KR101478896B1 - 항암제 처리된 암세포 검출용 바이오센서 및 이의 제조방법 - Google Patents

항암제 처리된 암세포 검출용 바이오센서 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 Au 나노입자층을 전착시킨 전극; 상기 Au 나노입자층 상단에 형성된 전기전도성 고분자층; 및 상기 전기전도성 고분자층 상단에 고정된 압타머층을 포함하는 항암제 처리된 암세포 검출용 바이오센서에 관한 것이다.
본 발명에 따른 센서는 항암제 처리된 암세포를 특이적으로 검출하는 효능이 우수하며, 암세포의 수가 증가함에 따라, 형광 강도 및 임피던스 변화값도 비례하여 증가하는 바, 암세포를 정성, 정량적으로 검출할 수 있는 센서로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

항암제 처리된 암세포 검출용 바이오센서 및 이의 제조방법{Biosensor for Detecting Cancer Cell Treated Anti-cancer Drug and Preparation Method Thereof}
본 발명은 항암제 처리된 암세포를 특이적, 정량적으로 검출하는 바이오센서 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
암은 인간의 건강에 대한 가장 치명적인 위협 중의 하나이다. 미국에서는 매년 거의 1,300,000명의 새로운 환자가 암에 걸리며 심장병에 이어 제 2의 사망 원인으로 4명 중 약 1명에 이른다. 또한, 암은 5년 이내에 사망의 제 1 원인이 되어 심혈관 질병을 능가할 수 있다고 예측된다. 고형암이 이러한 사망의 대부분을 차지한다. 특정 암의 의학적 치료에 있어서는 상당한 진전이 있었지만, 모든 암에 대한 총 5-년 생존률은 지난 20년 동안 단지 약 10% 만이 개선되었다. 암 또는 악성 종양은 전이되며 조절되지 않는 방식으로 급속히 성장하므로, 적시에 발견하여 치료하기가 매우 어렵다. 또한, 암은 조직 내의 하나 또는 수개의 정상 세포가 악성 전환을 통해 신체 내의 거의 모든 조직으로부터 발생할 수 있으며, 특정한 조직 기원을 갖는 암의 유형 마다 서로 상이하다.
종양세포는 "종양 항원"의 존재로 인해 정상 세포와 항원성에 있어서 상이하다. 이들은 종양세포에만 특유할 수 있거나, 또는 상이하게 발현되거나 과량으로 발현됨으로써 "종양-관련 항원"(TAA)으로서 인식된다. 종양세포는 단백질 1차 구조, 즉 아미노산 서열이 정상 세포와 상이할 뿐만 아니라(게놈 서열의 변화로부터 유래), 글리코실화, 포스포릴화의 변화와 같이 번역 후 변형의 변화로 인하여 2차 및 3차 구조도 정상 세포와 상이할 수 있으며, 이것은 계속해서 상기 단백질의 항원성을 변화시키고, 또한 그것을 종양-관련 항원으로서 특정한다. 한 전형적인 예는 유선에서 나오는 단백질 점액소인데, 이것 자체는 종양 세포에 존재하는 변화는 아니지만, 유방암 환자에서는 이것에 대한 자가항체가 발견된다(때로는 난소암에서도 그렇다). 그 이유는 아마도 정상 세포에서는 이 단백질이 고도로 글리코실화되고, 탄수화물 사슬의 치밀하고 두꺼운 코팅으로 인해서 전혀 노출되지 않기 때문인 것으로 추정된다. 종양세포에서 글리코실화가 불량하면, 항원성 결정소로서 작용하는 단백질 단편이 면역 시스템에 노출되게 된다.
따라서, 특이적이고 보다 효과적인 암 치료 방법으로 상기 종양세포 특이적 항원을 표적하는 항체를 사용하는 연구 및, 상기 항체를 통해 암세포의 세포사멸을 유도하는 암치료제 개발이 현재 관심을 받고 있다. 상기 기술과 관련하여 국내공개특허공보 10-2010-0045903은 암세포의 세포사멸 수용체인 항 DR5를 표적하는 항체를 개시하고 있다.
그러나, 암 세포 종류별로 표적 항원이 상이하고, 암 세포에만 특이적으로 발현하는 항원을 찾기 어려워, 보다 비침습적이고, 간편하며, 다양한 암세포에 보편적으로 적용되는 암 세포 검출 방법이 요구되고 있다.
