KR20160093473A - 금 나노입자와 고분자 코팅을 활용한 고효율 바이오칩의 제조방법 및 그에 의한 바이오칩 - Google Patents

금 나노입자와 고분자 코팅을 활용한 고효율 바이오칩의 제조방법 및 그에 의한 바이오칩 Download PDF

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Abstract

본 발명은 금 나노입자와 고분자 코팅을 활용한 고효율 바이오칩의 제조방법 및 그에 의한 바이오칩에 관한 것으로서, 서로 상반된 전하를 가진 고분자전해질을 금 나노입자의 표면에 이온결합에 의해 교대로 적층하여 코팅하는 단계; 상기 각 고분자전해질이 적층되어 코팅된 금 나노입자의 표면에 고분자전해질과 반응하는 항체를 고정하는 단계; 및 상기 항체가 고정된 금 나노입자를 상기 고분자전해질이 적층되어 코팅된 특정 기질에 고정하는 단계를 포함하여, 상기 금 나노입자와 특정 기질에 각각 코팅된 고분자전해질의 기능기에 의해 금 나노입자를 특정 기질에 고정하도록 한 것이며, 다면체 금 나노입자를 사용함으로써 센서의 효율을 높일 수 있음을 확인할 수 있고, 이는 다양한 바이오분자를 선택적으로 검출할 수 있을 뿐만 아니라 적은 양으로도 검출이 가능하기 때문에 교효율 바이오칩의 제작이 가능한 효과가 있다.

Description

금 나노입자와 고분자 코팅을 활용한 고효율 바이오칩의 제조방법 및 그에 의한 바이오칩{Manufacturing process of biochip of high efficiency using gold nanoparticle and polymer coating and biochip of high efficiency the same}
본 발명은 금 나노입자와 고분자 코팅을 활용한 고효율 바이오칩의 제조방법 및 그에 의한 바이오칩에 관한 것으로서, 상세히는 미세유체소자와 같은 특정 기질에 서로 상반된 전하를 갖는 고분자전해질을 표면에 적층하여 코팅한 금 나노입자를 특정 기질의 미세유체소자 내에 고정하고, 상기 고분자전해질과 반응하여 금 나노입자의 표면에 고정된 항체와 상기 미세유체소자 내에 주입하는 항원과의 항원-항체 반응에 의해 바이오분자를 검출하도록 한 금 나노입자와 고분자 코팅을 활용한 고효율 바이오칩의 제조방법 및 그에 의한 바이오칩에 관한 것이다.
눈에 보이지 않는 분자나 원자들에 대한 많은 관심들에 의해 나노기술이 발전하면서 바이오기술과 융합하여 나노바이오 기술의 새로운 장이 열리기 시작하였다. 나노바이오 기술은 나노미터의 작은 사이즈를 가지는 물질들, 특히 바이오물질을 검출하거나 조작하는 기술을 말한다. 이 기술을 응용하여 만들어진 바이오센서는 신호변환기와 함께 생물학적으로 활성이 된 물질이, 특이적이고 선택적으로 결합하는 장치를 말한다.
최근엔 금 나노입자를 이용하여 이러한 바이오센서로서의 연구가 활발히 진행되고 있다. 금 입자는 벌크 특성은 비활성이나 나노 크기로 작아지면 촉매로서의 활용이 가능하며 또한 그 크기와 모양에 따라 광학적 전기적 혹은 촉매적 특성이 달라짐이 이미 알려져 있다. 금은 50 nm 이하의 미세 나노입자 크기로 제조가 가능하고 입자의 크기 조절이 용이하며 표면에 약물이나 치료 물질들을 붙일 수 있는 특징이 있어 전달체로서 매우 널리 사용되고 있다. 약물 전달체로 사용되기 위해서는 전달체 자체의 안전성이 요구되는데 금 나노입자는 생체안전성이 높으며 세포독성도가 낮다는 장점이 있다.
또한 금 나노입자는 주로 특정 단백질이나 유전자를 결합하여 전자 현미경의 마커, 일반 광학 현미경의 마커로 사용하거나 금을 프로브로 사용하는 scanning probe microscopy에 사용되고 있다 단백질이나 유전자를 정량화할 때 사용되는 키트에도 다양하게 이용되고 있다. 특히 최근 들어 진단과 치료를 함께 할 수 있는 테라그노시스(theragnosis) 분야에서 금 나노입자에 관한 연구는 급속히 증가하고 있으며 표적화된 치료제 전달 방법을 접목시켜 그 효율을 극대화하고 있다.
한국 등록특허공보 제10-1021960호 한국 등록특허공보 제10-1478896호 한국 공개특허공보 제10-2011-0027137호
"Plasmonic detection of a model analyte in serum by a gold nanorod sensor"Marinakos, S. M., S. Chen, et al., Analytical Chemistry, 2007, 79(14): 5278-5283
본 발명은 상기한 바와 같은 제반 문제점을 개선하기 위해 안출된 것으로서, 그 목적은 금 나노입자 표면에 고분자전해질 박막을 코팅하고 항체를 고정함으로써 특정 기질에 고정할 수 있으며, 이는 미세유체소자 내부에서 유체의 흐름 속에서도 주입된 항원에 의한 항원-항체 반응에 의해 특정 바이오분자를 선택적으로 검출할 수 있고, 또한, 기존의 SPR(표면 플라즈마 공명) 칩의 평탄한 기질에 본 발명의 고분자전해질이 코팅된 금 나노입자를 고정함으로써 특정 바이오분자의 검출 효율을 향상시킬 수 있도록 하는 금 나노입자와 고분자 코팅을 활용한 고효율 바이오칩의 제조방법을 제공함에 있다.
