JP2010230679A - 生体感知用途のための金属微細シェル - Google Patents

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Abstract

【課題】ラマン散乱を使用した生体分析物のインビトロ及びインビボでの検出方法を簡便化するとともに感度を向上させる。
【解決手段】微細粒子(「微細シェル」)を使用し、該粒子は非伝導性コア及びそのコアを取り囲む金属シェルを有する。所定のコア及びシェルの材料については、金属シェルの厚さに対するコアの厚さ（すなわち、半径）の比は粒子の最大吸光度波長を決める。コア及びシェルの相対的な厚さを制御することによって、電磁スペクトルの紫外から赤外領域の所定の波長における光を吸収する生体感知金属微細シェルが形成される。粒子の面は関係する分析物に特有の増幅されたＳＥＲＳ信号を誘起することができる。ある実施の形態においては、生体分子は金属シェルに結合され、配座変化又は反応生成物のＳＥＲＳ信号が検出される。
【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
この出願は、１９９８年３月１１日に出願された同時係続中の米国特許願第09/038,377号の一部継続出願であり、１９９９年７月１６日に出願された米国仮出願第60/144,136号の利益も主張している。これらの出願の開示内容はここにおいて文献援用される。
連邦政府によって援助された研究及び開発についての陳述
この発明は、海軍研究事務所によって付与された認可第N00014-97-1-0217号及び国立科学基金によって付与された認可第ECS-9258118号の下に政府援助された。アメリカ合衆国政府はこの発明に対して所定の権利を有する。
発明の背景
発明の分野
この発明は、概して、極めて薄い金属層でコーティングされた非伝導性コアから構成された粒子、及び化学物質又は生体分析物を感知するためにこれらの粒子を使用する方法に関する。さらに詳しくは、この発明は決められた最大吸収又は散乱波長を有するとともに、金属層に接合された一つ又は複数の生体分子を選択的に有するそのような粒子に関する。
関連技術の説明
ラマン散乱強度の著しい増幅が多くの生物的に重要な有機分子から可能であることが長い間観測されてきた。それは、それらの分子が粗い銀電極又は凝集コロイド溶液に吸収されるときに見られる。（Fleischmann，M．et al．J．Chem．Soc．Commun．80 (1973);Duff，D．G．，et al．Langmuir 9:2301 (1993)）この効果は、表面増幅ラマン散乱(SERS)として知られるもので、溶液中の同一分子のスペクトルよりも百万倍もの強度のラマンスペクトルを生成することができる。このアプローチは可視励起を用いたラマンスペクトロスコピーではポピュラーであるけれども、ＳＥＲＳ増幅は、ＦＴ−ラマンペクトロスコピーの場合のように、近赤外励起源が使用されるとき、ほとんど唯一の必要条件になる。赤外励起はサンプル蛍光を除去するけれども、それは感度の著しい低下ももたらし、さらに、増感法の必要性を示唆する。近赤外ＦＴ−ラマンペクトロスコピーのＳＥＲＳ増幅のために使用されている現行の方法は、基材作成の困難さ、再現性の悪さ、汚染物への感度、又はインビボ使用への適合性の限界によって、悩まされることが少なくない。
ＳＥＲＳ効果は、基材が粗い金属面であろうと金属微細粒子の凝集体であろうと、主として、照射による基材の面付近の磁界強度に関する。最も強い磁界増幅は金属基材又は粒子のプラスモン共鳴において得ることができる。金コロイド（プラズモン共鳴＝５２０nm）が可視ラマン励起（一般的には、５１４nmにおけるアルゴンイオンレーザによって）の下でそうした有効なＳＥＲＳエンハンサであるのはこのためである。この共鳴はヘモグロビンの最大吸収と一致する（Gordy，E．et al．J．Biol．Chem．227:285-299(1975)）けれども、そのことは生体システムに対する可視励起ラマンペクトロスコピーの使用を著しく制限する。
生体感知用途におけるＳＥＲＳを利用するアイデアは、ほんの一時的に、他の戦略を用いて実施されていた。当時の作業者は、抗原−抗体相互作用を含め、相互親和性の生体分子間の結合を測定するためにＳＥＲＳを使用してきた（Rohr，T．E．，et al．Anal．Biochem．182:388-398(1989)）。その研究におけるアプローチは、ＳＥＲＳ効果を最良の状態で向上させるために、アビジンをコーティングした基材としての銀フィルム及び染料−抗体複合体の使用を含んでいた。その方法は好結果をもたらすサンドイッチ免疫測定法において使用されたけれども、微視的銀基材を使用すること及び共鳴ラマン検知のために生体分子と特定の（発癌性の）発色基との結合が必要であることによって、そのようなアプローチの適用性は著しく制限されている。
米国特許第5,567,628号（Tarcha et al．）は表面増幅ラマンペクトロスコピーを実行するための免疫測定法を開示している。金又は銀のソリッド粒子を含め、種々の基材が記載されている。米国特許第5,869,346号（Xiaoming et al．）はソリッド状態の金、銀又は銅粒子に吸着された抗原−抗体複合体によって表面増感ラマン散乱を測定するための装置及び方法を開示している。
光学的グルコースモニタリングは極めて重要で積極的な研究分野の一例である。この研究のゴールは全世界の数百万の人々を冒している病気である糖尿病をモニタリング、好ましくは、統御する非侵襲法を開発することである。現在、近赤外及び中赤外ペクトロスコピー、光音響ペクトロスコピー、旋光分析、散漫光散乱、及びラマンペクトロスコピーを含め、多種多様なアプローチが遂行されている（Waynant，R．W．，et al．IEEE-LEOS Newsletter 12:3-6(1998)）。使用されている他のアプローチとの比較において、近赤外励起によるラマンペクトロスコピーは、信号が弱い場合でさえも、異なる分析物からのスペクトルを識別する独特の能力を示す。ラマンペクトロスコピーは現時点で考えられる唯一の全光学的手法であり、これにおいては、化学種の全スペクトルシグネチャーを得ることができる。スペクトルシグネチャーは水によって不明瞭にされることはなく、近ＩＲ励起（＞１mm）で達成される意義深い透過深度によって多様なインビボモニタリングアプローチが容易化される。ヒトの血清及び眼水中のグルコースのラマン分光測定（従来のラマンゲインペクトロスコピー及び誘導ラマンゲインペクトロスコピーの両方を用いた）も報告されている（Wicksted，J．P．，et al．App．Spectroscopy 49:987-993(1995);and U．S．Pat．No．5,243,983 issued to Tarr et al．）。近赤外励起は可視ラマン励起に関する感度の劇的な低下をもたらすため、ラマンベースのグルコースモニタリングに対する最も顕著な電流制限が感度を不足させる。このため、長時間にわたるデータ収集及び信号抽出のための多変量解析法が必要である。
生体的用途における金コロイドの使用はFaulkとTaylorが免疫金染色法(immunogold staining procedure)を発明した１９７１年に開始された。その時以来、標的分子、特に、プロテインの金微細粒子によるラベリングが電子顕微鏡による細胞又は組織コンポーネントの可視化に変革をもたらした（M．A．Hayat，ed．Colloidal Gold:Principles，Methods and Applications Academic Press，San Diego，CA 1989）。金コロイドの光学及び電子ビームのコントラスト特性は免疫ブロット法、流動細胞光度測定法及びハイブリダイゼーションアッセイなどの技法に対して優れた検出制度をもたらした。プロテインＡ、アビジン、ストレプトアビジン、グルコースオキシダーゼ、わさび大根ペルオキシダーゼ及びＩｇＧなど、金コロイドによる生体分子の幅広いラベリングのために、結合プロトコルが存在する（M．A．Kerr et al．，eds．Immunochemistry Labfax BIOS Scientific Publishers，Ltd．，Oxford，U．K．1994）。