따라서 본 발명은 보다 비침습적이고, 간편하며, 다양한 암세포에 보편적으로 적용되는 암 세포 검출용 바이오센서 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.
상기 과제의 해결을 위하여, 본 발명은 Au 나노입자층을 전착시킨 전극; 상기 Au 나노입자층 상단에 형성된 전기전도성 고분자층; 및 상기 전기전도성 고분자층 상단에 고정된 압타머층을 포함하는 항암제 처리된 암세포 검출용 바이오센서를 제공한다.
또한 본 발명은 전극 표면에 Au 나노입자층을 전착시키는 단계; 상기 Au 나노입자층 표면에 카르복실기가 활성화된 전기전도성 고분자층을 코팅하는 단계; 및 상기 전기전도성 고분자층의 카르복실기와 압타머를 공유결합시켜 압타머를 고정시키는 단계를 포함하는 항암제 처리된 암세포 검출용 바이오센서의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 센서는 항암제 처리된 암세포를 특이적으로 검출하는 효능이 우수하며, 암세포의 수가 증가함에 따라, 형광 강도 및 임피던스 변화값도 비례하여 증가하는 바, 암세포를 정성, 정량적으로 검출할 수 있는 센서로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명 바이오센서의 제작 모식도와 암세포 검출 원리를 나타낸다.
도 2는 센서 전극 표면의 성분 분석을 알기 위한 XPS 결과 그래프이다.
도 3은 (A) 다우노마이신이 처리되어 있지 않은 (a) GC/AuNPs/pTTBA와 (b) GC/AuNPs/pTTBA/압타머 전극들에 대한 암세포와의 반응을 나타내며, 다우노마이신이 처리된 정상 세포와 반응시킨 (c) GC/AuNPs/pTTBA/압타머 전극과 다우노마이신이 처리된 암세포와 반응시킨 (d) GC/AuNPs/pTTBA/압타머 전극에 대한 CV를 나타낸다. 삽입도: GC/AuNPs/pTTBA 전극을 사용하여 다우노마이신이 포함되어 있지 않은 용액(검은 선)과 0.01 mM 다우노마이신이 포함되어 용액(빨간선)에서의 CV를 나타낸다. (B) 다우노마이신이 처리된 경우(◎)와 처리되어 있지 않은 경우(◈), 그리고 압타머가 고정화되어 있지 않은 경우(★)와 고정화된 경우(▲)의 임피던스 결과를 나타낸다. 삽입도: 임피던스 신호들을 나타낸다. (C) 센서와 반응한 다우노마이신이 처리된 여러 수의 HeLa에 대한 임피던스 결과를 나타냈다. (D) 검정곡선 (n = 5).
도 4는 GC/AuNPs/pTTBA/앱타머 전극을 사용하여 0.1 M PBS(pH 7.4)에서 다우노마이신이 처리된 a) 암세포(HeLa)와 b) 정상 세포(OSE)에 대한 임피던스 결과 그래프이다.
도 5의 (a)와 (b)는 다우노마이신이 처리된 암세포와 반응한 센서 전극 표면의 SEM 이미지를 나타내며, (c) - (f)는 다우노마이신이 처리된 여러 수의 암세포에 대한 여기/방출 λ400/λ590에서의 형광 현미경 이미지를 나타낸다.
본 발명은 Au 나노입자층을 전착시킨 전극; 상기 Au 나노입자층 상단에 형성된 전기전도성 고분자층; 및 상기 전기전도성 고분자층 상단에 고정된 압타머층을 포함하는 항암제 처리된 암세포 검출용 바이오센서를 제공한다.