다른 목적은 상기 제조방법에 의해 제조된 바이오칩을 제공함에 있다.
상기한 바와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명의 금 나노입자와 고분자 코팅을 활용한 고효율 바이오칩의 제조방법은, 서로 상반된 전하를 가진 고분자전해질을 금 나노입자의 표면에 이온결합에 의해 교대로 적층하여 코팅하는 단계; 상기 각 고분자전해질이 적층되어 코팅된 금 나노입자의 표면에 고분자전해질과 반응하는 항체를 고정하는 단계; 및 상기 항체가 고정된 금 나노입자를 상기 고분자전해질이 적층되어 코팅된 특정 기질에 고정하는 단계를 포함하여, 상기 금 나노입자와 특정 기질에 각각 코팅된 고분자전해질의 기능기에 의해 금 나노입자를 특정 기질에 고정하도록 하는 것을 특징으로 하고 있다.
또 상기 특정 기질은 미세유체소자이며, 상기 미세유체소자 내부의 채널에 금 나노입자를 고정하며, 미세유체소자는 고분자플라스틱 재질(PDMS)로 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴, 폴리카보네이트, 폴리스티렌 중의 하나의 재질로 하는 것이 바람직하다.
또 상기 특정 기질은 SPR(표면 플라즈몬 공명) 칩인 것이 바람직하다.
또 상기 금 나노입자는 80∼100nm의 다면체로 구성되며 표면에 카르복실기를 가지는 것이 바람직하다.
또 서로 상반된 전하를 가진 고분자전해질은 양전해질 고분자(Polycation)(PAH)로 폴리알릴아민염소산(allylamine hydrochloride)을 사용하고, 음전해질 고분자(Polyanion)(PAA)로 폴리아크릴 산(polyacrylic acid) 또는 폴리메타클릴산(poly(methacrylic acid)(PMA) 중의 하나를 사용하되, 상기 양전해질 고분자와 음전해질 고분자의 순으로 금 나노입자의 표면에 교대로 적층하는 layer-by-layer(LBL) 적층법으로 코팅하는 것이 바람직하다.
또 상기 고분자전해질의 코팅은 금 나노입자를 코팅액인 고분자전해질 용액에 분산하는 용액공정 코팅(dip-coating)에 의해 이루어지는 것이 바람직하다.
또 상기 양전해질 고분자와 음전해질 고분자의 분자량은 10000∼100000인 것이 바람직하다.
또 상기 양전해질 고분자(PAH)의 pH농도는 pH7.0∼8.5이고, 상기 음전해질 고분자(PAA)의 pH농도는 pH3.0∼4.5이며, 상기 고분자전해질 용액의 농도는 0.0001∼0.1M이고, 금 나노입자의 농도는 무게백분율로 0.0001∼0.5wt%인 것이 바람직하다.
또 상기 금 나노입자에 각각 한 종류의 양전해질 고분자와 음전해질 고분자가 교대 적층되어 코팅된 코팅층을 1 바이레이어(1 bilayer)로 하였을 때, 상기 각 양전해질 고분자와 음전해질 고분자를 번갈아 수회 반복적으로 적층하여 3∼7.5 바이레이어로 적층하는 것이 바람직하다.
또 상기 금 나노입자에 적층하여 코팅된 최외각 고분자전해질과 특정 기질에 코팅한 고분자전해질 사이의 화학적 커플링 반응에 의해 금 나노입자를 상기 특정 기질에 고정하도록 하는 것이 바람직하다.
또 상기한 방법으로 제조된 금 나노입자와 고분자 코팅을 활용한 고효율 바이오칩을 사용하는 것을 다른 특징으로 하고 있다.
본 발명의 금 나노입자와 고분자 코팅을 활용한 고효율 바이오칩의 제조방법 및 그에 의한 바이오칩에 의하면, 다면체 금 나노입자를 사용함으로써 센서의 효율을 높일 수 있음을 확인할 수 있고, 이는 다양한 바이오분자를 선택적으로 검출할 수 있을 뿐만 아니라 적은 양으로도 검출이 가능하기 때문에 교효율 바이오칩의 제작이 가능한 효과가 있다.
또 상기 금 나노입자의 표면에 고분자전해질을 코팅하여 다양한 기질에 고정할 수 있고, 금 나노입자 하나하나에 기능기를 부여하여 종래의 칩보다 센싱 효율이 더 높은 칩을 제조할 수 있는 효과가 있다.