金属の微細シェルは極薄の金属層がコーティングされた非伝導性の半導体又は誘電体のコアから構成された新タイプの「微細粒子」である。同時係続の米国特許出願第09/038,377号に詳細に記載されているように、金属の微細シェルは真に独特な物理的特性を示す。たとえば、金属微細シェルは金属コロイドに類似した魅力的な光学特性、すなわち、それらのプラズモン共鳴に伴う高い光学的吸収及び極めて大きくて速い三次の非線形光学的(NLO)分極率を有することが発見された。共鳴においては、従来の金コロイドの希釈溶液は周知の物質に対するいくつかの最も強い電子的ＮＬＯ感受性を有する（Hache，F．et al．App．Phys．47:347-357(1988)）。しかしながら、単純な金属コロイドと異なり、金属微細シェルのプラズモン共鳴周波数は微細粒子コアの相対サイズ及び金属シェルの厚さに異存する（Neeves，A．E．et al．J．Opt．Soc．Am．B6:787 (1989);and Kreibig，U．et al．Optical Properties of Metal Clusters，Springer，New York (1995)）。それぞれの粒子の成分層の相対的な厚さ又は深さはその吸収波長を決定する。したがって、相対的なコア及びシェルの厚さを調節するとともに材料を選択することによって、金属微細シェルは電磁スペクトルの紫外、可視及び赤外領域のほとんどの波長において光を吸収又は散乱させるように構成することができる。粒子が入射放射に対して吸収材として作用するか散乱材として作用するかは入射光の波長に対する粒子径の比によって決まる。生物医学分野において極めて望ましいものは化学的又は生体的分析物の感知をインビボで実施するための感度良好な装置及び方法である。また、自己抗体、抗ウィルス性又は抗菌性の抗体、血清蛋白抗原、サイトカイン、ホルモン、薬剤などの分析物に対するインビトロアッセイを実施するための簡便で、より迅速で、感度良好な方法及び試薬も望まれている。
発明の概要
表面増幅ラマンペクトロスコピーを用いた化学的又は生化学的分析物のインビトロ及びインビボでの検知の方法が提示されている。特別な金属コーティングされた粒子（「金属微細シェル」）がこの発明の方法及びコンポジションにおいて使用される。粒子は生体分子が結合されている場合もされていない場合もあり、数ナノメートルから最大でも約５マイクロメートルの範囲の直径を有し、電磁スペクトルの紫外から赤外における所定の最大吸光度又は散乱波長を有している。
この発明は、その一面において、生体感知用途に有用なコンポジションを与える。一実施の形態においては、コンポジションは複数の粒子及びサポートを有する。別の幾つかの形態においては、サポートはヒドロゲルマトリックスのような媒体を有する。別の形態においては、サポートは粒子が配列されている基材を有している。それぞれの粒子は独立に限定された半径を有する非伝導性コア及びそのコアに接着されるとともに独立に限定された厚さを有する金属シェルを有する。「独立に限定された半径」及び「独立に限定された厚さ」という用語はシェル及びコアのそれぞれの所望の厚さが相互に相手の厚さに左右されることなく選択及び形成できることを意味している。それぞれの粒子は限定されたコア半径：シェル厚さ比、電磁スペクトルの紫外から赤外領域における限定された最大吸光度又は散乱波長（同一媒体内で測定された場合）を有する。粒子は、また、表面増幅ラマン散乱を誘起することのできる面を有するとともに、粒子の面に結合された一つ又は複数の生体分子を選択的に有する。ある形態においては、レポーター分子はシェルに結合されるか、又は生体分子に結合されている。レポーター分子分子は酵素、染料分子、ラマン感受性化学物質などである。ある実施の形態においては、結合された生体分子又はそのシェル面は分析物に対する親和性を有し、それにより、少なくとも一部の分析物分子を粒子の面に対して吸着又は密接に関連させる（たとえば、粒子の面の約５０−１００nm内、好ましくは、その面の約１０−２０nmに局在化する）。ある実施の形態においては、サポート又はサポートの一部は分析物に対する充分な親和性を有し、それを粒子の面付近へ同様に局在化させる。コンポジションのある好ましい実施の形態においては、粒子及び媒体は関係する分析物に対して透過性のあるヒドロゲルなどのマトリックスの形態である。この発明は、別の一面において、特に生体感知用途において使用するための光学的に同調された微細シェルを製造する方法を与える。「光学的に同調された微細シェル」という用語は、粒子が予め設定又は限定されたシェル厚さ、限定されたコア厚さ及びコア半径：シェル厚さ比を有するように形成されていること、及び粒子が有意的に又は好ましくはほぼ最大に光を吸収又は散乱させる波長が予め設定された所望の値であること意味している。たとえば、有意な吸光度に対する選択された波長は最大吸光度（ピーク）に対応し、又は、それは吸光度ピークの「ショルダ」に含まれる強い吸収波長に対応し、又は、選択された波長は粒子の吸光度スペクトル曲線の強い吸収のプラトー領域に含まれる。理解されるべき点は、このような関係が当てはまる場合には、「最大吸光度」という用語もこの意味を含むことである。粒子の有為の吸光度波長はあるレーザーピーク波長にほぼ合致するように選択される。この方法の好ましい実施の形態は光の所望の波長（λmax）を選択することを含む。この波長は選択された波長の光が粒子によって有意に吸収又は散乱される波長である。半径Ｒcの非伝導性コアが形成され、その後、金属シェルがそのコア上へ成長又は付着され、最終的にシェルは厚さＴsを有する。この方法は、また、粒子によって最大に吸収又は散乱された光の波長が電磁スペクトルのＵＶから赤外の領域においてほぼλmaxであるようにＲc：Ｔs比を制御することを含む。ある実施の形態においては、一つ又は複数の分析物の特定の分子がシェルに結合される。これらの分子は抗体、抗原又は酵素などの生体分子である。ある実施の形態においては、レポーター分子が、その代わり又はそれに加えて、シェル又は分析物の特定の分子に結合される。選択されたλmaxは微細シェルが特定の生体感知用途に使用されるときに採用される入射光の所望の波長に対応することが好ましい。
この発明は、さらに別の一面において、サンプル（たとえば、血液、血清、又はその他の体液）中の生体分析物のインビトロでの測定方法を与える。たとえば、生体分析物はプロテイン（たとえば、抗体、抗原又は酵素）、ペプチド、オリゴヌクレオチド、及び多糖類、又はそれらの複合体などの化学物質又は生体分子である。
ある実施の形態によれば、インビトロでの測定方法は所望の電磁放射源の波長にほぼ合致する最大吸収又は散乱波長を有する光学的に同調された一つ又は複数の微細シェルを選択することを含む。ある実施の形態においては、選択された微細シェルは一つ又は複数の結合された生体分子を含む。この方法は、微細シェルを前記サンプル中に含まれる所望の分析物の一つ又は複数の分子と関連させて、分析物／微細シェル複合体が形成されるようにすることも含む。ある実施の形態においては、この方法は、微細シェルをレポーター分子と関連させて、レポーター／分析物／微細シェル複合体が形成されるようにすることを含む。いずれの複合体も選択された照射源による照射によってラマン信号を生成することができる。照射源は、好ましくは、電磁スペクトルの近ＩＲ領域内である。この方法は、予め設定された波長における入射電磁照射によって複合体を照射して、表面増幅ラマン散乱が誘起されるようにすることをさらに有する。複合体からのラマン散乱信号が検出され、その信号が生体サンプル中の分析物の存在及び／又は量と相関させられる。好ましい実施の形態においては、ＳＥＲＳ信号も近赤外領域において検出される。この発明の微細シェル生体感知技術の主な利点は、多くのタイプのバイオアッセイにおいては必要なインジケーター酵素が不要であり、事前の精製ステップをほとんど又は全く行わずに生体サンプルを分析できることである。微細シェルの面に直交する分子からの強いＳＥＲＳ信号が得られるので、血清又は全血などの未精製又はバルクサンプル中の「汚染」分子は関係する分子のスペクトル応答測定を妨害することはない。
