JP5196749B2

JP5196749B2 - 標的物質検出材料、及びその製造方法

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Publication number: JP5196749B2
Application number: JP2006217348A
Authority: JP
Inventors: 美紀小川; 数理中浜
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Priority date: 2006-08-09
Filing date: 2006-08-09
Publication date: 2013-05-15
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Description

本発明は、検体中の標的物質を検出する検出材料及びその製造方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、生体由来の物質又はその類似物質の特異的な分子認識能を利用したいわゆるバイオセンサに好適に応用できる標的物質検出材料及びその製造方法に関する。

バイオセンサは生体や生体分子の持つ、優れた分子認識能を活用した計測デバイスである。生体内には、互いに親和性のある物質の組み合わせとして例えば酵素−基質、抗原−抗体、ＤＮＡ−ＤＮＡ等がある。バイオセンサはこれらの組み合わせの一方を基材に固定もしくは担持し、用いることによって、もう一方の物質を選択的に計測できるという原理を利用している。近年では、バイオセンサは医療分野のみならず、環境や食料品等の分野への幅広い応用が期待され、その使用領域を広げるためにも、あらゆる場所に設置あるいは持ち運び可能な小型、軽量、高感度なバイオセンサが望まれている。

そして、現在、高感度センシング方式のひとつとして、金属表面や金属微粒子に存在するプラズモンと光の相互作用を利用したセンサの研究が盛んに進められている。

従来の表面プラズモン共鳴を用いたセンサ（以下、ＳＰＲセンサと記載する）は、金属薄膜表面に光を入射させた時に、ある特定の角度から入射した光のみが金属表面プラズモンと共鳴して吸収される現象を利用している。この吸収の起こる角度は、金属薄膜の表面状態（屈折率）に敏感であり、入射角を変えながら反射光の強度を測定することによって、金属表面でおきる反応（例えば、抗原−抗体反応）等を測定することができる。

しかし、このＳＰＲセンサは、構成上プリズムが必要であり、光学系が複雑であった。そのため、小型化に限界があるとされてきた。また、基板上への金属薄膜を真空蒸着で作製するため、曲面状の内壁を持ったような基板には適用出来ず、基板に制限があった。つまり、構成形状が限られており、装置構成の簡易化、小型化が困難、応用範囲が狭いといった問題があった。

このような背景において、特開２０００−３５６５８７号公報では、金属微粒子による局在プラズモン共鳴を利用したセンサが開示されている。当該センサは、基板表面に膜状に固定された金属微粒子を透過した光の吸光度を測定することにより金属微粒子近傍の媒質の屈折率を検出する局在プラズモン共鳴（ＬＳＰＲ）センサである。このセンサユニットは、プリズムが不要で、狭隘な場所に配置可能であり、曲面形状の基板にも適用可能であると記載されている。

また、米国特許第６３４４２７２号明細書には、非導電性コア層と導電性シェル層からなるコアシェル粒子であるナノ粒子が、３００ｎｍから２０μｍの間に吸収波長を有し、ケミカルセンシングデバイスに用いられることが開示されている。
特開２０００−３５６５８７号公報米国特許第６３４４２７２号明細書

しかし、特開２０００−３５６５８７号公報に開示されている発明では、直径約２０ｎｍの金コロイドを用いているが、金微粒子の形状に関する詳細な記述はない。よって、金微粒子の形状は略球状の単純な構造であると考えられる。つまり、特開２０００−３５６５８７号公報では、金微粒子の構造が制御されていないため、感度向上において不十分となる可能性があった。

これに対して、米国特許第６３４４２７２号明細書では、コアシェル構造の粒子が提案されているが、バイオセンサとして利用するために、さらなる高感度化が期待されている。

特に、抗原抗体反応の特異性を利用したイムノ・アッセイ等のアフィニティ・アッセイを行う場合、検出する金属微粒子近傍の媒質の屈折率変化は小さく、高い検出感度が必要となる。

本発明は、上記問題点を鑑みなされたもので、その目的は、高感度な検出が可能な標的物質検出材料、及びこの材料の製造方法を提供することにある。

本発明の研究者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、プラズモン共鳴法を利用した高感度な検出が可能な構成の標的物質検出材料を見出し、本発明に至った。