본 발명의 발명자들은, 보다 비침습적이고, 간편하며, 다양한 암세포에 보편적으로 적용되는 암 세포 검출 방법에 대해 연구하던 중, 암세포의 표면에 포스파티딜세린과 같은 음정하를 띄는 지질이 주로 분포하고, 또한 살리실산 및 헤파린 설페이트와 같은 음이온성 분자가 다량 존재하는 점에 착안하여, 암세포가 전기화학적으로 활성이고 형광 특성을 보이는 양이온성 항암제를 흡수하는 특성이 있으며, 암세포에 특이적으로 흡수된 항암제를 표적으로 한 암세포 검출용 바이오센서가 암세포 특이적 검출능이 우수함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
상기 Au 나노입자층은 바이오센서의 민감도를 향상시키는 역할을 수행한다. Au 나노입자층이 전착되는 전극으로는 유리질 탄소전극 또는 인듐틴옥사이드 전극이 사용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 한 구체예에서, 암세포에 처리되는 양이온성 항암제로는 다우노마이신, 블레오마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신 및 미토마이신-C로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 다우노마이신(Daunomycin, 이하 DAN)을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 항암제와 특이적으로 결합하는 압타머는 서열번호 1의 핵산서열로 이루어진 압타머를 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 압타머의 일반적인 내용은 Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24):142727(1998)에 상세하게 개시되어 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 전기전도성 고분자층은 전기전도성을 향상시키는 역할을 수행하며, 이는 터티오펜 단량체를 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로 상기 터티오펜 단량체는 2,2':5',2''-터티오펜-3(p-벤조산)(2,2':5',2''-terthiophene-3(p-benzoic acid)), 또는 5,2':5',2"-터티오펜-3'-카르복시산(5,2':5',2"-terthiophene-3'-carboxylic acid) 일 수 있으며, 바람직하게는 2,2':5',2''-터티오펜-3(p-벤조산)(2,2':5',2''-terthiophene-3(p-benzoic acid))을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 고분자층은 카보디이미드 또는 N-하이드록시숙신이미드로 카르복실기가 활성화되어 압타머의 5' 말단에 부착된 아민기와 공유결합을 형성할 수 있다.
또한, 본 발명은 전극 표면에 Au 나노입자층을 전착시키는 단계; 상기 Au 나노입자층 표면에 카르복실기가 활성화된 전기전도성 고분자층을 코팅하는 단계; 및 상기 전기전도성 고분자층의 카르복실기와 압타머를 공유결합시켜 압타머를 고정시키는 단계를 포함하는 항암제 처리된 암세포 검출용 바이오센서의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 압타머는 서열번호 1의 핵산서열로 이루어진 것이며, 서열번호 1의 핵산서열의 5 말단에 부착된 아민기와 전기전도성 고분자층의 카르복실기간에 공유결합이 형성된다.
이하의 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 바이오센서는 다우노마이신 처리된 암세포와 비암 세포의 구별 능력이 탁월하며, 80 내지 10000 cell/mL 범위에서 세포 수에 비례하여 임피던스 증가값(ΔRct)이 비례하게 나타났는 바, 추가적인 염색 또는 발색제 없이도, 본 발명의 바이오 센서에 의해 암세포를 정성, 정량적으로 검출할 수 있는 장점이 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실험예 >
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 시약
전기 전도성 폴리머 2,2':5',2''-terthiophene-3(p-benzoic acid) (TTBA)는 Paal-Knorr 피롤 축합 반응에 의해 합성되었다. 테트라부틸암모늄 퍼클로레이트(TBAP, electrochemical grade) 는 Fluka (USA)로부터 구입하였고, 정체 후 1.33 x 10-3 Pa에서 진공 건조하였다. 1-에틸-3-(3-(디메틸아미노)-프로필) 카보디이미드(EDC), N-하이드록시석신이미드(NHS), 디클로로메탄(99.8%, 무수 및 N2 포장), 및 트리소듐 시트레이트는 Sigma Co. (USA) 로부터 구입되었다. 소듐 테트라하이드리도보레이트 및 HAuCl4·3H2O는 Aldrich (USA)로부터 구입되었다. 본 발명의 SELEX 유래 압타머는 5'에 아민 그룹을 부착하여 사용하였다 (NH2-5′-GGGAATTCGAGCTCGGTACCATCTGTGTAAGGGGTAAGGGGTGGGGGTGGGTACGTCTAGCTGCAGGCATGCAAGCTTGG-3′, 서열번호 1). PAGE 정제된 압타머는 Bioneer (S. Korea)로부터 구입하여 사용하였다. HPLC 등급 DAN 은 Sigma-Aldrich (USA)로부터 구입되었고, 4℃에서 보관되었다. 압타머 농축 용액(stock solution)은 pH 8.0, 멸균된 Tris EDTA 버퍼 (10.0 mM Tris-HCl 및 1.0 mM EDTA)에서 -20℃로 보관되었다.