この発明のさらに別の面においては、微細シェルベースの免疫吸着剤アッセイを実施するためのキットが与えられる。これらのアッセイはサンドイッチタイプ、直接又は間接タイプが可能であり、それぞれ従来の免疫吸着剤アッセイに類似している。一実施の形態においては、キットは、所定量の第１の抗体−微細シェル複合体を有し、さらに、第１の抗体への結合に対する親和性を有する所定量の対照抗原を選択的に有する。このキットは、抗原−第１の抗体−微細シェル複合体への結合に対する親和性を有する所定量の第２の抗体も選択的に有する。ある実施の形態においては、レポーター分子が第２の抗体に結合されている。このキットにおける微細シェルは、独立に限定された半径を有する非伝導性のコアと、コアに接着するととともに独立に限定された厚さを有する金属のシェルと、限定されたコア半径：シェル厚さ比と、紫外から赤外領域おける限定された最大吸光度波長と、表面増幅ラマン散乱を誘起することができる面とを有している。
この発明は、さらに別の局面において、インビボにおいて生体分析物をモニタリングするための方法を与える。この方法の好ましい実施の形態は、体内の所望の生体感知部位において対象内へ光学的に同調された所定量の金属微細シェル粒子を対象の体内へ導入することを有する。別の実施の形態においては、この部位は、内部から関係する分析物へ近づきやすいとともに外部から電磁照射がしやすい。別の実施の形態においては、この部位は、たとえば、全体的に植設可能なシステムにおけるように、分析物へ近づきやすいとともに内部に配置された光源によって照射される。粒子はその粒子によって最大吸収又は散乱された光の波長が予め設定された紫外から赤外領域の電磁照射の発生源から照射された光の波長にほぼ合致するように光学的に同調されている。たとえば、一群の粒子の平均ピーク波長はＮｄ：ＹＡＧレーザーの１０６４nm波長に対して約１０−１５nm以内である。この方法の好ましい実施の形態は前記最大吸収又は散乱波長に合致する波長において電磁照射放射光の発生源を選択することを含む。ある実施の形態においては、粒子は分析物に対する親和性を有し、また、ある実施の形態においては、レポーター分子を含み、このレポーター分子は、ある実施の形態においては、ラマン活性官能基を含んでいる。この方法は、粒子及び粒子に関連する分析物分子に対して外部から照射を加えて、ＳＥＲＳ信号が生成されるようにすることをふくむ。この方法は、信号を評価すること、及び信号評価と生体感知部位における分析物の存在及び／又は量とを相関させることを含む。
インビボにおいて生体分析物をモニタリングするための方法のある実施の形態は、粒子によって最大吸収又は散乱された光の波長が予め設定された紫外−赤外電磁照射の発生源から照射された光の波長にほぼ合致するように所定量の光学的に同調された粒子を形成することを含む。
この発明のさらに別の局面によれば、生体感知用途のための粒子が与えられる。この粒子は、金属微細粒子とも呼ばれるもので、独立に限定された半径を有する非伝導性又は誘電性のコアと、コアに密接に接着するととともに独立に限定された厚さを有する金属のシェルと、限定されたコア半径：シェル厚さ比とを有する。この粒子は、３００nmから２０μmの領域の電磁スペクトルおける限定すなわち予め設定された最大吸光度又は散乱波長も有する。ある実施の形態においては、限定された最大吸光度又は散乱波長は近赤外領域にある。ある実施の形態においては、粒子の最大吸光度波長は約８００−１，３００nm又は１，６００−１，８５０nmに設定されている。ある好ましい実施の形態においては、粒子は与えられた電磁放射源のピーク波長にほぼ合致している最大波長を有し、また、表面増幅ラマン散乱を誘起することができる面をさらに有している。
この発明の粒子の別の実施の形態においては、粒子は金属シェル面に結合された一つ又は複数の分析物結合分子を有している。ある実施の形態においては、分析物結合分子はプロテイン、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド及び多糖類などの生体分子である。ある実施の形態においては、分析物結合分子はシェルに結合された生体分子種の混合物である。ある実施の形態においては、生体分子はグルコースオキシダーゼであり、分析物はグルコースであり、また、ある別の実施の形態においては、生体分子は抗体であり、分析物は抗体に対する標的抗原である。ある好ましい実施の形態においては、シェルは金又は銀から成り、コアは二酸化珪素、金の硫化物、二酸化チタン、ポリメチルメタクリレート(PMMA)、ポリスチレン及びデンドリマーなどの巨大分子から成る。この発明の好ましい実施の形態の粒子のうち生体感知に特に適した粒子は、金のシェル及び二酸化珪素のコアを有する。別の好ましい微細シェルは銀のシェル及び二酸化珪素のコアを有する。これらの粒子の幾つかの直径は最大で約５μmであり、約１nmから約５μm未満のコア直径、約１−１００nmのシェル厚さを有している。ある一層好ましい実施の形態においては、コアは直径約１nmから２μmの間であり、シェルは厚さ約４０nm未満である。この実施の形態においては、シェルはリンカー分子によってコアにリンクされ、粒子は３００nmと２０μmとの間に最大吸光度又は散乱波長を有している。ある実施の形態においては、粒子は約２１０nmの直径を有し、約１００nmのコア半径、約１０nmのシェル厚さ、約１０：１のコア半径：シェル厚さ比、及びＦＴ−ラマンレーザースペクトロメータで使用されているような１０６４nm（ピーク）Ｎｄ：ＹＡＧ源にほぼ合致する約１０６４（ＳＤ±１０nm）の最大吸光度波長（λmax）を有している。この発明の好ましい実施の形態の粒子は、金のシェル又は銀のシェルを有している。好ましい実施の形態の粒子は、二酸化珪素、金の硫化物、二酸化チタン、ポリメチルメタクリレート(PMMA)、ポリスチレン及びデンドリマーなどの巨大分子から成るコアを有する。この発明の別の局面においては、上記の粒子を有する化学感知デバイスが与えられる。化学感知装置は、たとえば、適宜に設計された微細シェル及びＳＥＲＳペクトロスコピーを使用した全光学センサーであり、特に、薬剤や抗ウィルス性又は抗菌性の抗体又はサイトカインなどのプラズマプロテインを検知及び量化するためのものである。
この発明のさらに別の実施の形態、特徴及び利点は図面及び以下の説明から明らかになるであろう。
珪素のコア及び金のシェル（水に懸濁された）を有する金属微細シェルの計算された光学共鳴を所定範囲のコア直径：シェル厚さ比にわたって示すグラフである。 珪素のコア及び金のシェル（水中）を有する金属微細シェルについての計算された光学共鳴波長とシェル厚さに対するコア直径の比との関係を示すグラフである。 成長過程における珪素のコア／金のシェルの微細シェルの透過型電子顕微鏡写真を示す図である。 直径１２０nmの珪素の微細粒子上への金のシェルの成長を示すグラフである（Ａ図）。３４０nmの珪素の粒子上への金のシェルの成長を示す図４Ａに類似したグラフである（Ｂ図）。 珪素／金微細シェルによるメルカプトアニリンのＳＥＲＳ増幅を示すグラフである。上のライン（ａ）は珪素／金微細シェルによって結合された１０−５％のメルカプトアニリンのスペクトルである。下のライン（ｂ）は直径１２０nmの微細シェルのみのラマンスペクトルのバックグラウンドである。 ｐＨ４．５から７におけるＧＯ複合化金微細シェルの７時間にわたるグルコースオキシダーゼ活性を示すグラフである。 グルコース感知金微細シェルの概念図である。図７Ａはグルコース透過性膜すなわちマトリックスに埋設された金微細シェル（非機能化）から成るグルコースセンサーを示す。図７Ｂはグルコース透過性膜に埋設されたグルコースオキシダーゼ−微細シェル複合体から成るグルコースセンサーを示す。 初期抗体を巨視的サポートへ取り付ける代わりに微細シェルへ直接リンクすることによって修正されたＥＬＩＳＡ試験を概念的に示す図である。図８Ａはアッセイ前における抗体−微細シェル複合体を示す。図８Ｂは抗体分析物へのプレゼンテーション後における抗体−微細シェル複合体を示す。図８ＣはＥＬＩＳＡの最終サンドイッチ免疫測定ステップの微細シェルアナログを示す。この場合において、選択的に、酵素リンク抗体は抗原−抗体複合体へ結合されている。 ジメチルアミノアゾベンゼンでラベリングされたＩｇ−Ｇ(DAB-IgG)で結合された微細シェルの生体サンプル中における表面増幅ラマン散乱を示すグラフである。図９Ａは燐酸緩衝生理食塩水(PBS)に懸濁されたＤＡＢ−ＩｇＧ結合微細シェルサンプルに対するラマン強度対ラマンシフト（cm-1）を示す。図９Ｂは胎仔ウシ血清(FBS)に懸濁された同様なサンプルについての同様なグラフを示し、図９Ｃは全血に懸濁されたサンプルについての同様なグラフを示す。