또한 미세유채소자 내부에서 유체의 흐름 속에서도 특정 바이오분자를 선택적으로 검출할 수 있고, 종래 SPR 칩의 평탄한 기질에 본 발명의 고분자전해질이 코팅된 금 나노입자를 고정함으로써 검출 효율을 향상시킬 수 있는 효과가 있다.
또한 사용하는 고분자전해질에 따라 다양한 바이오분자의 검출이 가능하며, 박막의 pH농도 조절에 따라 기공을 형성한 후 약물탑재를 통한 치료목적으로의 활용도 가능한 효과가 있다.
미세유채소자 내부에 특정 바이오분자를 검출하기 위한 집적화 기술은 직접 고정화에 어려움이 많아 실용, 사업화에 어려움이 있지만, 본 발명서의 고분자전해질의 기능기를 이용한 고정법은 간단한 패터닝으로도 특정 기능기를 채널 내부에 고정할 수 있기 때문에 우수한 시장 경쟁성이 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명에 따른 고효율 바이오칩을 제조하기 위해 사용되는 금 나노입자로 표면에 고분자전해질을 코팅하여 다층박막을 구성하는 금 나노입자의 모식도
도 2a는 본 발명에 따른 고효율 바이오칩에 의해 미세유체소자의 채널 내부 패턴에서의 바이오분자 감지 모식도
도 2b는 본 발명에 따른 고효율 바이오칩의 제조과정 중 미세유체소자 표면과 금 나노입자 표면의 고분자전해질 코팅막을 이용한 상기 금 나노입자의 고정을 보여주는 모식도
도 3은 표면 플라즈몬 공명(SPR)의 측정원리를 보여주는 모식도
도 4는 고분자전해질 용액의 pH농도에 따른 자외선-가시광선 영역의 흡광도 스펙트럼을 보여주는 그래프
도 5는 고분자전해질의 적층 횟수에 따른 다층박막의 두께변화를 보여주는 그래프
도 6은 금 나노입자 표면에 고분자전해질 박막적층 전후의 표면 변화를 보여주는 상기 고분자전해질 적층 전(a), 후(b)의 조직사진
도 7은 금 나노입자 표면의 고분자전해질 기능기에 고정된 항체를 통한 항원 검출을 보여주는 현미경 사진으로, (a)Streptavidin, Biotin-4-fluorecein(green), (b) Human IgG, Anti-Rabbit IgG-TRITC(red)
도 8은 본 발명에 따른 고효율 바이오칩에 의해 미세유체소자 채널 내부에서의 바이오분자 검출을 보여주기 위한 상기 미세유체소 채널과 검출결과를 보여주는 현미경 사진
도 9는 본 발명에 따른 고효율 바이오칩에 의해 금 나노입자를 이용하여 바이오분자 검출을 위한 실시간 SPR 측정을 보여주는 그래프
이하, 본 발명에 따른 금 나노입자와 고분자 코팅을 활용한 고효율 바이오칩의 제조방법 및 그에 의한 바이오칩의 바람직한 실시예를 첨부한 도면을 참조로 하여 상세히 설명한다. 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 단지 본 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위하여 제공되는 것이다.
본 발명에 대한 설명에 있어 먼저 고분자전해질이 표면에 코팅되는 금 나노입자의 제조과정을 설명하고, 다음에 상기 금 나노입자를 특징 기질인 미세유체소자나 SPR 칩에 고정하는 방법을 설명하며, 마지막으로 고분자전해질이 코팅된 금 나노입자 고정된 특정 기질로 구성된 본 발명의 고효율 바이오칩을 이용한 바이오분자의 검출 과정과 결과를 설명하도록 한다.
1. 실험
1-1 PAH / PAA 다층막 필름 제작
본 발명은 다면체 금 나노입자 표면에 화학적 활성기를 부여하도록 고분자전해질 박막을 코팅하여 특정 기능기를 부여함으로써 이를 바이오칩으로 활용하기 위한 제조방법에 관한 것으로, 이를 위해 서로 상반된 전하를 갖는 두 가지 고분자전해질을 Layer-by-Layer(LbL) 적층법과 용액공정코팅(dip-coating)으로 상기 금 나노입자 표면에 적층하여 코팅하고, 고분자전해질이 적층되어 코팅된 상기 금 나노입자의 표면에 항체를 고정한 후, 항체가 고정된 상기 금 나노입자를 미세유체소자나 SPR 칩과 같은 특정 기질에 고정하여 본 발명의 고효율 바이오칩을 제조하게 된다.
사용한 상기 고분자전해질은 양전해질 고분자로 Polycation(allylamine hydrochloride)(PAH)을 사용하였고, 음전해질 고분자로 Polyanion(acrylic acid)(PAA)를 사용하였다. 이와 같이 각각 상반된 전하를 갖는 고분자전해질을 금 나노입자 표면에 코팅함으로써 도 1과 같은 다층막 형태의 복합체를 만들 수 있다.