すなわち本発明の第一の態様は、プラズモン共鳴法を利用して検体液中の標的物質を検出するための標的物質検出材料であって、
１.２０以上１．４０以下の屈折率を有する材料を有する粒子状中心体と、
該中心体の外周を被覆する金属含有層と、
前記金属含有層と前記粒子状中心体の間に設けられる、リポソームを有する中間層と、を有する粒子状多層構造体からなることを特徴とする標的物質検出材料である。

また、本発明の第二の態様は、プラズモン共鳴法を利用して検体液中の標的物質を検出する標的物質検出材料の製造方法であって、
内部に水を含有するリポソームを作製する工程と、
前記リポソーム表面に金属粒子を担持させる工程と、
前記金属粒子を核として金属含有膜を成長させて外層を形成する工程と、
前記標的物質を捕捉する捕捉体成分を外層表面に担持する工程と、
を有することを特徴とする標的物質検出材料の製造方法である。

本発明により、高感度な標的物質検出材料、及びその製造方法を提供することが可能と成る。さらに例えば、アフィニティ・アッセイなどの高い検出感度が必要な検出方法に利用することが可能と成る。

次に、本発明の好ましい実施の形態について、詳細に説明する。

まず、本発明による標的物質検出材料（以下、検出材料と記載する）について説明する。

本発明による検出材料は、プラズモン共鳴法を利用して検体液中の標的物質を検出するための検出材料であって、当該検出材料が多層構造を有する粒子状構造体であり、当該構造体の外層が金属を含有し、当該構造体の内層が低屈折率材料を含有することを特徴とする。本発明による検出材料は、特に検体液が血液等の水溶液を対象としたバイオセンサに好適な材料である。
（粒子状構造体）
本発明における多層構造を有する粒子状構造体の好ましい一例を図１（ａ）に示す。図１（ａ）に示すように、この粒子状構造体は、少なくとも、外側の領域３と面する外層２と中心を含む内核を形成する内層１を有する。そして、外層２に含有される金属によるプラズモン共鳴効果を利用して、外層表面近傍の屈折率変化、つまり物質の有無や濃度を検出可能とするものである。よって、この効果を用いた検出が可能であれば、図１（ａ）の構成以外にも、図１（ｂ）のように外層２と内層１の間に中間層６を有していたり、外層２、内層１または中間層６がそれぞれ複数の層からなる構成であっても構わない。コアシェル構造による局在プラズモン効果を得るためには、外層は、連続して形成され内側の層を完全に被覆していることが望ましいが、必ずしも完全被覆するものに限定されない。粒子状構造体の粒子径は、好ましくは１ｎｍ以上５００ｎｍ以下、より好ましくは１０ｎｍ以上３００ｎｍ以下であることが、局在プラズモン効果、もしくはセンシングに利用しやすい領域の吸収波長を得るために有効である。

また、当該粒子状構造体の形状も、球状、棒状、多角形状、ディスク状等、種々の形状に適用可能である。

当該構造体の外層に含まれる金属には、検出で用いられる波長帯においてプラズモン共鳴効果を示す金属が用いられ、好ましくは、金、銀、銅、アルミニウム、白金、亜鉛またはカリウムが利用できる。特に好ましくは、銀または金である。銀は、耐食性が弱いものの、感度が高く、好適に用いられる。また、金は、耐食性が高く安定な検出材料を作製することができる、あるいはチオールやアミノ基等を用いた表面修飾や固定化が容易であるといった利点を有し、好適に用いられる。

図１（ａ）に示す構造では、界面Ａ４（外層２と内層１の界面）と界面Ｂ５（外層２とさらにその外側の領域３の界面）が存在する。界面Ａ４と界面Ｂ５におけるプラズモン共鳴条件が異なることが吸光スペクトルにおける波長ピークのブロード化の一因である。外層と内層の屈折率、外側の領域と外層の屈折率の関係が異なると、各界面におけるプラズモン共鳴条件が異なり、ピークのブロード化につながると考えられる。よって、このふたつの屈折率の関係を揃え、よりふたつの共鳴条件を揃えれば、波長ピークがシャープになることが予想される。つまり、内層と、外層のさらに外側の領域との屈折率が近ければ、この効果が得られ、感度向上が予想される。