好ましい実施の形態の詳細な説明
金属微細シェル
同時係続の米国特許出願第09/038,377号に記載されているように構成された金属微細シェルは、ここに開示された好ましい生体感知用途の基礎である機能的構造を与える。生体感知用に用いられる微細シェルは、好ましくは、最大でも直径数ミクロンまでの範囲の粒子であり、誘電体コア、金属コーティング又はシェル、及び決まったコア半径：シェル厚さの比を有している。生体感知微細シェルのコア直径は約１nmから４μm又はそれ以上の範囲であり、シェルの厚さは約１から１００nmの範囲である。所定のコア及びシェルの材料については、粒子の最大吸光度又は散乱波長はシェルの厚さに対するコアの厚さ（すなわち、半径）の比に依存する。新しい合成法によって達成されるシェルの厚さに対するコア半径（コア：シェル）の比に基づいて、紫外領域から赤外の約５μmへと延びるプラズモン共鳴を示す微細シェルが容易に形成される。電磁スペクトルの可視及び近赤外領域は生体分析又は感知用途に対して特に有用である。
図１は粒子の計算された金微細シェルプラズモン共鳴をコア半径：シェル厚さの比の増大に対して示している。微細シェルプラズモン共鳴の波長シフトに対するミー散乱の計算はシリカのコア上に付着された金の層を有する微細シェルのための微細シェルコンポジションの関数として示されている。この図においては、微細粒子のコア及びシェルはそれらの対応する光学共鳴の真下の相対スケールに示されている。図２においては、金のシェル／シリカのコアの微細粒子についての共鳴波長に対するシェル厚さ対コア半径（コア：シェル）比のプロットが示されている。金属の付着反応の条件を変更することによって、コア半径に対する金属シェルの厚さ比を予想可能かつ制御可能に変更することができる。したがって、粒子は極めて広い範囲のシェル厚さ対コア半径比で形成可能である。幾つかのより好ましいコア：シェル比は約２−１０００である。この広い範囲に及ぶ比の範囲は、コアサイズの制御と組み合わされることによって、スペクトルのＵＶ、可視及び赤外領域にわたって大きい周波数可変吸光度を有する粒子をもたらす。
比較すると、分子種の吸収による金コロイドのプラズモン共鳴で誘起されたシフトは極めて小さく、一般的には、１０nm又はそれ未満である（Kreibig，U．et al．Optical Properties of Metal Clusters，Springer，New York (1995)）。金属微細シェル又は微細シェルを成分とする材料の非線形光学的(NLO)特性は有用な光学波長又はその近傍におけるプラズモン共鳴の適正な配置によって共振的に向上可能である。このため、金属微細シェルは技術的に重要な波長領域である近赤外領域における光学デバイスへの適用の可能性を明瞭に実証している。プラズモン共鳴の迅速な「チューナビリティ」は金属微細シェルに完全に固有の特性である。他の分子又は微細粒子構造においては、光学的吸収の共鳴及びＮＬＯ特性がそのような極めて広い範囲の波長にわたって系統的に設計可能なものはない。
Averitt，R．D．et al．は金で停止された(gold-terminated)ある種の金硫化物微細粒子の光学特性を詳細に調査した（Phys．Rev．Lett．78:4217-4220 (1997)）。図１のミー散乱理論とAu/Au2S微細粒子の光学吸収との間の定量的な一致が達成された。09/038,377に記載されているように、誘電体コア上へナノメートル単位の厚さの均一な金属層を成長させるためのより一般化された方法が開発された。また、Oldenburg，S．J．et al．Chem．Phys．Lett 288:243-247 (1998)を参照されたい。簡単に説明すると、好ましいプロセスは溶液中に分散された誘電体又は半導体の微細粒子を成長させることすなわち得ることを含む。極めて小さい（すなわち、１−２nm）の金属の「シード」コロイドが分子リンケージによって微細粒子の表面に取り付けられる。これらのシードコロイドは不連続な金属コロイド層で誘電体の微細粒子の面を被覆する。その後、別の金属が溶液中における化学還元によって「シード」金属コロイド吸着質上に成長する。
このアプローチは成功であり、金及び銀の両方の金属シェルをシリカの微細粒子上に成長させるのに使用することができた。機能化されたシリカの微細粒子上への金の金属シェルの成長における種々の段階が図３に示されている。「機能化された」という用語はリンカー分子及びそのリンカーに取り付けられた金コロイドに関連している。図３は、シェル成長過程におけるシリカのコア／金のシェルの微細シェルの透過型電子顕微鏡の画像である。２０nmの相対長さが画像の下に示されている。
図４Ａ−Ｂは二つの異なる微細シェルのコア直径についての微細シェルの合着及び成長の光学シグネチャーを示すグラフである。図４Ａは直径１２０nmのシリカの微細粒子上への金のシェルの成長を示している。下のスペクトル曲線は金の層の合着が進行するときの光学吸収の進展に従う。シェルが完成されると、吸収のピークは短波長側へシフトされる。対応する理論ピークは点線でプロットされている。図４Ｂは３４０nmのシリカの粒子上への金のシェルの成長を示している。ここでは、ピークのシフトが一層明瞭であり、このテストで使用された機器の範囲内で見えるのは中央の曲線のるショルダのみである。この方法による金属微細シェルの成長は僅か数秒を要するだけであり、その収率は９８％を上回ることが可能である。微細シェルはフィルム又はマトリックス材中に容易に埋設することが可能であり、広範な有機性及び水性溶媒中において安定である。
好ましい実施の形態においては、微細シェル粒子は球状であるけれども、そのコアは立方体、円筒体又は半球体などの別の形状であってもよい。コアの形状にかかわらず、好ましい実施の形態においては、粒子はサイズ及び形状において均一であることが好ましい。好ましくは、複数の金属微細シェルを有するコンポジションは最大数ミクロンまでの範囲のほぼ均一な直径の粒子を含む。この直径は粒子に求められる最大吸光度に応じて決められる。たとえば、単分散系コロイドシリカのコア粒子は、当業者周知の方法によって、テトラアルコキシシランの塩基触媒反応によって生成させることができる。また、適当なシリカ粒子は周知の民間供給源から容易に入手することもできる。好ましいものは、１０nmから４μmを越える範囲のサイズを有し、粒子径のばらつきが僅か数％であるようなほぼ球状のシリカのコアである。
適当な誘電体コアの材料は、限定的ではないが、二酸化珪素、金の硫化物、二酸化チタン、ポリメチルメタクリレート(PMMA)、ポリスチレン、及びデンドリマーなどの巨大分子を含む。非伝導性層の材料は粒子の特性に影響を及ぼす。たとえば、シェル層の誘電定数が所定の誘電定数を有するコアを有する粒子よりも大きいと、粒子の最大吸光度は低い誘電定数を有するコアを有する粒子に対して青方偏移するであろう。コアは上記列挙したような誘電体材料の組み合わせ又は層状組み合わせでもよい。
シェルすなわち外側層を形成するための適当な金属は貴金属及び貨幣金属を含むけれども、他の電気伝導性金属も使用可能であり、所望の用途に応じて選択される。シェル用として特に適した金属は、限定的ではないが、金、銀、銅、白金、パラジウム、鉛、鉄等を含む。このような金属の合金又は不均一混合物も使用できる。シェル層は約１から１００nmの厚さが好ましく、コアの外面を均一にコーティングし、あるいは、それはコアを原子団又は分子団で部分的にコーティングすることもある。
例１．金属微細シェルを用いた表面増幅ラマン散乱(SERS)