RPMI 1640 배지, Dulbecco's Modified Eagle's 배지(DMEM), 인간 혈청, 우태혈청(FBS), 트립신-EDTA, 페니실린/스트렙토마이신, Hank? balance salt (HBS) 용액은 Sigma-Aldrich로부터 구입되었다. 모든 수용액은 Milli-Q water purifying system (18 MΩ cm)에서 구입한 2차 증류수로 준비되었다.
2. 바이오 센서 제조
본 발명 바이오 센서의 제작도를 도 1에 나타내었다. AuNP는 TTBA의 중합반응 전 유리질탄소전극(glassy carbon electrode, GCE) 상에 전기증착되었다. 이때 전기증착은 0.001 % HAuCl4을 함유한 0.5M H2SO4 용액에서 1.5 에서 0.4V까지 linear sweep voltammetry(LSV) 을 사용하여 전착시간은 60 초, 전착전위는 -1.0 V, 주사속도는 0.1 V/s, 전위주기는 3회로 하여 전착을 수행하였다.
GC/AuNP 상의 pTTBA는 0.1 M TBAP/CH2Cl2 에 존재하는 1.0 mM TTBA 단량체를 0.1 V/s의 주사속도로 0.0 내지 +1.4 V (vs. Ag/AgCl)에서 1회 전위주사하는 전기 중합반응을 통해 형성되었다. 중합 후, pTTBA 층의 카복실산 작용기는 EDC/NHS 로 활성화된 후, 압타머가 고정되어 GC/AuNP/pTTBA/압타머 층을 형성하였다. 그 후, 0.1 M 머캅토에탄올로 1분간 세척하여 결합하지 않은 작용기를 제거하고, 각 층의 형성을 XPS로, 압타머 고정을 quartz crystal microbalance (QCM)로 확인하였다.
3. 세포 샘플 준비
HeLa(인간 자궁암), MCF-7(인간 유방 선암), HT-29(인간 대장암), SK-BR-3(인간 유방 선암), 난소 표면 상피(OSE) 세포, MCF-10A 및 HEK-293 세포주는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서 구입되었다. HeLa 및 MCF-7 세포주는 DMEM 배지에 배양되었고, HT-29 및 SK-BR-3 세포주는 RPMI 1640 배지에 배양되었다. 모든 암세포가 아닌 세포는 모두 DMEM 배지에 배양되었다. 세포는 37℃, 5% CO2 조건 하에서 10% 열-비활성화 우태혈청, 100.0 unit/mL 페니실린 및 100.0 unit/mL 스트렙토마이신을 함유하는 각각의 배지에서 배양되었다. 배지는 2일마다 교체되었다. 이후 모든 암/비암 세포를 HBS로 세척하여 배지를 제거한 후, PBS (pH 7.4) 에 존재하는 1.0 μM DAN로 20분간 4℃ 얼음 배쓰에서 DAN의 내재화를 배제하며 처리하였다. 흡수되지 않은 세포 표면의 DAN을 제거하기 위해, 세포는 1000rpm에서 원심분리되었다. DAN을 처리하지 않은 실험군을 양성 대조군으로 사용하였고, 실험군 및 대조군 세포는 바이오 센서와 함께 배양되었다. 본 발명의 바이오 센서 외에 압타머가 제거된 GC/AuNP/pTTBA 프로브도 비교 실험을 위해 사용되었다. 프로브의 표면은 세포와의 반응 후, 즉시 electrochemical impedance spectroscopy (EIS)로 측정되었다.
4. 분석
EIS 분석을 위한 전기화학전지는 포화 KCl 용액 상의 Ag/AgCl 참조전극, 백금 반대전극 및 본 발명의 GC/AuNP/pTTBA/압타머를 작동전극으로 한 3전극 전지를 사용하였다. 패러데이 임피던스 스펙트럼은 개방 회로 전위를 100.0 kHz 에서 100.0 MHz 로 하여 PARSTAT 2263 (USA)을 사용하여 기록되었다. 모든 전기화학 임피던스 측정은 PBS(pH7.4) 버퍼 에서 수행되었고, 임피던스 스펙트럼은 Nyquist plot 형식으로 수집되었다.