前記バイオセンサとしてこの検出材料を使用する場合、外層の外側の領域は血液等の水溶液からなる検体液である場合が多い。よって、本発明のように、内層を、血液等の水溶液の屈折率に近い低屈折率材料を用いて形成することで感度向上に寄与することが可能となる。低屈折率材料としては、屈折率が１．２０以上１．４０以下の範囲にあることが好ましく、１．３０以上１．３６以下の範囲にあるとさらに好ましい。これらの範囲にある材料として、例えばフッ素系樹脂からなる粒子を内層として好適に用いることができる。さらに好適には、内層を、水または水を含有する層（水含有層）とすることができる。内層が複数の層からなる場合、外層または中間層と接していない、より内側の層に低屈折率材料を用いない構成としてもよい。

尚、本発明においては、前述のように外層と内層の間に中間層を有してもよい。この場合、検出材料の強度を更に向上させることが可能となる、また、後に製造方法において詳細に説明するが、本発明による検出材料の製造を簡便化することができる。尚、前述の感度向上効果を得られれば、中間層は材質等限定されるものではないが、より前述の感度向上効果を得るためには、この中間層の厚さは薄いほうが望ましく、望ましくは５０nm以下、より望ましくは３０nm以下である。両親媒性物質からなる自己集合膜を中間層として好適に用いることが出来る。とくにリン脂質からなるリポソームは、リン脂質の二分子膜により形成される小胞であり、水相を内包することができるため、リポソームのリン脂質膜を中間層とし、リン脂質膜に内包される水相を内層とする粒子状構造体として好適に用いることができる。リポソームのサイズは数十〜数百ｎｍに容易に制御でき、本発明に好適である。また、後に説明する製造方法においても簡便であるため、好ましい。

（捕捉体成分）
本発明による検出材料は、外層の表面に検体中の標的物質を捕捉する捕捉体成分を有していることが好ましい。

使用する捕捉体成分は、検体中の標的物質の選択に係わる物質であり、例えば、検体中の標的物質と選択的に直接反応する物質（いわゆるレセプター）、標的物質の反応に係わる物質（例えば、標的物質の反応に選択的に触媒作用をもたらす物質）等である。また、この捕捉体成分は、検出の有無や程度の表示に係わる機能、例えば、レセプターが放出する物質や残余の物質と反応し発色する機能等を兼ねるものであってもよい。本発明に使用される捕捉体成分には、酵素、糖鎖、触媒、抗体、抗原、遺伝子、呈色試薬、などが挙げられるがこれらに限る物ではない。

（検出材料の製造方法）
次に本発明による製造方法について説明する。

以下の工程（Ａ）〜工程（Ｃ）を行うことで標的物質検出材料を作製することが出来る。
すなわち、工程（Ａ）内層を作製する工程、工程（Ｂ）外層を作製する工程、工程（Ｃ）外層表面に捕捉体成分を担持する工程である。
以下、それぞれについて詳細に説明する。

工程（Ａ）内層を作製する工程
本工程では、低屈折率材料を含有する内層を作製する。よって、前述のように、フッ素系樹脂等の低屈折率材料からなる粒子を作製してもよいし、市販のものを使用してもよいが、ここでは、より好ましい形態である水を含有した内層を作製する方法について説明する。

前述のように、両親媒性物質からなる自己集合膜を中間層として用いると、内部に水を含有したカプセル状粒子を作製することが可能となる。とくに、両親媒性物質にリン脂質を用いると、脂質は水溶液中で自己集合し、内部に水溶液を閉じ込めた二重層膜の小胞、つまりリポソームを作ることができ、好適である。この場合、水溶液が内層、二重層膜が中間層となるが、このように内層と中間層が同時に成立する構造である場合は、同時に形成されても構わない。

尚、エクストルージョン法により単分散リポソームを作製する技術も知られており、本工程に好適に用いることができる。エクストルージョン法とは、ポリカーボネート濾過膜等を使った濾過操作によって、大きなリポソームを切断し、濾過膜のポアサイズまで小さくする方法である。小粒子径リポソームの作製やリポソームのサイズ均一性を向上させる場合に利用する方法であり、このような粒子径の均一化処理を行うことで、検出材料内のバラツキを減らし、吸光スペクトルの波長ピークをさらにシャープにすることが可能となる。また、粒子の強度向上のために、ポリマー等でリポソームをさらに被覆してもよい。この場合、感度向上効果を充分得るために、被覆厚は薄いほど好ましく、好ましくは１０ｎｍ以下、さらに好ましくは５ｎｍ以下の厚さがよい。

