분자를 압축시켰다. 얻어진 CL의 LB 단일층을 5.0 mm/min의 속도에서 다양한 표면압을 가해 cyt c:DOPE + UQ10/poly-TTCA/AuNPs/SPCE 표면에 전이시켰다.
<실시예 2> 생체모방막 및 NADH 검출용 바이오센서의 성능 평가
1. QCM(quartz crystal microbalance) 분석
SEIKO EG&G model QCA 917 및 PAR model 263A potentiostat/galvanostat을 이용하여 앞선 실시예에서 제작된 개질 전극의 QCM 분석을 수행하여 바이오센서 표면에서 발생한 질량 변화를 관찰하였다. 이때, Au 작동전극 (면적 0.196 ㎠, 9.0 MHz, AT-cut quartz crystal)을 이용하였다.
poly-TTCA 필름 표면 상에 DOPE 및 cyt c을 고정시키는 동안 진동수 변화를 관찰하였으며, 다음 수학식을 통해 질량 변화 (Δm)를 산출하였다.
[수학식 1]
Figure pat00001
도 2와 같이, DOPE 및 cyt c의 진동수 변화 (Δf)는 각각 ?370 Hz 및 ?393 Hz이었고, poly-TTCA층에 고정된 DOPE 및 cyt c의 양은 각각 406.8 ng (2.8 × 10-9 mol/cm2) 및 432.1 ng (1.8 × 10-10 mol/cm2)이었다.
2. 임피던스 분광 분석
앞선 실시예에서 제작한 개질 전극에 대하여 0.1M PBS (pH 7.0) 중 100.0 kHz로부터 100.0 mHz까지의 오픈 순환 전압에서 EG&G Princeton Applied Research PARSTAT 2263을 이용하여 임피던스 분광분석을 수행하였으며, 이때 샘플링 속도는 10 포인트 당 다섯 포인트였다(진폭: 10.0 mV).
도 3은 임피던스 분광분석의 Nyquist 플롯으로서, poly-TTCA/AuNPs/SPCE 표면상에 DOPE, UQ10 및 cyt c의 고정화로 인하여 전하 전달 저항성이 증가하였다. 따라서, DOPE, UQ10 및 cyt c의 고정화가 전자 전달 반응을 지연시킴을 알 수 있었다.
3. XPS 분석
앞선 실시예에서 제작한 개질 전극 표면을 VG Scientific Escalab 250 XPS 분광계[단색화된 Al Kα 광원 (KBSI Busan, Korea)]를 사용하여 XPS 분석을 수행하였다.
도 4는 XPS 분석 스펙트럼을 나타낸 것으로, 도 4a는 C1s, 도 4b는 N1s, 도 4c는 S2p, 도 4d는 Au4f 및 도 4e는 O1s 피크이며, 각 그래프 상의 a는 poly-TTCA/AuNPs/SPCE, b는 DOPE + UQ10/poly-TTCA/AuNPs/SPCE c는 cyt c:DOPE + UQ10/poly-TTCA/AuNPs/SPCE, d는 CL/cyt c:DOPE + UQ10/poly-TTCA/AuNPs/SPCE을 의미한다. 이러한 결과로부터 전극 표면에 개질자들이 성공적으로 고정화된 것을 확인할 수 있었다.
4. 순환 전압전류(cyclic voltammogram; CV) 분석
Potentiostat/Galvanostat(모델: KST-P2, Kosentech)를 이용하여 앞서 제작된 개질 전극 cyt c:DOPE + UQ10/poly-TTCA/AuNPs/SPCE에 관한 CV를 0.1M PBS(pH 7.0) 단독(도 5a) 또는 다양한 농도의 NADH(0.0-5.0 mM)를 함유한 0.1M PBS(pH 7.0)(도 5b)에서 50 mV/s의 주사속도로 각각 측정하였다.