< 실시예 1> 제조된 바이오 센서의 XPS 및 QCM 분석
GC/AuNP/pTTBA/압타머 바이오 센서의 각 층의 형성을 분석하기 위해 VG Scientific XPSLAB 250 XPS spectrometer 를 사용하여 XPS 분석을 수행하였다. XPS 스펙트럼은 284.6eV 위치의 C1 피크를 내부 표준으로 사용하였다. 결과를 도 2에 나타내었다. (a)는 GC/AuNP/pTTBA 센서의 표면이고, (b)는 본 발명 GC/AuNP/pTTBA/압타머에 대한 표면 분석 결과이다. TTBA 코팅된 전극은 163.8 eV 위치에서 C-S 결합에 상응하는 S2p 피크를 보였고, 이는 pTTBA의 황 성분에 기인한 것으로 판단된다. 표면에 고정된 압타머의 N1 피크 398.8 및 399.8eV 위치에서 확인되었고, 이는 C-N, -NH 및 O=C-NH- 결합과 각각 상응하며, 이는 압타머의 NH2 그룹과 pTTBA 의 COOH 그룹간에 형성된 공유결합에 기인한다. 압타머 고정된 전극은 131.9eV에서 매우 명확한 P2p 피크를 보이는데, 이는 압타머 백본의 주요 구조적 요소인 포스페이트에 상응하고, 이는 압타머가 성공적으로 표면에 결합되어 있음을 시사한다.
Au-코팅된 작동전극(면적: 0.196cm2; 9.0MHz; AT-cut quartz crystal) 을 사용하여 압타머 고정 정도를 pTTBA 필름에 대한 quartz crystal microbalance (QCM)로 주파수 변동을 기초로 하여 확인하였다. 압타머가 고정된 경우, 주파수의 감소는 1시간 이후 0.11 kHz 변화(Δf)를 거쳐 일정 상태에 도달하였고, 이는 132.8 ± 7.2 ng 의 질량 변화(Δm)와 상응하였다. 따라서 전극 표면의 압타머 분자의 수는 1.7 x 10-11mol/cm2로 확인되었다. 상기 결과는 압타머가 본 발명 센서의 pTTBA 층 상에 효과적으로 고정되어 있음을 시사한다.
< 실시예 2> 제조된 바이오 센서의 검출능 검토
DAN 및 암세포간의 결합을 검토하기 위해, 압타머 바이오 센서의 CV(순환전압전류) 및 EIS(전기화학적 임피던스 분광법)를 분석하였다. 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다.
1. CV (순환전압전류) 검토
우선, DAN 용액의 전기화학적 거동을 압타머 없이 TTBA만 있는 전극(GC/AuNP/pTTBA)을 대상으로 분석하였고, 산화환원 피크는 -0.65/-0.55 V vs. Ag/AgCl 에서 나타났다(도 3A 내부도 참조). DAN의 CV 피크는 이하의 반응에 기인한다: DAN(ox) + 2e- + 2H+→DAN(red).
이후, 광학 현미경 존재 하에서 1회용 hemocytometer를 사용하여 HeLa 자궁암 및 난소 표면 상피(OSE) 비암세포를 계수 (2.5ⅹ102 cells mL-1) 하였고, DAN 과 배양하였다. 흡수되지 않은 세포 표면의 DAN을 제거하기 위해, 세포는 1000rpm에서 원심분리되었고, 암 및 비암 세포는 CCD 및 NCD로 각각 명명되었다. 상기 세포는 그후 15분간 본 발명의 바이오 센서와 반응되었고, 세척 후, CV가 0.1 M 탈산소화된 PBS 에서 50.0mV/s 주사속도로 -0.30 내지 -1.0 V범위에서 기록되었다. DAN이 암세포 막 내로 흡수되어, 바이오 센서에 검출(n=5, RSD<3.9%) 된 것에 기인한 산화화원 피크 쌍은 약 -0.61/-0.58V vs. Ag/AgCl 에서 확인되었다(도 3A, 파란색 선 d) 참조). DNA 용액에서의 CV와 비교한 DAN 피크 전위 이동은 암 표면에 DAN이 결합하였음을 시사한다. 본 발명의 DNA 피크 전류는 표면에 국한된 DAN의 전기화학 반응에 의해 스캔 속도에 비례하게 나타났고, 이는 암 세포와 반응한 DAN이 바이오 센서에 흡수됨을 시사한다. 그러나, 산화환원 피크는 DAN이 처리되지 않은 암세포에서 관찰되지 않았으며(도 3A 검정 선 참조), NCD (비암세포)는 약한 피크 흡수를 보였는 바(도 3A 녹색 선 참조), 이는 DAN이 비암세포에 비해 암세포의 표면에 특이적으로 결합함을 시사한다.