工程（Ｂ）外層を作製する工程
本工程では、金属を含有する外層を作製する。つまり、内層の外側に金属含有層を被覆できれば、方法は限定されるものではないが、ここでは、金微粒子を核として金層を成長させて、外層とする方法を例として説明する。

まず、内層、もしくは、中間層を有する内層の表面に金微粒子を担持する。まず、内層、もしくは、中間層を有する内層表面に金属と結合しやすい官能基を露出させる。この操作には、チオール基、ジスルフィド基、アミノ基といった金属と結合しやすい官能基を有するカップリング剤を使用することで行ってもよいが、工程（Ａ）において、内層作製時に同時にこれらの官能基を形成することも可能である。例えば、金属と結合しやすい官能基を有するリン脂質を用いることで、中間層となる二重層膜にこれらの官能基をもたせることが可能である。また、リポソームにポリマーコートをする場合、これらの官能基を含有するポリマーを用いることでこの操作を行ってもよい。

このような官能基が露出した内層、もしくは、中間層を有する内層を用意すれば、別途用意する金属微粒子を担持することが可能となる。担持方法としては、金属微粒子分散液に、前記内層、もしくは、中間層を有する内層を混合するという操作が簡便であり、好適である。金属微粒子は１０ｎｍ以下のサイズが好ましく、市販されているものを用いてもよいし、金属イオンの還元処理等により作製してもよい。このような操作を経ることで、図２（ｂ）のような金属微粒子を表面に担持することが可能となる。そして、さらに、前記金属微粒子を核として、さらに外層となる部分を成長させることで、図２（ｃ）のような、内層、もしくは、中間層を有する内層の周囲をほぼ完全に覆うような外層を形成させることができる。この成長処理は、金属や金属塩を含む溶液に、内層、もしくは、中間層を有する内層を混合し、還元処理を行うことで可能となる。還元処理には、還元剤の添加、ｐＨの調整、加温、光照射、超音波処理等が挙げられる。

工程（Ｃ）外層表面に捕捉体成分を担持する工程
本工程では、外層表面に捕捉体成分を担持する。（図２（ｄ））前記の捕捉体成分は、例えば、共有結合、イオン結合または吸着などによって、外層表面に担持されるが、これらの成分が良好に固定又は担持されれば方法はこれらに限らない。

結合による方式では、外層表面に直接作用できる反応基を持った捕捉体成分を直接反応させて結合させてもよいし、外層表面に直接作用出来る架橋材料を反応させて、さらに前記架橋材料に捕捉体成分を反応させることで結合させても構わない。例えば、外層が金、銀もしくは銅を含有する場合は、チオール基やアミノ基等を有する捕捉体成分を直接固定することができる。また、外層にチオール基やアミノ基等を有するシランカップリング剤等の架橋材料を反応させて、さらにこの架橋材料に捕捉体成分を結合させることで固定することもできる。

吸着による方式では捕捉体成分と、外層の材質との組み合わせにおいて、適当な親和性を有する組み合わせを選択すればよい。また、外層表面をいったん表面修飾することで、適当な親和性を有する表面を形成し、捕捉体成分を固定することも可能である。

（検出方法）
本発明による検出材料に標的物質を含む検体液を接触させると、検出材料近傍の特性が変化する。特に、検出材料が捕捉体成分を有している場合は、捕捉体成分と標的物質との特異的な反応が検出材料表面で起こり、それによって検出材料近傍の特性が変化することになる。そして、検出材料に対して光を照射し、前記検出材料から透過もしくは反射した光の特性を検出することで、前記検出材料近傍の特性変化を検出することが可能と成る。

尚、本発明による検出材料は、液中に分散させて使用することが可能であり、または基板等に固定し、検出素子として使用することも可能である。この際、基板は検出材料を好適に担持することが出来れば、形状、材質等限定されるものではなく、樹脂、ガラス、シリコン等の無機材料、金属、金属酸化物等の一般的な基板を用いる事が可能である。但し、検出材料を透過し、さらに基板を透過した光を検出素子からの透過光として検出に用いる場合は、基板は、入射光及び、検出を行う光の波長に対して、透明な材質が好ましい。また、検出材料を透過した後に基板により反射した光を検出素子からの反射光として検出に用いることも可能であり、この場合基板は、入射光及び、検出を行う光の波長に対して反射する材質を用いることが好ましい。