金属微細シェルは粒子コア：シェル比を調節することによって粒子に設計されたプラズモン共鳴を有しているので、それらのプラズモン共鳴はシェルの成長過程でシフトされ、近赤外レーザー源の励起波長と一致する。それは、たとえば、１０６４nmＮｄ：ＦＴ−ラマンレーザースペクトロメータで使用されるＹＡＧ源である。
最近の一連の実験においては、金属微細シェルのＳＥＲＳ増幅特性が研究された（Oldenburg，S．J．et al．J．Chem．Phys．111:4729-4735 (1999)；その全体がここにおいて文献援用される）。微細シェルプラズモン共鳴は、プラズモンピークのショルダがラマン励起波長と重なるように、名目上９００nmに配置された。図５は、この研究においてメルカプトアニリン分子について観測されたＳＥＲＳ増幅を示している。ラマン信号における６００，０００の増幅が観測された。この場合において、メルカプトアニリンと金微細シェルの面との間の強い相互作用によって、これらの分子が微細粒子の面へ結合（おそらく、共有結合）する。観測された増幅は微細粒子の面に対する単層被覆に対応するメルカプトアニリン濃度において飽和し、ラマン増幅が確かに局所的な微細粒子の面効果であることが確認された。この研究においては、粒子の凝集は検出されなかったため、微細粒子凝集から微細シェルＳＥＲＳ増幅への寄与はなかった。観測されたＳＥＲＳ増幅は、総体的に、溶液中に分散された非凝集微細シェルからの寄与によるものであった。可能であるならば、この効果をバイオセンサーの設計に利用することは有用である。ここに記載された金属微細シェル及び結合された微細シェルは、その研究において使用されたAu/Au2S粒子よりも独特で広い配列のＳＥＲＳ増幅粒子を提供する。
例２．金微細粒子／微細シェルの生体結合
金微細シェルの外側金属層の還元は金コロイド合成と同一の化学反応を用いて行われるので、金微細シェルの面は、事実上、従来の生体結合用途において広く使用されている金微細粒子の面と化学的に同一であると考えられる。金コロイド（たとえば、プロテインＡ、アビジン、ストレプトアビジン、グルコースオキシダーゼ、わさび大根ペルオキシダーゼ及びＩｇＧ）による広範な生体分子のラベリングのための既存の結合プロトコル（M．A．Kerr et al．，eds．Immunochemistry Labfax BIOS Scientific Publishers，Ltd．，Oxford，U．K．1994）は、直接繰り返し可能か、又は、金微細シェルとの使用に容易に適合可能である。類似の結合方法も他のコア材料を有する微細シェルの結合に容易に適用可能であることが予想される。一セットの実験において、直径１５０nmの金の微細シェルへのグルコースオキシダーゼ(GO)の取り付けは公開された金コロイド結合のためのプロトコルに従って行われた（Chen，X．-Y．et al．Biochem．Biophys．Res．Comm．245:352-355 (1998)）。その後、ＧＯ−微細シェル複合体の活性が従来の方法を用いてモニターされた。吸着による取り付けは所定の範囲のｐＨ値にわたって有効であることを証明した。シトラートによって安定化された金コロイドを用いた平行する研究では、数時間のタイムスパンにわたってｐＨ依存の凝集が発生したが、それとは異なり、ＧＯ−微細シェル複合体の凝集は数日のタイムスパンにわたって観測されなかった。遠心分離を繰り返した後、ＧＯ−微細シェル複合体の活性が、標準的な光学検知（Indigo Carmine-H2O2 redox pair）を使用して、グルコース溶液の存在下でモニターされた。ＧＯ複合化微細シェルの相対的なｐＨ依存活性が図６に示されている。別の生体分子も同様な方法で金属微細シェルに結合可能である。
例３．金微細シェルをベースとしたバイオセンサー
好ましい生体感知戦略は金属微細シェルによって得られた顕著なＳＥＲＳ増幅と金微細シェルの面の容易な生体結合能力とを組み合わせている。この組み合わせによって、生理学上重要性のある特定の生化学プロセスをモニターするのに適した高感度、高情報密度のスペクトルプローブが得られる。可視光は、ヘモグロビンによって吸収されるために、インビボでの光学モニターには適さない。紫外光もプロテイン及びＤＮＡに対する光化学変換(photochemical transformation)の可能性があるために適さない。近赤外におけるラマン散乱は、金微細シェルのプラズモン共鳴によって増幅されており、これらの欠点はなく、８００−１，３００nm及び１，６００−１，８５０nmの「ウォーターウィンドウ(water windows)」などのような高い生化学的透過率の領域において同一の実証されたＳＥＲＳ感度を容易にすることが発明者によって予想されている（Anderson，R．R．et al．J．Invest．Dermatol．77:13-19 (1981);and Duck．R．A．，Physical Properties of Tissue: A Comprehensive Reference Book，Academic Press，San Diego，CA (1990)）。微細シェルのコア：シェル比は所望の吸収又は最大散乱が特定の分析物のＳＥＲＳ分光測定において使用されるべき所望の波長領域に対応するように選択される。この設計上の特徴によって、金の微細シェルはインビボ及びインビトロでの全ての光学感知用途のための微視的生体感知基材として特に適したものになっている。ＳＥＲＳ信号を増幅するために金属微細シェルの共鳴基材を用いることによって、巨視的金属基材の必要性がなくなるとともに、多くのＳＥＲＳ活性分析物のための生体分子の共鳴結合(resonance-conjugation)の必要性もなくなっている。しかしながら、生体分子及び／又はレポーター分子は、必要に応じて、ＳＥＲＳ検知及び量化を向上させるために微細シェルに結合させることができる。
微細シェルの微細シェル粒子径、シェルの厚さ、コアの厚さ、及びコア：シェル比は同様に選択して、形成された微細シェルにおいて所望の最大吸収が得られるようにすること、及びその最大吸収が電磁スペクトルの紫外、可視又は近赤外の帯域において特定の分析物を測定するための所定の波長に対応するようにすることが可能なことは容易に認識できよう。
例４．インビボにおける全ての光学的グルコース検知
光学的グルコース検知は血液グルコースレベルのモニターに対する非侵襲法を提供することを目的としている。そのような方法は全世界の数百万の人々を冒している病気である糖尿病を統御するのに有用である。インビボでのグルコース測定のために今日使用されている別のアプローチと比較すると、近赤外励起によるラマンペクトロスコピーは、信号が弱い場合でさえも、異なる分析物からのスペクトルを識別する独特の能力を示す。金属微細シェルベースのグルコース感知は感知感度を著しく改善することによって既存のラマンベースのグルコースモニタリングシステムの大きな制限を克服している。長いデータ収集時間及び信号抽出のための多変量解析法の必要性が微細シェルバイオセンサーを採用することによってなくされる。微細シェルベースのラマングルコースモニタリングは金属微細シェルの使用を頼りにしており、近赤外励起の下での強くＳＥＲＳ増幅されたグルコース信号を得ている。必要に応じて、グルコース結合生体分子及び／又はＳＥＲＳ活性レポーター分子を微細シェルに結合させて、ＳＥＲＳ検知及び量化を向上させることが可能である。シェル及びコアの厚さは、微細シェルのプラズモン共鳴がＳＥＲＳ感知のために使用される励起レーザの波長に合致するように形成されることが好ましい。このようにして、非弾性散乱光のスペクトルが得られる。
この例では、グルコースが記載されているけれども、他の生体分析物、特に、強いラマン信号を発生するものも同様に分析可能であることは理解されなくてはならない。図７Ａに示されているグルコースセンサーはゲル内に分散された微細シェルを含み、センサーに隣接するグルコース分子のグルコースラマン信号がそれから直接モニター可能である。そのようなグルコースセンサーはヒドロゲルなどのグルコース透過性膜すなわちマトリックスに埋設された金微細シェル（非結合）を有する。微細シェルは、好ましくは、プラズモン共鳴がラマン励起レーザー波長に対応するように形成されている。生体結合微細シェルに対する免疫応答を低減するとともに微細シェルの食作用又はマイグレーションを防止するために、微細シェルのヒドロゲルマトリックスへの埋設はしばしば必要である。好ましいヒドロゲルはポリエチレングリコールジアクリレート(PEGDA)で形成されているが、別の適当なヒドロゲル材料を使用することもできる。特定のヒドロゲルの適合性はヒドロゲルに埋設された微細シェルのサンプルに対するラマン試験を実施して、関係する化学種に対する感度を測定することによって評価できる。このようにして、所望の用途のためのヒドロゲルマトリックスの最適候補を選択することができる。