본 발명에서 사용한 금 나노입자는 특정 합성법으로 인해 80∼100㎚의 팔면체 모양의 금 나노입자를 사용하였으며 표면에 카르복실기를 가지고 있다. 고분자전해질은 분자량 10∼20만의 PAH와 분자량 10만의 PAA를 사용하였다. 고분자전해질의 특성상 pH농도에 따라 이온화도가 급격히 변화하기 때문에 상기 두 고분자전해질의 흡착력과 향후 바이오분자 검출을 위한 기능기를 위해 적절한 pH농도 조절을 하였다. 적절한 pH농도에 있어 PAH는 pH7.0∼8.5로 맞추어 사용하였고, PAA는 pH3.0∼4.5로 각각 맞추어 사용하였다.
이러한 고분자전해질이 코팅된 금 나노입자의 제조에 대해 좀더 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
음전하 고분자전해질로 사용한 상기 고분자 외에도 카르복실산 또는 술폰산을 가진 고분자전해질들은 모두 사용가능하며, 양전하 고분자전해질로 폴리알릴 아민 외에도 아민기를 가진(1차, 2차, 3차 아민) 고분자전해질들의 사용은 비슷한 코팅효과를 얻을 수 있을 것으로 기대된다. 다만, 본 발명의 실시예로 제시한 폴리아크릴 산, 폴리알릴아민과 같은 약전해질의 고분자전해질들 간의 코팅 조합은 전하량을 조절할 수 있는 약전해질의 특이성으로 인해 코팅막의 물성 제어가 용이하고, 생체적합성이 높고 세포 독성이 없는 결과를 얻었기 때문에 생체적 활용성이 높을 것으로 예상된다.
실시예를 포함하여 폴리아크릴 산은 5000∼500000의 분자량이 사용 가능하고 10000∼100000의 분자량이 가장 바람직하며, 폴리알릴아민의 경우도 5000∼500000의 분자량이 사용 가능하고 10000∼100000의 분자량이 가장 바람직하다. 이는 나노스케일의 작은 입자를 코팅하기 위해 고분자전해질의 분자량이 너무 클 경우, 입자들 사이에 응집을 일으켜서 입자를 개별적으로 코팅하기 어렵고, 분자량이 작으면 도 1에 도시한 바와 같은 layer-by-layer 용액공정코팅(dip-coating)으로 안정적인 코팅을 얻기 힘들기 때문이다. 상기 용액공정코팅에 사용되는 고분자전해질 용액의 농도는 고분자의 단위분자구조 기준의 몰농도로 0.0001∼0.1M이 바람직하고, 가장 바람직하게는 0.001∼0.01M의 몰농도로 사용한다. 용액공정코팅 시에 사용한 다면체 금나노입자의 농도는 코팅액인 고분자전해질 용액에 분산시켰을 때 무게백분율 농도(wt%)로 0.0001∼0.5wt%가 바람직하고, 0.0001∼0.001wt%가 가장 바람직하게 사용할 수 있다. 상기한 용액공정코팅 과정은 어떠한 형태(구형이나 다양한 다면체, 막대형)의 금 나노입자에도 적용가능하다.
상기한 바와 같이 본 발명은 금 나노입자 표면에 고분자전해질 박막을 코팅하여 사용된 고분자전해질의 화학적 관능기를 사용하여 커플링 반응을 이용한 미세유체소자 표면이나 생체활성분자 고정 등의 선택적 추가 화학반응할 수 있게 하고 이를 통해 미세유체소자 기반의 바이오칩을 제조하는 방법이다.
기존에 금 평판이나 금 나노입자의 표면에 무엇인가 붙이고자 할 때는 티올(thiol)기를 이용하여 금-황화(Au-s-)결합을 이용하였는데, 금 나노입자의 합성과정에 사용한 분산제 등이 표면에 잔류하면서 발생하는 잔류전하 정도만 이용하면, (보통 surfactant의 히드록시기(-OH)나 산(-COOH)기로 인한 음성 잔류전하, (-)-charge)상대전하를 가진 고분자전해질의 묽은 용액 안에 금 나노입자를 분산하여 금 나노입자의 표면에 고분자전해질이 이온결합으로 코팅이 되게 할 수 있다. 이후, 흡착된 고분자전해질과 상반된 전하를 가진 고분자전해질(즉, 양전하 고분자전해질이 흡착되었으면 음전하 고분자전해질을 사용)을 사용하여 코팅막을 추가로 형성하고, 두 가지 이상의 상대전하 고분자전해질의 교대적층을 사용하는 layer-by-layer 적층법으로 원하는 만큼의 고분자전해질 코팅막을 표면에 입힐 수 있게 된다.
두 가지 고분자전해질 즉, 양전하 고분자와 음전하 고분자가 각각 한 종류를 사용한 코팅막의 경우 교대적층이 1회 완료되면 1 bilayer(1 바이레이어)가 적층되었다고 하는데, 본 발명에서는 적층횟수가 3.0∼7.5 bilayers가 적층된 시료가 코팅막이 잘 형성되었고 이후의 추가 반응이 용이한 경우이다. 사용한 고분자전해질이 각각 산과 염기, 카르복실산과 아민기를 가진 고분자이므로 화학적 관능기를 이용한 이후의 화학결합 반응(coupling reaction)에 사용하고자 하는 활성기가 산이냐 아민이냐에 따라 적층시의 맨 마지막 단계를 원하는 대로 정할 수 있다. 예를 들면, 적층과정 선택에 따라 3.5 bilayers의 적층을 선택하면 최외각 표면이 아민기로 되고, 4.0 bilayers의 적층을 선택하면 최외각 표면이 카르복실산기 등이 되는 것으로 할 수 있다.