도 5a와 같이, 한쌍의 환원피크가 +0.03/+0.09 V에서 관찰되었으며, 이는 개질 전극 표면상에 고정된 cyt c의 환원공정에 따른 것으로 대략 60 mV에서 명확하게 확인되었다. cyt c의 피크 전류가 주사 속도에 직접 비례하므로 환원 반응이 표면에 고정된 cyt c에 의해 조절됨을 확인할 수 있었다.
또한, 도 5b와 같이, NADH 농도가 증가함에 따라 cyt c의 환원 피크가 점차적으로 감소하였으며, 이는 cyt c의 직접 전자 전달 (DET)에서 온 환원 피크가 NADH 농도 증가와 함께 감소함을 의미한다.
따라서, cyt c의 DET 환원 피크는 NADH 검출의 분석 신호로서 유용하게 사용될 수 있다.
5. CL층의 영향 평가
앞선 실시예에서 제작된 CL/cyt c:DOPE + UQ10/poly-TTCA/AuNPs/SPCE 중에서 CL 단일층의 표면압(π)-면적(A) 등온곡선을 얻기 위하여, Langmuire Blodgett (LB) trough, KSV-5000 (Finland)을 이용하였으며, 상기 장치는 2개의 대칭 컴파트먼트 (71×21 cm2)를 구비하였다.
도 6과 같이, 다른 인자들의 영향을 방지할 수 있는 CL의 최적 표면압은 23 mN/m로 결정되었으며, 이러한 최적 π-A 등온 조건에서 CL 분자는 작은 분자를 전달하기에 충분하게 정렬되었으며, 바이오센서는 선택적으로 NADH를 검출하였다.
6. NADH 검출 최적 조건 분석
앞선 실시예에서 제작된 CL/cyt c:DOPE + UQ10/poly-TTCA/AuNPs/SPCE으로 NADH를 검출할 경우 NADH 농도는 일정하게 유지시면서 최적 pH, 온도 및 DOPE:UQ10 몰비율 및 적용 전위를 검토하였다.
도 7a와 같이 분석 민감도에 대한 센싱 용액의 최적 pH를 5.8 내지 8.0의 범위에서 분석한 결과, pH 7.0이 최적 pH로 확인되었다. 또, 도 7b와 같이 최적 온도를 12.5 내지 40.0 ℃에서 분석한 결과, 30℃로 확인되었다. 또, 도 7c와 같이 DOPE:UQ10 몰비율은 1:1 몰비가 최적인 것으로 확인되었으며, 도 7d와 같이 적용 전위가 +0.075 V에서 보다 양의 값으로 변화함에 따라 NADH에 대한 전류 반응이 증가되었고, 최대 반응은 +0.175 V에서 얻어졌다. 따라서, +0175 V를 NADH 분석을 위한 최적 적용 전위로 선정하였다.
이하 최적 조건 하에서 바이오센서의 검량선 및 성능을 평가하였다.
7. NADH 검출용 바이오센서의 검량선 및 성능 평가
앞선 실시예에서 제작된 CL/cyt c:DOPE + UQ10/poly-TTCA/AuNPs/SPCE에 대한 cyt c 환원 피크의 전류 변화를 NADH 농도를 변화시켜 측정하였다.
도 8과 같이, NADH가 없는 경우에는 어떠한 전류 변화가 관찰되지 않은 반면, NADH의 농도가 1.0 내지 5.0 mM로 변화함에 따라 전류 변화가 확인되었다. 최적 조건 하에서 NADH 검출의 전류 반응은 선형을 나타내었으며, 이러한 선형 의존성은 수학식 2[
Figure pat00002
]에 따라 얻어지며, 상관계수는 0.999이었다. NADH의 검출한계는 0.5 μM (±0.15 μM)이었다. 그리고, 상대표준편차 (RSD) 측면에서 표현되는 재현성은 1.0 mM의 NADH 농도에서 2.6% (n=5)이었다. 상기 CL/cyt c:DOPE + UQ10/poly-TTCA/AuNPs/SPCE는 4 ℃에서 보관되었을 때 2개월의 작동 및 보관 안정성을 나타내었고, 2달 후 초기 반응의 90 %를 유지하는 것으로 확인되었다.