また、検出材料を強固に担持するために、基板表面にアミノ基やチオール基などの金属と親和性の高い官能基が形成されていることが好ましい。

尚、本発明の検出材料の測定対象は、直接捕捉体成分が反応する標的物質である必要は無く、間接的に測定できるものでもよい。例えば、測定対象に特異的に存在する標的物質を検出することで測定が可能となる。よって、測定対象は生体物質に限るものではなく、またそのサイズも限定されるものではない。ただし、標的物質は糖、蛋白質、アミノ酸、抗体、抗原や疑似抗原、ビタミン、遺伝子などの生物に含有される生体物質、及び、その関連物質や人工的に合成された擬似生体物質であることが望ましい。生体物質および生体類似物質以外の物質を標的物質とすることも可能である。例えば、ＰＣＢやダイオキシン等の環境汚染物質や金などの金属物質を標的物質として、これらを抗原とする抗体を捕捉体成分として用いる場合が挙げられる。

また、複数種の捕捉体成分を複合して使用することも可能であり、本発明による検出材料を用いて、例えば、複合酵素センサ、抗体−酵素センサ、酵素−微生物ハイブリッドセンサ、などの検出装置を構成することも可能である。

以下、実施例を用いてさらに詳細に本発明を説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではなく、材料、組成条件あるいは反応条件等において同様な機能、効果を有する検出素子、検出装置が得られる範囲で自由に変えることができる。

（実施例１）
本実施例は、リポソームからなる中間層を有する内層、及び、金からなる外層を作製し、さらに外層表面に捕捉体成分としてウサギ抗マウスＩｇＧ抗体を固定して、標的物質検出材料を作製する例である。

まず、リポソームからなる中間層を有する内層を作製する。

リン脂質１０^-5ｍｏｌをナスフラスコに採取し、クロロホルム−メタノール混合溶媒に溶解させる。リン脂質には、Ｌ−α−Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃａｃｉｄ，ＤｉｌａｕｒｏｙｌＭｏｎｏｓｏｄｉｕｍｓａｌｔ（以下、ＤＬＰＡと記載する）とＬ−α−Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ，Ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ（以下、ＤＭＰＣと記載する）の１：１混合物を用いる。そしてさらに、任意の割合で、（１，２−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏ−ｅｔｈａｎｏｌ）ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄを混合する。エバポレータで混合溶媒を減圧除去し、ナスフラスコ壁にリン脂質のフィルムを形成させる。次にナスフラスコにバッファー（Ｎａ₂ＨＰＯ₄−ＮａＯＨ（ｐＨ１１．４）緩衝液）１ｍｌを加えて多重膜リポソームを形成させる。凍結融解法にて多重膜リポソームを融合させ、次いでエクストルージョン法により単分散リポソームを作製する。エクストルージョンには、孔径が１００nmのポリカーボネートフィルターを用いた。動的光散乱法により単分散リポソームの平均粒子径は約１００ｎｍであることを確認する。

以上の操作により表面にチオール基を有したリポソームからなる中間層と、水溶液からなる内層を作製することができる。

次に、金からなる外層を形成する。

先に用意された中間層を有する内層を水中に分散させ、ここに別途用意する金微粒子分散液を加える。この分散液を数分間攪拌した後２時間静置し、遠心分離を行い、上澄を除去して新たに脱イオン水を加え再懸濁し、金微粒子が表面に固定された中間層を有する内層（以下、金微粒子固定化内層と記載する）を得る。

これとは別に、１００ｍｌの脱イオン水に２５ｍｇの炭酸カリウムを加え、１０分間撹拌した後、１．５ｍｌの１％ＨＡｕＣｌ₄水溶液を加える。当初黄色の反応液が無色になるまで静置する。

得られた無色水溶液に、先に用意された金微粒子固定化内層の分散液を加え、更にホルムアルデヒドを加えて、反応させる。前記無色水溶液と金微粒子固定化内層の分散液の混合比は、所望の金コーティング層の厚さ、形態に応じて適宜決めればよい。本実施例では金コーティング層の層厚は例えば２０ｎｍとすることができる。尚、ホルムアルデヒドは還元剤の一例であり、添加量は前記混合比等に応じて適宜決められる。また、還元処理には、還元剤の添加の他、ｐＨの調整、加温、光照射、超音波処理等を行ってもよい。