1-2 FE - SEM 을 이용한 금 나노입자 표면 관찰
금 나노입자에 적층된 고분자 다층박막은 pH농도, 적층 횟수에 따라 표면 조직형태(morphology)가 달라진다. 특히 본 발명의 다층박막 코팅은 나노입자 표면에 최적의 조건을 찾아야 하기 때문에 각 조건의 데이터가 중요한 판단 기준이 된다. 나노입자의 크기와 표면 전하를 알아보기 위해 DLS(Dynamic light scattering)를 사용하여 데이터를 얻을 수 있다.
1-3 미세유체소자 내부 바이오분자 검출
본 발명에서 이용된 미세유체소자는 투명도와 경제성 등으로 근래에 각광받는 고분자플라스틱 재질인 PDMS(polydimethylsiloxane)로 되어있어 표면이 소수성을 나타내고 있다. 따라서 이러한 소수성기질을 친수성으로 바꾸어주기 위해 고분자전해질 다층박막을 상기 미세유체소자 내부의 채널에 형성하였다. 형성 방법은 상기한 금 나노입자에 고분자전해질의 다층박막을 적층하는 방법과 동일하게 진행하였다. 채널 내부의 박막 형성시 최외각 고분자전해질의 종류에 따라 다양한 작용기를 가질 수 있으며, 이것은 항체의 고정이나 항원의 검출에 이용할 수 있다. 즉 도 2a에서와 같이, 미세유체소자인 PDMS의 내부 슬라이드 글라스 위에 고분자전해질의 다층박막(PEM)이 표면에 코팅되어 최외각층(top)이 PAH인 금 나노입자에 항체(Antibody)를 고정하고(패턴:PAA 잉크 0.05M), 상기 미세유체소자 내에 항원(Antigen)을 0.1㎖/h의 속도로 흘려 상기 항원이 금 나노입자에 고정된 항체와 항원-항체반응을 하도록 함으로써 항원을 검출하게 된다.
본 발명의 바이오칩으로 제조하려고 하는 미세유체소자는 소재의 투명도와 내구성, 가격 경쟁력까지 고려할 때 실리콘이나 금속 기반보다는 고분자 기반의 소재 즉, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴, 폴리카보네이트, 폴리스티렌 등을 사용하는 것이 적절한데, 이러한 소재의 표면에 금 나노입자를 고정하는 방식은 기존의 금-티올 또는 실란(silane) 반응을 사용할 수 없다. 따라서, 본 발명에서 제시하는 화학적 활성기를 가진 고분자로 표면개질된 금 나노입자의 경우는 보다 손쉬운 화학적 커플링 반응을 이용할 수 있다는 점에서 활용도가 크다.
또한 미세유체소자 칩의 채널 표면 자체도 동일 고분자전해질 코팅막을 입힐 수 있어서, 같은 성질의 고분자전해질 코팅막을 미세유체소자의 표면과 표면에 붙이고자 하는 금 나노입자에 같이 적용함으로써 금 나노입자와 유체소자 표면 사이의 커플링 반응을 시킬 수 있게 된다. 예를 들어 금 나노입자 쪽에 고분자전해질로 도입된 카르복실산과 미세유체소자 표면에 도입된 아민 활성기 사이에 아미드결합을 발생시키는 커플링 반응이다. 즉 도 2b에 도시한 바와 같이, 미세유체소자 표면에 고정된 고분자전해질 다층박막(PEM)의 최외각층인 PAH의 아민 활성기와 금 나노입자 표면의 고분자전해질 코팅막의 카르복실산 사이의 아미드 결합에 의한 커플링 반응으로 상기 금 나노입자를 미세유체소자 내에 고정하게 된다.
1-4 바이오분자 검출을 위한 SPR 측정 실험
표면 플라즈몬(Surface Plasmon)은 금속박막 표면에서 일어나는 전자들의 집단적 진동(collective charge density oscillation)이며, 이에 의해 발생하는 표면 플라즈몬파는 금속과 유전체의 경계면을 따라 진행하는 표면 전자기파이다. 도 3은 이러한 표면 플라즈몬 공명(SPR) 현상이 일어나기 위한 구조를 도식화한 것으로, 외부에서 금속박막과 유전체의 경계면에 전기장을 인가하면 두 매질의 경계면에서 전기장 수직성분의 불연속성 때문에 표면의 전하가 유도되고, 이 표면전하의 진동이 표면 플라즈몬파로 나타나며, 이런 플라즈몬파를 기기를 통해 분석하게 된다. 최근에는 이런 SPR 현상을 기초로 하는 바이오센서에 대한 연구가 증가하고 있다. SPR의 본래의 특성인 특정 물질의 검출하는 것은 신약개발에 응용이 되고 있으며, 유기 박막(Self-Assembled Monolayer)을 적층하여 기질의 표면을 개질하는 방법들이 사용되면서 SPR의 사용분야도 늘어나고 있다.