2. EIS 스펙트럼 검토
Nyquist 플롯의 EIS 스펙트럼은 CCD와 바이오 센서의 상호작용 전후에 PBS 상에서 기록되었고 결과를 도 4에 나타내었다(a) DAN이 처리된 암세포, b) 정상 세포). 도 4 a)를 참조하면, CCD(1.0μM)와 바이오 센서의 상호작용 후, 급격한 Rct 값 증가(ΔRct)가 관찰됨을 알 수 있었다(2902.5±112.6Ω). 그러나, 도 4 b)를 참조하면, 본 발명의 바이오 센서가 동일한 조건에서 NCD와 상호작용한 경우, 14배 낮은 ΔRct가 확인되었다(223.2±13.5Ω).
비교 실험에서, DAN(암세포 없이) 및 프로브간의 상호작용 후 EIS 를 측정하였고, ΔRct 값은 16배 낮게 측정(~188.4±12.3Ω) 되었으며, 상기 결과는 NCD 와 바이오 센서의 상호작용 결과와 유사하였다. 그러나, CCD가 동일한 프로브와 상호작용한 경우, 임피던스는 크게 증가하였다. 상기 결과는, DAN-흡수한 암세포와 바이오 센서의 결합이 ΔRct 값의 증가와 연관이 있음을 시사한다.
DAN이 0.01μM 농도인 경우, CCD 에 대한 ΔRct 값은 2186.5±84.2Ω까지 증가한 반면, NCD의 ΔRct 값은 32.5±3.5Ω로 거의 증가하지 않았고, 이는 CCD의 값보다 68.3배 낮은 값에 해당한다(n = 5, RSD<4.2%, 도 4 참조).
3. 임피던스 변화 검토
임피던스 변화가 바이오 센서와 CCD 간의 상호작용에 특이적인지 여부를 확인하기 위해 압타머 고정 및 DAN 처리 유무에 따른 비교실험이 수행되었고, 결과를 도 3의 B에 나타내었다. 도 3의 B는 다우노마이신이 처리된 경우(◎)와 처리되어 있지 않은 경우(◈), 그리고 압타머가 고정화되어 있지 않은 경우(★)와 고정화된 경우(▲)의 임피던스 결과를 나타낸다. 우선, DAN이 미처리된 암세포 및 압타머가 없는 센서(GC/AuNPs/pTTBA) 표면의 상호작용이 측정되었고(1-◈★), 표면의 카복실기로 인해 음전하를 띄는 GC/AuNPs/pTTBA 와 암세포 표면의 음전하간의 정전기적 반발력으로 인해 ΔRct 값은 증가하지 않는 것으로 나타났다. 이는 DAN이 미처리된 암세포는 GC/AuNPs/pTTBA 표면에 대한 어떤 친화기도 갖고있지 않음을 명백하게 보여준다. 다른 비교실험에서, DAN-미처리된 암세포와 압타머가 고정된 전극(GC/AuNPs/pTTBA/aptamer)과의 상호작용이 측정되었고(2-◈▲), 바이오 센서가 pH 7.4에서 압타머에 존재하는 포스페이트 작용기의 탈양성자화로 인해 음전하를 띄고, 이와 암세포 표면의 음전하간의 정전기적 반발력으로 인해 ΔRct 값은 증가하지 않는 것으로 나타났다. DAN 처리된 CCD와 GC/AuNPs/pTTBA 전극간의 상호작용 또한 측정되었고(3-◎★), pTTBA 표면에 CCD 에 대한 친화력을 갖는 작용기가 없어 ΔRct 값은 증가하지 않는 것으로 나타났다. 따라서, ΔRct 값은 DAN 이 암세포 세포막에 흡수되어 바이오 센서에 검출될 때만 증가하는 것으로 나타났다(4-◎▲).