以上の操作により金から成る外層と水溶液を含む内層からなる構造体を作製することができる。

次に、用意された構造体の外層表面に捕捉体成分として、抗体を固定する。本実施例では、抗体としてウサギ抗マウスＩｇＧ抗体を用いる。

まず、金と親和性の高いチオール基を持つ、１１−Ｍｅｒｃａｐｔｏｕｎｄｅｃａｎｏｉｃａｃｉｄのエタノール溶液に前記構造体を浸漬する。この操作により、構造体外層表面にカルボキシル基が露出される。次に、Ｎ−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ水溶液と１−Ｅｔｈｙｌ−３−［３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ］ｐｒｏｐｙｌ］ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ水溶液に同様に浸漬する。これらの操作により、構造体表面にスクシンイミド基が露出することになる。続いて、ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体／トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、前記構造体を浸漬する。そして、外層表面上に形成された前記スクシンイミド基とウサギ抗マウスＩｇＧ抗体のアミノ基を反応させることにより、ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体を外層表面に固定する。尚、外層表面上の未反応のスクシンイミド基は、ＨｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅＨｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅを添加して脱離させてもよい。

以上の操作を経る事で、金から成る外層と水溶液を含む内層からなり、捕捉体成分として、ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体を有する検出材料を作製することができる。

（実施例２）
本実施例は、中間層にポリマーコートを行い、強度を高めた標的物質検出材料を作製する例である。

リン脂質１０^-5ｍｏｌをナスフラスコに採取し、クロロホルム−メタノール混合溶媒に溶解させる。リン脂質には、ＤＬＰＡとＤＭＰＣの１：１混合物を用いる。エバポレータで混合溶媒を減圧除去し、ナスフラスコ壁にリン脂質のフィルムを形成させる。次にナスフラスコにバッファー（Ｎａ２ＨＰＯ４−ＮａＯＨ（ｐＨ１１．４）緩衝液）１ｍｌを加えて多重膜リポソームを形成させる。凍結融解法にて多重膜リポソームを融合させ、次いでエクストルージョン法により単分散リポソームを作製する。エクストルージョンには、孔径が１００nmのポリカーボネートフィルターを用いた。動的光散乱法により単分散リポソームの平均粒子径は約１００ｎｍであることを確認する。

次に、アミノ基含有ポリマーでリポソームを被覆する。アミノ基含有ポリマーとして重量平均分子量１００００のＰｏｌｙ−Ｌ−ＬｙｓｉｎｅＨｙｄｒｏｂｒｏｍｉｄｅ（以下ＰＬＬ）を用いる。１００ｐｐｍとなるようにＰＬＬをバッファーに溶解させＰＬＬ溶解液を作製する。リポソーム分散液にＰＬＬ溶解液を加え、ＰＬＬを単分散リポソームに吸着させることによりリポソーム／ポリマー複合粒子を作製する。未吸着のＰＬＬとリポソーム／ポリマー複合粒子は遠心分離法により分離・精製する。動的光散乱法によりリポソーム／ポリマー複合粒子の平均粒子径は約１０８ｎｍであることを確認する。

以上の操作により表面にアミノ基を有したポリマーにより被覆されたリポソームからなる中間層と水溶液からなる内層を作製することができる。

さらに実施例１と同様な方法で、別途作製する金微粒子をポリマー表面に担持させ、塩化金酸の還元処理を行うことで、金から成る外層と水溶液を含む内層からなる構造体を作製することができる。

さらに、実施例１と同様な方法によりウサギ抗マウスＩｇＧ抗体を先に用意した、構造体の外層表面に固定することで、金から成る外層と水溶液を含む内層からなり、捕捉体成分として、ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体を有する検出材料を作製することができる。