본 발명에서는 항체를 금 나노입자에 고정시킨 후에 항원을 주입함으로써 실시간으로 항원-항체를 검출할 수 있는 기능을 가진 SPR을 이용하여 실험을 진행하였다. 실험에 진행된 항체는 Immunoglobulin G human serum이고, 항원은 Anti-Rabbit IgG이다. SPR 측정실험은 두 가지 방향으로 진행되었다. 첫 번째 방법은 금 칩이 가지고 있는 금 박막 표면에 고분자전해질을 코팅하고 이를 이용해 항체를 고정한 후 항원으로 검출하는 것이다. 두 번째는 본 발명의 방법으로 금 칩에 고분자전해질을 코팅한 팔면체 금 나노입자의 표면에 항체를 고정한 후 SPR을 측정하는 것이다. 이는 기존의 금 칩 센서보다 더 높은 효율을 얻을 수 있다.
2. 실험 결과
2-1 고분자 다층막의 특성 평가
특정 기질에 적층된 PAH/PAA 고분자 전해질 다층막은 투명하여 육안으로는 고분자전해질의 적층 여부와 그 정도를 확인할 수 없다. 따라서 양이온 염료인 Methylene Blue hydrate(MeB)를 이용하였다. MeB를 이용하여 다층박막을 염색하고, UV-vis Abs.을 측정함으로써 다층박막의 적층 횟수에 따른 다층박막 내부의 기능기의 양을 정량적으로 확인하였다.
MeB 염료는 수용액에서 C16H18N3S+와 Cl-로 이온화되는데, 이중 C16H18N3S+ 부분이 다층박막 내에 존재하는 COO-그룹과 이온결합을 하여 투명했던 고분자 전해질 다층박막을 푸른색으로 염색한다. 다층박막 내에 COO-그룹과 반응한 MeB는 550∼600㎚ 영역에서 최대 흡광도를 보인다. 최외각층을 보면 BL(bilayers)수가 1, 3, 5, 7로 증가하면서 흡광도도 함께 증가하는 것을 알 수 있다. 이 결과를 통해 LbL 적층방법을 반복할수록 다층박막 내의 COO-그룹을 가진 PAA의 양이 증가하고, 이것은 표면 적층이 제대로 이루어진다는 것을 알 수 있다.
또한 도 4의 (a)와 (b)는 각각 고분자 전해질 용액의 pH농도의 변화에 따라 어떠한 영향을 미치는지 비교를 하였다. PAA의 경우 수용액에서 약산성을 나타내는 고분자 전해질이기 때문에 pH농도가 낮아질수록 낮은 이온화도를 나타내게 된다. 이것은 적층시 PAH와 결합하는 결합수가 감소하게 되고 상대적으로 MeB와 반응하는 작용기가 많아지기 때문에 PAA의 pH농도가 낮을수록 높은 흡광도를 나타낸다.
다층막의 특성 평가의 다른 방법으로 두께 측정이 있다. 실리콘 웨이퍼 기질에 고분자 박막을 형성하였다. 고분자 박막의 조성은 PAH/PAAn으로 n은 1부터 7.5까지 즉 1bilayer부터 7.5bilayer까지 다층막을 형성하고, 각 조건으로 8개의 시료를 Ellipsometer 측정하여 코팅된 막의 두께를 확인하였다.
도 5의 두께 측정 그래프를 보면 알 수 있듯이 고분자전해질이 적층이 되면서 두께가 증가하는 것을 볼 수 있다. 두께 증가량은 평균 6.5Å 정도로 증가하고 있지만 어떠한 고분자 전해질을 적층하는 가에 따라 두께 변화가 다르게 나타나는 것을 볼 수 있다. PAA 적층시 평균 두께 증가량은 5Å 정도이지만 PAH의 두께 평균 두께 증가량은 8.5Å로 PAA에 1회 적층시 증가량이 약 1.7배 정도 높다. 이것은 PAH 용액의 pH8.5 조건에서는 이온화도가 낮기 때문에 고분자사슬이 덜 펼쳐져 있는 코일형태로 존재하게 된다. 때문에 박막 적층시 표면 거칠기가 증가하기 때문에 두께 변화가 더 큰 것을 알 수 있다. 앞의 MeB염색을 이용한 UV-vis Abs. 흡광도 스펙트럼 결과와 Spectroscopic Ellipsometer의 결과로 볼 때 고분자 전해질 다층박막 형성이 정상적으로 이루어지는 것을 확인할 수 있다.