ＰＥＧＤＡはインビボ用途に対して優れた特性を有するとともにグルコースに対して高い透過性を有することが示されている材料の一つである（Hill，R．S．et al．Ann．N．Y．Acad．Sci 831:332-343 (1997);and Quinn，C．P．et al．Biomaterials 16:389-396 (1995)）。ＰＥＧＤＡヒドロゲルは多くの生体材料用途に利用されてきた。それには、グルコース応答膵島細胞の免疫隔離が含まれ、また、レドックスベースのグルコースセンサー用のグルコース透過性コーティングとしての利用も含まれる。ＰＥＧＤＡヒドロゲルは界面重合と呼ばれるプロセスによって薄膜（２−１００μm）に形成できる（Hill-West，J．L．et al．Natl．Acad．Sci．USA 91:5967-5971 (1994)）。これは、全注入システムによって、極めて薄い微細シェル含有ヒドロゲルをその場で皮下に形成することを許容している。生体感知材料の注入による植設の後は、グルコースモニタリングは全体的に 非侵襲性であり、皮膚を通じて光学的に評価される。多くの生体感知用途に対して好ましいけれども、バイオセンサー粒子のマイグレーションその他の問題を回避するために、微細シェルをヒドロゲルに埋設することは全ての用途において必要ではない。たとえば、微細シェルは薄膜又はその他のタイプの植設可能な基材上に着設又は配列することも可能である。
生体感知において微細シェルを使用するための別のアプローチが図７Ｂに概念的に示されている。この図は、機能化された微細シェル、たとえば、グルコースオキシダーゼ−微細シェル複合体から成るグルコースセンサーを示している。この結合微細シェルは、好ましくは、上記のようなグルコース透過性膜に埋設されている。この場合においては、金属微細シェルは酵素グルコースオキシダーゼと結合され、その後、ヒドロゲル、又はヒドロゲル前駆体に分散され、対象へ植設される。隣接するグルコース分子のスペクトル信号に加えて、各種の他のスペクトル特性が光学モニタリングに利用できる。たとえば、グルコース結合によるグルコースオキシダーゼの配座変化、又はグルコース酸化の生成物、グルコン酸及びＨ2Ｏ2がモニター可能である。微細シェルの生体結合は幾つかの別の感知オプションを与えるので、データ取得後の信号解析を単純化又は迅速化する上で、モニタリングシステムに冗長性を構築する機会が存在する。
一つのタイプのグルコース感知システムは、グルコースからのラマン信号をインビトロで第１に評価して、「理想」状態下で共鳴微細シェルで得られたＳＥＲＳ増幅を決定することを含んでいる。その後、吸収された総プロテイン及び絶対活性を評価するために、生体結合微細シェルのビシンコニニックアシッド（BCA）アッセイによる結合アッセイ(binding assay)が実施される。次に、反応物、被吸収剤及び生成種への感度を評価するために、生体結合微細シェルによるインビトロでのグルコースモニタリングのラマン試験が実施される。次のステップは、球体をヒドロゲル埋設するための周知の方法又は化学的プロトコルを適用して、微細シェルをポリエチレングリコールジアクリレート(PEGDA)、ポリビニルアルコール又はアルギネートなどのグルコース透過性のヒドロゲル中に埋設することである。生体感知システムのインビボでの実験は、皮下に植設された微細シェルベースのセンサーを有する糖尿病又は非糖尿病のラットのラマン試験、及び光学的に測定されたグルコースレベルと従来の方法で測定された血液グルコースレベルとの相互関係を含む。たとえば、ＳＤＤ（遺伝的糖尿病）ラットのグループは、グルコース感知が必要な場合は、体の一部位において、非干渉性の薬理学上許容できるキャリヤ内の適正に設計された微細シェルの適量を皮下に注入可能である。また、注入体(injectate)はヒドロゲル形成材料を有する。このヒドロゲル形成材料は、たとえば、生体結合微細シェルを含有する無菌生理食塩水中に１μmのエオシン Ｙを含む溶液にＰＥＧＤＡを２０％ w/vの割合で溶解させた溶液の０．１mlである。結合生体分子はラマン活性スペクトル特性が得られるようにグルコースに対して相互作用するものである。適当なラマン活性レポーター分子が必要に応じて使用される。ヒドロゲル前駆体の注入後、キセノンアークランプからの光に照射することによって、急速な光重合（＜５秒）がその場で達成される。このプロセスは、細胞及び組織との直接接触において、さほどの損傷もなく安全に実施可能である。その後（たとえば、試験後三日目に着手）、ヒドロゲル植設部位におけるグルコースレベルの測定がラマンペクトロスコピーによって行われる。同時に、血液グルコースレベルを従来の方法によってモニタリングするために、血液が各動物から採取される。ラマン信号はグルコースレベルに相関させられ、従来の方法を用いて得られた糖尿病及び血糖正常のラットにおける血液グルコースレベルとの比較によって確認可能である。
直接グルコース感知法及びグルコースオキシダーゼ酵素の生体結合を用いてグルコースを感知する方法が上記の例に記載されているけれども、他の化学物質又は分析物も同様にモニターすることが可能であり、他のプロテイン又は生体分子も同様に適当なコア：シェルの設計及び光学特性を用いて他の微細シェルに吸収可能であることは容易に認識できるであろう。この例は近赤外域の放射を用いた好ましいインビボの生体感知法を記載している。近赤外域励起及び検出法よりも好ましさは劣るけれども、その代わりに、可視又はＵＶ域の放射も、可視又はＵＶ域においてＳＥＲＳを示すような適当に設計された微細シェルといっしょに、多くの用途に使用でき、充分な分光測定が可能である。
例５．微細シェルベースの免疫吸着剤アッセイ(NISA)
生体結合微細シェルは各種の免疫測定法のプロセスのストリームライニング(streamlining)に著しく寄与することが予想される。微細シェルベースの免疫吸着剤アッセイは、たとえば、ＥＬＩＳＡタイプのアッセイの代わりに用いることのできる全ての光学バイオアッセイを与える。酵素リンク免疫吸着剤アッセイ(ELISA)の分析技術及び関連技術は今や最も広く知られた免疫測定法である。巨大な数の市販のＥＬＩＳＡベースのアッセイが抗体（自己抗体、抗ウィルス性又は抗菌性の抗体）又は抗原（血清蛋白、サイトカイン、ホルモン、薬剤等）の検出に利用されている（M．A．Kerr，et al．，eds．Immunochemistry Labfax BIOS Scientific Publishers，Ltd．，Oxford，U．K．1994）。それらは相当な精度及び感度で抗体又は抗原の感知を可能にしている。従来のＥＬＩＳＡ法は、一般に、最初に抗体をソリッドサポート上に吸収させる段階を含んでいる。血漿サンプルとともにインキュベーションすることによって、抗体−標的蛋白複合体が形成される。最終サンドイッチ免疫測定複合体は、一般的に、抗原濃度の光学測定を可能にするインジケーター酵素を含む。これらのアッセイは、通常、平底のマイクロタイトレーションウェルストリップ又はプレートで行われ、完了までに数時間を要する。最終的な検出は光学信号（通常は、最終サンドイッチ複合体の色の変化又は蛍光）のモニタリングを含むので、これはサンプル調製に対して一定の拘束を与える。たとえば、色の変化が検知される場合には、溶液は可視領域における透明度が高くなくてはならない。細胞膜はこのアッセイにおける蛋白吸着を妨害するので、サンプルは無細胞でなくてはならず、そのため、血液サンプルは血漿状態まで処理されなくてはならない。従来のＥＬＩＳＡタイプの方法は極めて長い時間を要する傾向があるため、試験結果が得られるまでの長時間の遅れが問題になる場合には、医療環境における利用性は低い。