4. 정량 검출능 검토
본 발명의 검출 센서가 다양한 암세포 검출에도 적용됨을 확인하기 위해, DAN 처리된 MCF-7, HT-29 및 SKBr-3 암세포주에 대해 유사한 방법으로 실험을 수행하였다. 상기 모든 실험 세포주에 대한 ΔRct 값은 급격히 증가한 것으로 나타났다. 또한 본 발명이 암 세포의 정량 검출에도 적용될 수 있음을 확인하기 위해, 다양한 양의 DAN-처리된 HeLa 세포(HeCCD)를 바이오 센서와 반응시켰고, 결과를 도 3의 C에 나타내었다. 도 3C를 참조하면, ΔRct 값은 HeCCD의 수가 증가함에 따라 점차적으로 증가하는 것을 알 수 있었다. HeCCD임피던스 데이터에 기초하여, 검량선을 도출하였고, 이를 도 3의 D에 나타내었다. 검량선은 HeCCD의 범위인 80 내지 10000 cell/mL에서 선형으로 나타났고, 검출 한계는 43 ± 3 cell/mL (RSD<4.4%) 로 나타났다(95% 신뢰수준, n=5). 선형 회귀 방정식은 ΔRct (Ω) = 33.05 + 0.727[HeCCD]로 나타났으며, 상관계수는 0.998이다.
< 실시예 3> 센서 표면에의 결합여부 확인
바이오 센서와 CCD간의 상호작용을 센서 표면의 현미경 분석으로 확인하였다. EIS 스펙트럼 측정 후, 바이오 센서 표면은 SEM 으로 분석되었고, 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5의 a 및 b를 참조하면, 5.0 내지 7.0μm 크기의 CCD가 바이오 센서 상에 존재함을 알 수 있었다.
또한 DAN이 내재적인 형광 활성을 갖고 있으므로, 인듐틴옥사이드(ITO) 전극에서 형광 현미경 이미지 조사를 통해 바이오 센서 전극상의 CCD 를 확인하였고 결과를 도 5의 c 내지 f 에 나타내었다. 도 5의 c 내지 f 를 참조하면, ITO/pTTBA/압타머 프로브에 의해 검출된 다양한 수의 CCD 가 확인됨을 알 수 있으며, 프로브와 배양되는 CCD의 양이 증가할수록 검출되는 CCD의 양 또한 증가함을 확인할 수 있었다. 검출되는 CCD의 양이 증가함에 따라 Rct 값은 증가할 것이며, 따라서, 추가적인 염색 또는 발색제 없이도, 본 발명의 바이오 센서에 의해 암세포를 정성, 정량적으로 검출할 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Pusan National University Industry-University Cooperation Foundation <120> Biosensor for Detecting Cancer Cell Treated Anti-cancer Drug and Preparation Method Thereof <130> ADP-2013-0038 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aptamer for anticancer drug <400> 1 gggaattcga gctcggtacc atctgtgtaa ggggtaaggg gtgggggtgg gtacgtctag 60 ctgcaggcat gcaagcttgg 80

Claims (8)

  1. Au 나노입자층을 전착시킨 전극;
    상기 Au 나노입자층 상단에 형성된 전기전도성 고분자층; 및
    상기 전기전도성 고분자층 상단에 고정된 압타머층을 포함하며,
    상기 압타머층은 서열번호 1의 핵산서열로 이루어진 압타머로 구성되고, 다우노마이신이 처리된 암세포에서 다우노마이신이 상기 압타머와 결합하여 다우노마이신 처리된 암세포를 검출하는 것을 특징으로 하는, 다우노마이신 처리된 암세포 검출용 바이오센서.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 전기전도성 고분자층은 터티오펜 단량체를 포함하는 것인, 다우노마이신 처리된 암세포 검출용 바이오센서.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 터티오펜 단량체는
    2,2':5',2''-터티오펜-3(p-벤조산)(2,2':5',2''-terthiophene-3(p-benzoic acid)), 또는 5,2':5',2"-터티오펜-3'-카르복시산(5,2':5',2"-terthiophene-3'-carboxylic acid) 인 것인, 다우노마이신 처리된 암세포 검출용 바이오센서.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 전기전도성 고분자층은 카보디이미드 또는 N-하이드록시숙신이미드로 카르복실기가 활성화된 고분자층인 것인, 다우노마이신 처리된 암세포 검출용 바이오센서.
  7. 삭제
  8. 삭제
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