2-2 금 나노입자 표면에 고분자 전해질의 적층
본 발명은 금 나노입자 표면에 고분자 전해질을 적층함으로써 표면에 여러 가지 기능기를 갖게 하였다. 금 나노입자 표면에 고분자를 적층함으로써 표면 나노입자 표면 작용기를 다양화시킬 수 있으며, 표면적 증가는 상대적으로 적은 양의 금 나노입자로도 높은 반응성을 예상할 수 있다. 이를 위해서 고분자 전해질의 이온화도와 금 나노입자 용액의 농도 및 이온화도 변수를 조절하여 실험을 진행하였다. 도 6은 금 나노입자 표면에 고분자전해질 적층 전후의 표면 형태를 보여주는 SEM 이미지로, 표면 적층 전후에 따라 표면 형태가 바뀌는 것을 확인할 수 있었다. 도 6의 (a)는 본 실험에서 사용하는 고분자전해질 박막을 적층하기 전의 이미지로 표면 거칠기가 없지만, 고분자전해질을 적층한 (b)의 이미지를 보면 표면에 돌기 모양처럼 고분자가 흡착한 모습을 볼 수 있다. 이것으로 금 나노입자 표면에 고분자전해질이 적층 가능함을 알 수 있다.
2-3 항원-항체 반응을 통한 작용기 확인
본 실험은 금 나노입자 표면에 적층된 고분자전해질의 작용기를 이용하여 바이오분자를 검출할 수 있는지 알아보는 실험이다. 금 나노입자의 표면의 필름은 [PAH(8.5)/PAA(3.5)]4.5로 최외각 고분자전해질인 PAH의 아민기와 항체를 반응시켰다. 이 후 형광이 표지되어 있는 항원을 반응시키고 반응 결과를 형광현미경을 통해 알아보았다. 도 7의 (a)는 streptavidin과 Biotin-4-fluorecein의 반응결과를 나타내는 형광 이미지로 금 나노입자가 녹색 형광을 나타내는 것으로 보아 표면의 기능기가 바이오분자를 검출할 수 있음을 알 수 있다. (b)는 IgG와 Anti-Rabbit IgG-TRITC 의 반응을 통해 역시 금 나노입자에서 붉은색 형광이 나타나는 것을 확인 할 수 있다. 이것으로 항체가 성공적으로 표면에 고정된 금 나노입자가 항원을 효과적으로 검출할 수 있다는 것을 확인하였다.
2-4 미세유체소자에서의 바이오분자 검출
본 실험에서는 미세유체소자 채널 내부에 항체 IgG가 표면에 고정된 금 나노입자를 도입하는 실험을 진행하였다. 항체가 표면에 고정되어 있는 금 나노입자를 미세유체 채널 내에 유입하고 채널 내부에 적층한 최외각 고분자전해질 PAA의 카르복실기와 반응시켜 고정한 후, 항원을 흘려주었을 때 상기 항원을 효과적으로 검출 할 수 있는지 알아보는 실험이다. 도 8의 전체 미세유체소자 채널 구간에서 (a), (b)구간에서의 항원 검출을 형광현미경을 통해 항원 검출이 가능함을 알 수 있다. 흘려준 항원은 붉은 형광 표지를 가진 Anti-Rabbit IgG-TRITC(0.2mM)로 측정결과 항원과 결합한 금 나노입자를 관찰할 수 있었다. 이것은 기존의 유동이 없는 용액속에서의 항원검출뿐만 아니라 유체의 흐름 속에서도 특정 항원을 검출할 수 있다는 것을 보여준 결과이다.
2-5 바이오분자 검출을 측정한 SPR 결과
다면체 금 나노입자의 특성을 알아보는 실험으로 SPR기기를 이용하였다. SPR기기의 장점 중 하나는 실시간으로 항체를 검출할 수 있다는 것이다. 도 9는 금 칩 표면에 항체를 고정하는 것과 금 나노입자 표면에 항체를 고정하였을 때 각각의 반응성을 나타내고 있다. 도 9의 그래프를 보면 400초 정도에서 항원-항체 반응이 시작하면서 그래프와 같이 Response(RU) 값이 변화하게 된다. 주입한 항원의 양이 모두 반응에 참여한 후에 다시 버퍼만을 흘려주는데 이것은 안정화 과정이다. 이 과정은 약하게 결합되어 있거나 불필요한 항원을 제거해 주게 된다. 버퍼를 흘려주었을 때 값이 안정화에 접어들면 이때의 RU 값과 초기 RU값과의 차이가 실제 반응에 참여한 항원이 되는 것이다. 그래프를 보면 SPR 칩 표면에 항체를 고정한 것보다 금 나노입자에 항체를 고정한 후, 이러한 금 나노입자를 SPR 칩에 고정하는 경우가 더 반응성이 좋은 것을 알 수 있다. 이것으로 금 나노입자를 사용함으로써 SPR의 반응성을 높일 수 있음을 확인하였다.
3. 결론
본 발명에서는 표면에 카르복실기로 치환된 입자를 가지고 있는 팔면체 모양의 금 나노입자를 이용하여 고효율 바이오칩제조법을 제시하였다. 금 나노입자 표면에 항체를 고정하는 방법과 금 나노입자 표면에 Poly(allylanime hydrochloride)와 Poly(acrylic acid)고분자전해질을 이용하여 다층박막을 형성한 후 박막의 기능기를 이용하여 항체를 고정, 항원을 검출하였다. 다층박막의 적층 횟수에 따른 두께 변화와 기능기 변화를 Ellipsometer와 UV-vis.을 통해 확인하였다. 또한 금 나노입자 표면 고분자전해질 코팅을 SEM으로 확인하였으며, 광학현미경을 이용해 미세유체소자 내부에서 특정 바이오분자를 선택적으로 검출 가능함을 확인하였다. 고효율 바이오칩의 능력을 확인하기 위한 실험에서 SPR 센서를 통해 금 나노입자를 사용한 칩이 더 높은 효율을 가진 것으로 확인할 수 있었다.