微細シェルで修正されたＥＬＩＳＡプロセスにおいては、たとえば、初期抗体を巨視的サポートへ取り付ける代わりに、それらは、図８Ａに示されるように、適宜に設計された微細シェルへ直接リンクされる。図８Ａはアッセイ前における抗体−微細シェル複合体の概念図である。上記グルコースセンサーの場合のように、微細シェルはそれらのプラズモン共鳴がラマン近赤外励起波長に対応し、得られるスペクトルがＳＥＲＳ増幅されるように形成される。これにより、全血のサンプルにおける分析及び／又は検出が可能になっている。生体結合微細シェルはそれらの面に取り付けられた特定の活性抗体種の正確に知られた濃度で調製され、ＢＣＡアッセイによる結合アッセイを用いて量化される。その後、これらの生体結合微細シェルは分析物を含有する流体サンプルに添加され、図８Ｂに示されるような抗体−標的蛋白複合体を形成する。分析物が抗体に結合される前後において、近赤外励起によるラマンスペクトルがモニターされる。これらの段階はいずれもＳＥＲＳ増幅ラマン信号生成するとともに定量分析の機会を示すことが予想される。図８Ｃはサンドイッチ免疫測定法の微細シェルアナログ、すなわち、結合抗体が抗体−標的蛋白複合体へ取り付けられたものを示す。微細シェルが用いられる場合には、「サンドイッチ」ステップは肝要ではないが、手法の確認又は較正に特に有用な情報の冗長性を与える。微細シェルによる生体感知は図８Ａ−Ｃに示される形態のいずれによっても達成可能である。
別のタイプの微細シェルベースのインビトロ免疫測定法は生体分子の複合体混合物を微細シェルの面へ結合させることを含む。生体分子混合物は関係する特定の抗原を含む。そして、抗原への結合の親和力を有する適当な抗体がＳＥＲＳによる抗原−抗体複合物の存在に対するプローブとして使用される。抗体は、ジメチルアミノアゾベンゼン(DAB)又はローダミンのような、大きいラマン断面を示すレポーター分子又は染料でラベリングされている。
生体分析物のインビボ感知の場合と同様に、インビトロアッセイ技法のために近赤外ラマンペクトロスコピーを使用することには大きな利点もある。プロテイン吸収をベースとするアッセイにおいては、細胞は所望の結合を妨害し、突飛な応答を生成する。このことは、バイオアッセイに先立つサンプル調製において、余分な時間のかかる分離及び浄化ステップを必要とする。近赤外ラマンベースのバイオアッセイは高い透過率のスペクトル領域においてこれらのサンプルをプローブし、時間のかかるサンプル調製の必要性をほとんどなくしている。
例６．微細シェルＳＥＲＳにおける不干渉プラズマプロテイン
インビトロアッセイのために微細シェルＳＥＲＳを使用することの重要な利点は、生体サンプルにおける外来性プロテインに起因する近赤外ＳＥＲＳによる干渉が適当に設計された微細シェル又は結合微細シェルを使用することによって回避できることである。これは、燐酸緩衝生理食塩水(PBS)、胎仔ウシ血清(FBS)又は全血のいずれかに懸濁されているジメチルアミノアゾベンゼンでラベリングされたＩｇ−Ｇ(DAB-IgG)で結合された微細シェルのサンプルに対して１０６４nmＮｄ：ＹＡＧ（パルス）レーザーシステムを使用した近赤外放射を加えることによって実証されている。それぞれのサンプルの近赤外ＳＥＲＳ信号が測定され、その結果が図９Ａ−Ｃに示されている。図９ＡはＰＢＳに懸濁されたサンプルに対して測定されたラマン強度対ラマンシフト（cm-1）を示している。図９Ｂ及び９Ｃは、それぞれ、ＦＢＳ及び全血に懸濁されたＤＡＢ−ＩｇＧ結合微細シェルの同様なサンプルについて得られた結果を示している。観測されたことは、血清蛋白は近赤外ＳＥＲＳ信号と干渉しないこと（図９Ｂ）、及び全血においては、極めて僅かな信号減衰が認められること（図９Ｃ）である。微細シェルは約２００nmの直径のＳｉＯ2コア、約１０nmの厚さの金のシェル、及び約１１０nm（ＳＤ±約１０％）の直径を有していた。一群のＡｇ／ＳｉＯ2粒子の最大吸収波長は、１０６４nm（ピーク）のレーザー波長（ピークに対して、±１０−１５nm、好ましくは、１０nm未満）にほぼ一致するように光学的に同調された。ＤＡＢ−ＩｇＧの結合は、上記したグルコースオキシダーゼを微細シェルに結合させるための方法と同様な方法を使用して実施された。
ラマンペクトロスコピーをベースとしたインビトロのバイオアッセイによれば、抗体（抗ウィルス性又は抗菌性の抗体など）を含むプラズマプロテイン、サイトカイン又は薬剤の量化が極めて迅速に実施できる。この技術はＥＬＩＳＡ又は放射免疫測定法などの従来のバイオアッセイに比べて著しく簡便であることが予想される。この新種のバイオアッセイにおいては、全血（単一液滴からの塗沫中、又は試験管中）は適当な生体結合微細シェルとともにインキュベートされ、その後、直ちにラマンペクトロスコピーによって解析される。正確なバイオアッセイ結果が、通常は２４−４８時間かかるところ、数分で得られる。上記の例には、抗体を最初に微細シェルへ取り付けることが記載されているけれども、多くの別の免疫測定法においては、抗体の代わりに抗原を最初に微細シェルにリンクさせることもできる。
発明の好ましい実施の形態が示されるとともに説明されたけれども、発明の精神及び開示を逸脱することなく当業者によってその修正をすることは可能である。ここに記載された実施の形態は単なる例示であり、限定的なものではない。ここに開示されたこの発明の多くの変形及び修正が可能であり、それらはこの発明の範囲に含まれる。したがって、発明の範囲は上記の内容によって制限されることはなく、発明に係る全ての均等内容を包含する特許請求の範囲の記載によってのみ制限される。ここにおいて引用されている全ての発明、発明文献及び刊行物の開示内容はここにおいて明記されていない関連物又は関連方法に関する範囲まで文献援用される。

Claims (48)

  1. 複数の粒子及びサポートを有するコンポジションであって、前記粒子のそれぞれが、
    独立に限定された半径を有する非伝導性のコアと、
    前記コアに接着するととともに独立に限定された厚さを有する金属のシェルと、
    限定されたコア半径：シェル厚さ比と、
    前記サポートといっしょに測定された場合における紫外から赤外領域おける限定された最大吸光度又は散乱波長と、
    表面増幅ラマン散乱を誘起することができる面と、
    を有し、前記限定された波長は与えられた電磁放射源の波長にほぼ合致し、さらに、
    前記面に結合された少なくとも一つの生体分子と、
    前記シェル又は前記生体分子に結合されたレポーター分子と、
    を選択的に有しているコンポジション。
  2. 前記サポートは関係する分析物に対して透過性のある媒体を有している請求項１に記載のコンポジション。
  3. 前記媒体はマトリックスを有している請求項２に記載のコンポジション。
  4. 前記粒子は前記基材上に配列されている請求項１に記載のコンポジション。
  5. 前記媒体はヒドロゲル、プロテインゲル及びポリマーより成る群から選択される請求項３に記載のコンポジション。
  6. 前記面又は前記面に結合された前記生体分子は関係する分析物に対する親和性を有している請求項１に記載のコンポジション。
  7. 前記サポート又はその一部は関係する分析物に対する親和性を有している請求項１に記載のコンポジション。
  8. 前記面又は前記面に結合された前記生体分子は分析物分子を前記面の約１００nm内へ誘引可能である請求項６に記載のコンポジション。
  9. 生体感知のための光学的に同調された金属粒子を製造する方法であって、
    前記粒子によって有意に散乱されるべき光の波長λmaxを選択する段階と、
    半径Ｒcの非伝導性コアを形成する段階と、
    前記コアに厚さＴsの金属のシェルを形成して、直径Ｄpの粒子が形成されるとともにＲcとＴsの合計がＤpのほぼ1/2に等しくなるようにする段階と、
    前記粒子によって有意に吸収又は散乱された光の波長がほぼλmaxであるようにＲc：Ｔsの比を制御する段階と、
    を有し、さらに、
    分析物の特定の分子を前記シェルに結合する段階と、
    レポーター分子を前記シェル又は前記分析物の特定の分子に結合する段階と、