<실시예 3> 세포성 샘플에서의 NADH 검출
인간 대장 선암종으로부터 분리된 HT 29 세포를 한국세포주은행으로부터 얻었다. 상기 세포를 10 %의 비활성 태아소혈청, 100 U/mL 페니실린 및 100 U/mL 스트렙토마이신으로 보강된 RPMI 1640 배지에서 5 % CO2 분위기 하 37 ℃에서 배양하였으며, 상기 배지를 하루걸러 한번 교체하였다.
상기 세포 (2.8×106 cell/mL)를 0.1 % 젤라틴 코팅된 페트리디쉬 상에 분주하였다. 앞선 실시예에서 제작된 CL/cyt c:DOPE + UQ10/poly-TTCA/AuNPs/SPCE를 이용한 대 시간 전류 반전 기술 (chronoamperometry)을 통해 표준법에 의해 NADH 농도를 모니터링 하였다. 이때, 상기 배양된 세포로부터 검출 용액으로 NADH를 추출하기 위하여, 세포용해액 (cellyticTM M cell lysis reagent, Sigma-Aldrich Co.)을 이용하여 자란 세포를 용해시켰으며, 상기 세포 용해액 100 ㎕을 5.0 mL PBS (0.1M, pH 7.0)에 첨가하여 분석에 사용하였다. 대조실험을 위하여, 세포 샘플을 포함하지 않는 세포용해액만 사용한 실험군과 세포용해액으로 처리되지 않은 세포 샘플 용액을 각각 사용하였다.
도 9와 같이, 세포 샘플에서의 NADH 농도는 주입된 세포 용해액 100 ㎕, 200 ㎕ 및 300 ㎕에서 각각 177.5 μM, 364.3 μM 및 514.6 μM으로 결정되었다.
이상과 같이, 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 이것에 의해 한정되지 않으며 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술 사상과 아래에 기재될 청구범위의 균등 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능함은 물론이다.

Claims (8)

  1. 포스포에탄올아민 0.2-0.8 mM, 시토크롬 c 0.4-1.0 mM 및 유비퀴논 0.2-0.8 mM를 포함하는 생체모방막.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 생체모방막에 카디오리핀을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생체모방막.
  3. Au 나노입자층을 전착시킨 스크린인쇄전극; 상기 Au 나노입자층 상단에 형성된 전기전도성 고분자층; 및 상기 전기전도성 고분자층 상단에 포스포에탄올아민, 시토크롬 c 및 유비퀴논을 고정시킨 생체모방막을 포함하는 NADH 검출용 바이오센서.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 생체모방막 상단에 카디오리핀으로 형성된 지질층을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 NADH 검출용 바이오센서.
  5. 청구항 3 또는 청구항 4에 있어서, 상기 전기전도성 고분자는 카르복실기가 활성화된 폴리터티오펜계 고분자인 것을 특징으로 하는 NADH 검출용 바이오센서.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 전기전도성 고분자는 카보디이미드 또는 N-히드록시숙신이미드로 카르복실기가 활성화된 폴리-5,2':5',2"-터티오펜-3'-카르복실산인 것을 특징으로 하는 NADH 검출용 바이오센서.
  7. 스크린인쇄전극 표면에 Au 나노입자층을 전착시키는 단계;
    상기 Au 나노입자층 표면에 카르복실기가 활성화된 전기전도성 고분자를 코팅하는 단계; 및
    상기 전기전도성 고분자의 카르복실기와 포스포에탄올아민 및 시토크롬 c의 아민기 간의 공유결합을 형성시킴과 동시에 유비퀴논을 고정시켜 생체모방막을 형성시키는 단계;
    를 포함하는 NADH 검출용 바이오센서의 제조방법.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 생체모방막 상단에 카디오리핀으로 이루어진 지질층을 형성시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 NADH 검출용 바이오센서의 제조방법.
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