이상과 같이 본 발명에 따른 금 나노입자와 고분자 코팅을 활용한 고효율 바이오칩의 제조방법 및 그에 의한 바이오칩에 대해서 예시한 도면을 참조로 하여 설명하였으나, 본 명세서에 개시된 실시예와 도면에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 기술사상의 범위 내에서 당업자에 의해 다양한 변형이 이루어질 수 있음은 물론이다.

Claims (13)

  1. 서로 상반된 전하를 가진 고분자전해질을 금 나노입자의 표면에 이온결합에 의해 교대로 적층하여 코팅하는 단계;
    상기 각 고분자전해질이 적층되어 코팅된 금 나노입자의 표면에 고분자전해질과 반응하는 항체를 고정하는 단계; 및
    상기 항체가 고정된 금 나노입자를 상기 고분자전해질이 적층되어 코팅된 특정 기질에 고정하는 단계를 포함하여,
    상기 금 나노입자와 특정 기질에 각각 코팅된 고분자전해질의 기능기에 의해 금 나노입자를 특정 기질에 고정하도록 하는 것을 특징으로 하는 금 나노입자와 고분자 코팅을 활용한 고효율 바이오칩의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 특정 기질은 미세유체소자이며, 상기 미세유체소자 내부의 채널에 금 나노입자를 고정하는 것을 특징으로 하는 금 나노입자와 고분자 코팅을 활용한 고효율 바이오칩의 제조방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 미세유체소자는 고분자플라스틱 재질(PDMS)로 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴, 폴리카보네이트, 폴리스티렌 중의 하나의 재질로 된 것을 특징으로 하는 금 나노입자와 고분자 코팅을 활용한 고효율 바이오칩의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 특정 기질은 SPR(표면 플라즈몬 공명) 칩인 것을 특징으로 하는 금 나노입자와 고분자 코팅을 활용한 고효율 바이오칩의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 금 나노입자는 80∼100nm의 다면체로 구성되며 표면에 카르복실기를 가진 것을 특징으로 하는 금 나노입자와 고분자 코팅을 활용한 고효율 바이오칩의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    서로 상반된 전하를 가진 고분자전해질은 양전해질 고분자(Polycation)(PAH)로 폴리알릴아민염소산(allylamine hydrochloride)을 사용하고, 음전해질 고분자(Polyanion)(PAA)로 폴리아크릴 산(polyacrylic acid) 또는 폴리메타클릴산(poly(methacrylic acid)(PMA) 중의 하나를 사용하되, 상기 양전해질 고분자와 음전해질 고분자의 순으로 금 나노입자의 표면에 교대로 적층하는 layer-by-layer(LBL) 적층법으로 코팅하는 것을 특징으로 하는 금 나노입자와 고분자 코팅을 활용한 고효율 바이오칩의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 고분자전해질의 코팅은 금 나노입자를 코팅액인 고분자전해질 용액에 분산하는 용액공정 코팅(dip-coating)에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 금 나노입자와 고분자 코팅을 활용한 고효율 바이오칩의 제조방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 양전해질 고분자와 음전해질 고분자의 분자량은 10000∼100000인 것을 특징으로 하는 금 나노입자와 고분자 코팅을 활용한 고효율 바이오칩의 제조방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 양전해질 고분자(PAH)의 pH농도는 pH7.0∼8.5이고, 상기 음전해질 고분자(PAA)의 pH농도는 pH3.0∼4.5인 것을 특징으로 하는 금 나노입자와 고분자 코팅을 활용한 고효율 바이오칩의 제조방법.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 고분자전해질 용액의 농도는 0.0001∼0.1M이고, 금 나노입자의 농도는 무게백분율로 0.0001∼0.5wt%인 것을 특징으로 하는 금 나노입자와 고분자 코팅을 활용한 고효율 바이오칩의 제조방법.
  11. 제6항에 있어서,
    상기 금 나노입자에 각각 한 종류의 양전해질 고분자와 음전해질 고분자가 교대 적층되어 코팅된 코팅층을 1 바이레이어(1 bilayer)로 하였을 때, 상기 각 양전해질 고분자와 음전해질 고분자를 번갈아 수회 반복적으로 적층하여 3∼7.5 바이레이어로 적층하는 것을 특징으로 하는 금 나노입자와 고분자 코팅을 활용한 고효율 바이오칩의 제조방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 금 나노입자에 적층하여 코팅된 최외각 고분자전해질과 특정 기질에 코팅한 고분자전해질 사이의 화학적 커플링 반응에 의해 금 나노입자를 상기 특정 기질에 고정하도록 한 것을 특징으로 하는 금 나노입자와 고분자 코팅을 활용한 고효율 바이오칩의 제조방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 금 나노입자와 고분자 코팅을 활용한 고효율 바이오칩.
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