    を選択的に有している方法。
  10. 前記分析物の特定の分子は生体分子である請求項９に記載の方法。
  11. 前記生体分子は抗体、抗原及び酵素から成る群から選択される請求項９に記載の方法。
  12. サンプル中の関係する生体分析物を分析する方法であって、
    所望の電磁放射源の波長にほぼ合致する最大吸収又は散乱波長を有する光学的に同調された少なくとも一つの微細シェルを選択する段階と、
    前記少なくとも一つの微細シェルを前記サンプル中の前記分析物の少なくとも一つの分子と関連させるとともにレポーター分子とも選択的に関連させて、前記波長における照射によってラマン信号を生成することのできる分析物／微細シェル複合体又はレポーター／分析物／微細シェル複合体が形成されるようにする段階と、
    前記波長における入射電磁照射によって前記複合体を照射して、表面増幅ラマン散乱が誘起されるようにする段階と、
    前記複合体からラマン散乱信号を検出する段階と、
    前記散乱信号と前記生体サンプル中の前記分析物の存在及び量のいずれか一方とを相関させる段階と、
    を有する方法。
  13. 前記光学的に同調された少なくとも一つの微細シェルを選択する段階は少なくとも一つの生体分子結合微細シェルを選択する段階を有している請求項１２に記載の方法。
  14. 前記方法は近赤外放射源を選択する段階をさらに有し、前記検出する段階は近赤外表面増幅ラマン散乱信号を検出段階を有している請求項１２に記載の方法。
  15. 前記分析物は化学物質、生体分子及びそれらの複合物から成る群から選択される少なくとも一つの分子である請求項１２に記載の方法。
  16. 前記生体分子はプロテイン、ペプチド、オリゴヌクレオチド及び多糖類から成る群から選択される請求項１５に記載の方法。
  17. 前記プロテインは抗体を含んでいる請求項１６に記載の方法。
  18. 前記少なくとも一つの生体分子は抗原を含んでいる請求項１５に記載の方法。
  19. 微細シェルベースの免疫吸着剤アッセイを実施するためのキットであって、
    所定量の第１の抗体−微細シェル複合体を有し、さらに、
    前記第１の抗体への結合に対する親和性を有する所定量の対照抗原と、
    抗原−第１の抗体−微細シェル複合体への結合に対する親和性を有する所定量の第２の抗体と、
    前記第２の抗体に結合されたレポーター分子と、
    を選択的に有し、前記レポーター分子はラマン活性官能基を有し、さらに、前記微細シェルのそれぞれが、
    独立に限定された半径を有する非伝導性のコアと、
    前記コアに接着するととともに独立に限定された厚さを有する金属のシェルと、
    限定されたコア半径：シェル厚さ比と、
    電磁スペクトルの紫外から赤外領域おける限定された最大吸光度波長と、
    表面増幅ラマン散乱を誘起することができる面と、
    を有しているキット。
  20. 前記アッセイはサンドイッチタイプの免疫吸着剤アッセイである請求項１９に記載のアッセイ。
  21. 前記アッセイは直接タイプの免疫吸着剤アッセイである請求項１９に記載のアッセイ。
  22. 前記アッセイは間接タイプの免疫吸着剤アッセイである請求項１９に記載のアッセイ。
  23. インビボにおいて生体分析物をモニタリングするための方法であって、
    紫外−赤外領域の電磁照射がしやすいとともに関係する分析物へ近づきやすい所望の生体感知部位において、光学的に同調された所定量の金属微細シェル粒子を対象の体内へ導入する段階と、
    前記粒子及び前記粒子に関係する分析物分子に電磁照射を加えて、表面増幅ラマン散乱信号が生成されるようにする段階と、
    前記信号を評価する段階と、
    信号評価と前記部位における前記分析物の存在及び量のいずれか一方とを相関させる段階と、
    を有し、前記粒子は前記粒子によって最大吸収又は散乱された光の波長が予め設定された前記照射の発生源から照射された光の波長にほぼ合致するように光学的に同調され、前記粒子は前記分析物に対する親和性を有するとともにラマン活性官能基を含むレポーター分子を選択的に有している方法。
  24. 前記最大吸収又は散乱された波長にほぼ合致する波長における電磁照射放射光の発生源を選択する段階をさらに有している請求項２３に記載の方法。
  25. 前記粒子によって最大吸収又は散乱された光の波長が予め設定された照射の発生源から照射された光の波長にほぼ合致するように所定量の光学的に同調された粒子を形成する段階をさらに有する請求項２３に記載の方法。
  26. 前記照射を加える段階が前記照射を外部から加える段階を有している請求項２３に記載の方法。
  27. 前記照射を加える段階が前記照射を内部から加える段階を有している請求項２３に記載の方法。
  28. 前記照射を加える段階が近赤外領域における照射を加える段階を有している請求項２３に記載の方法。
  29. 最大吸収又は散乱された前記波長も、与えられた媒体内で測定されると、前記分析物の最大吸収波長にほぼ合致している請求項２３に記載の方法。
  30. 独立に限定された半径を有する非伝導性のコアと、
    前記コアに接着するととともに独立に限定された厚さを有する金属のシェルと、
    限定されたコア半径：シェル厚さ比と、
    ３００nmから２０μmの領域の電磁スペクトルおける限定された最大吸光度又は散乱波長と、
    を有する粒子。
  31. 前記限定された最大吸光度又は散乱波長は電磁スペクトルの近赤外領域にある請求項３０に記載の粒子。
  32. 前記粒子は約８００−１，３００nm又は１，６００−１，８５０nmの最大吸光度又は散乱波長を有している請求項３０に記載の粒子。
  33. 前記最大波長は与えられた電磁放射源のピーク波長にほぼ合致している請求項３０に記載の粒子。
  34. 表面増幅ラマン散乱を誘起することができる面をさらに有している請求項３０に記載の粒子。
  35. 前記金属シェルに結合された少なくとも一つの分析物結合分子をさらに有している請求項３０に記載の粒子。
  36. 前記少なくとも一つの分析物結合分子は生体分子である請求項３５に記載の粒子。
  37. 前記少なくとも一つの分析物結合分子は前記シェルに結合された生体分子種の混合物である請求項３６に記載の粒子。
  38. 前記生体分子はプロテイン、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド及び多糖類から成る群から選択される請求項３３に記載の粒子。
  39. 前記生体分子はグルコースオキシダーゼであり、前記分析物はグルコースである請求項３３に記載の粒子。
  40. 前記生体分子は抗体であり、前記分析物は前記抗体に対する標的抗原である請求項３３に記載の粒子。
  41. 前記シェルは金及び銀から成る群から選択される金属を含む請求項３３に記載の粒子。
  42. 前記コアは二酸化珪素、金の硫化物、二酸化チタン、ポリメチルメタクリレート(PMMA)、ポリスチレン及びデンドリマーから成る群から選択される材料を含む請求項３３に記載の粒子。
  43. 前記コアは二酸化珪素を含み、前記シェルは金を含む請求項４３に記載の粒子。
  44. 前記コアは金の硫化物を含み、前記シェルは金を含む請求項４３に記載の粒子。
  45. 前記粒子は最大で約５μmの直径、約１nmから約５μm未満のコア直径、約１−１００nmのシェル厚さを有している請求項３０に記載の粒子。
  46. 前記コアは直径約１nm−２μmであり、前記シェルは厚さ約４０nm未満であるとともにリンカー分子によって前記コアにリンクされ、前記粒子は３００nmと２０μmとの間に最大吸光度波長を有している請求項４５に記載の粒子。
  47. 前記粒子は約２１０nmの直径を有し、半径約１００nmのＳｉＯ2のコア、厚さ約１０nmの金のシェル、約１０：１のコア半径：シェル厚さ比、及び約１０６４（ＳＤ±１０nm）の最大吸光度波長（λmax）を有している請求項４６に記載の粒子。
  48. 請求項３０の粒子を有する化学感知デバイス。
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