（実施例３）
本実施例は、実施例１で作製した標的物質検出材料を用いて、マウスＩｇＧを検出する例である。

まず、実施例１と同様な方法で、検出材料を作製する。

次にこの検出材料を用いて検出を行う。本実施例においては、検出材料を液中に分散させて使用する検出方法について説明する。

図３は本実施例の検出概念を模式的に示した図である。検出時の光源の位置は、図３に模式的に示すように、検出材料に対して、測定光を照射しえる位置である。受光素子の位置は検出材料分散液を透過した測定光の特性を検出しうる位置である。尚、この他に、図示しない分光検出器が受光素子に備えられていても構わない。さらには、図示しないが、検出した特性変化を演算する演算装置、検出結果を表示する表示手段等が備えられていることが好ましい。検出材料分散液には、溶媒に水を用い、下記の検体液と同じリン酸緩衝液を好適に用いることができる。

まず、上記検出時の位置関係に検出材料分散液、光源、受光素子を配置し、スペクトルを検出する。その後、検出材料分散液に標的物質としてマウスＩｇＧが含まれたリン酸緩衝溶液からなる検体液を添加し、検出材料に接触、捕捉体成分と反応させる。その後再び、上記検出時と同様な位置関係に検出材料分散液、光源、受光素子を配置し、スペクトルを検出する。検体液添加前後のスペクトル変化は、検出材料のプラズモン共鳴状態の変化に由来するものであり、検出材料表面で抗原抗体反応が起こり、捕捉体成分により標的物質が捕捉されたことを意味する。よって、スペクトル変化を検出することで、検体中の標的物質を検出することが可能と成る。

また、ここでスペクトルの変化と標的物質濃度の関係については、あらかじめ、既知の複数濃度の標準検体を用いて、スペクトル変化と濃度の関係を取得しておき、この関係をもとに検量線を求めスペクトル変化と濃度の関数を求めておくことができる。この関数を用いて、実際の計測時のスペクトル変化から標的物質濃度を求めることができる。

尚、ここではスペクトルの変化と記載したが、このスペクトル変化は、最大値をもつ波長でのスペクトルピークの変化でもよいし、スペクトルピークの波形の半値幅等ピーク形状の変化を用いてもよい。さらには、一つあるいは、複数の波長点での光強度を用いても構わない。

以上説明したように、本発明による標的物質検出材料を用いる事で、検体液中の標的物質を充分な感度で検出することが可能と成る。

（実施例４）
本実施例は、標的物質検出材料を基板上に固定した検出素子を用いて、マウスＩｇＧを検出する例である。

まず、実施例２と同様な方法で、金から成る外層と水溶液を含む内層からなる材料、つまり抗体を固定化していない構造体を作製する。液中に検出材料を分散させ、構造体分散液を作製する。この際、分散剤を用い、分散能を挙げることが好ましい。

次に、表面がアミノ化処理されたガラス基板を用意する。アミノ化処理はアミノシラン溶液にガラス基板を浸漬、洗浄することで容易に行うことができる。前記ガラス基板を前記構造体分散液に浸漬した後に、分散媒で洗浄する。

以上の操作を経る事で、ガラス基板上に、図４に示すように構造体を固定化することができる。

次にガラス基板上に固定化した構造体の外層表面に抗体を固定化する。本実施例では、抗体としてウサギ抗マウスＩｇＧ抗体を用いる。

まず、実施例１と同様に、１１−Ｍｅｒｃａｐｔｏｕｎｄｅｃａｎｏｉｃａｃｉｄのエタノール溶液を構造体が担持されたガラス基板上に塗布する。次に、Ｎ−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ水溶液と１−Ｅｔｈｙｌ−３−［３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ］ｐｒｏｐｙｌ］ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ水溶液を同様に塗布する。ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体／トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に前記構造体が担持されたガラス基板を浸漬する。そして、構造体の外層表面上に形成された前記スクシンイミド基とウサギ抗マウスＩｇＧ抗体のアミノ基を反応させることにより、ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体を構造体の外層表面に固定する。

以上の操作を経る事で、捕捉体成分としてウサギ抗マウスＩｇＧ抗体を有し、ガラス基板上に固定化された検出材料からなる検出素子を作製することができる。

次にこの検出素子を用いて検出を行う。本実施例は検出素子を透過した光により検出を行う例である。

図５（ａ）は本実施例の検出概念を模式的に示した図である。検出時の光源の位置は、図５（ａ）に模式的に示すように、検出素子に対して、測定光を照射しえる位置である。受光素子の位置は検出素子を透過した測定光の特性を検出しうる位置である。尚、この他に、図示しない分光検出器が受光素子に備えられていても構わない。さらには、図示しないが、検出した特性変化を演算する演算装置、検出結果を表示する表示手段等が備えられていることが好ましい。

まず、上記検出時の位置関係に検出素子、光源、受光素子を配置し、スペクトルを検出する。その後、検出素子に標的物質としてマウスＩｇＧが含まれたリン酸緩衝溶液からなる検体液を付与し、検出素子に接触、捕捉体成分と反応させる。この反応後、検出素子表面をリン酸緩衝溶液で洗浄するとよい。その後再び、上記検出時と同様な位置関係に検出素子、光源、受光素子を配置し、スペクトルを検出する。検体液付与前後のスペクトル変化は、検出材料のプラズモン共鳴状態の変化に由来するものであり、検出素子上で抗原抗体反応が起こり、捕捉体成分により標的物質が捕捉されたことを意味する。よって、スペクトル変化を検出することで、検体中の標的物質を検出することが可能と成る。

尚、実施例３と同様に検量線を求める事で、標的物質濃度を求めることも可能である。

また、実施例３と同様に、スペクトル変化は、スペクトルピーク波長の変化でもよいし、スペクトルピークの形状の変化を用いてもよく、さらには、一つあるいは、複数の波長点での光強度をもちいても構わない。

（実施例５）
本実施例は、標的物質検出材料を基板上に固定した検出素子を用いて、マウスＩｇＧを検出する例である。

まず、実施例２と同様な方法で、金から成る外層と水溶液を含む内層からなる材料、つまり抗体を固定化していない構造体を作製する。そして、実施例４と同様な方法でシリコン基板上に構造体を固定し、捕捉体成分としてウサギ抗マウスＩｇＧ抗体が外層表面に固定された検出材料からなる検出素子を作製する。

次にこの検出素子を用いて検出を行う。本実施例は検出素子を反射した光により検出を行う例である。

図５（ｂ）は本実施例の検出概念を模式的に示した図である。検出時の光源の位置は、図５（ｂ）に模式的に示すように、検出素子に対して、測定光を照射しえる位置である。受光素子の位置は検出素子を透過した測定光の特性を検出しうる位置である。尚、この他に、図示しない分光検出器が受光素子に備えられていても構わない。さらには、図示しないが、検出した特性変化を演算する演算装置、検出結果を表示する表示手段等が備えられていることが好ましい。

本発明に係る粒子状構造体の構成を示す概略図である。（ａ）外層と内層を有する構成。（ｂ）外層、中間層および内層を有する構成。本発明に係る粒子状構造体の内層に外層を被覆する工程を示す図である。（ａ）内層。（ｂ）金属微粒子を担持した内層。（ｃ）外層を被覆した内層。（ｄ）捕捉体成分を担持した粒子状構造体。実施例３の検出概念を模式的に示した図である。（ａ）透過光型。（ｂ）反射光型。本発明に係る検出素子における、基板上に構造体を固定化した模式図である。実施例４の検出概念を模式的に示した図である。（ａ）透過光型。（ｂ）反射光型。

符号の説明

１内層
２外層
３外側の領域
４界面Ａ
５界面Ｂ
６中間層

Claims

プラズモン共鳴法を利用して検体液中の標的物質を検出するための標的物質検出材料であって、
１.２０以上１．４０以下の屈折率を有する材料を有する粒子状中心体と、
該中心体の外周を被覆する金属含有層と、
前記金属含有層と前記粒子状中心体の間に設けられる、リポソームを有する中間層と、
を有する粒子状多層構造体からなることを特徴とする標的物質検出材料。
前記１.２０以上１．４０以下の屈折率を有する材料が水であることを特徴とする、請求項１に記載の標的物質検出材料。
前記金属含有層が金を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の標的物質検出材料。
前記金属含有層の表面に、前記標的物質を捕捉する捕捉体成分を有していることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の標的物質検出材料。
プラズモン共鳴法を利用して検体液中の標的物質を検出する標的物質検出材料の製造方法であって、
内部に水を含有するリポソームを作製する工程と、
前記リポソーム表面に金属粒子を担持させる工程と、
前記金属粒子を核として金属含有膜を成長させて外層を形成する工程と、
前記標的物質を捕捉する捕捉体成分を外層表面に担持させる工程と、
を有することを特徴とする標的物質検出材料の製造方法。