WO2017039345A1 - 헤모글로빈 및 당화 헤모글로빈의 동시 측정 일회용 전류식 검출방법 - Google Patents

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sensor
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conductive polymer
glycated
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PCT/KR2016/009775
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심윤보
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부산대학교 산학협력단
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    • G—PHYSICS
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    • G01N33/66—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood sugars, e.g. galactose
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y15/00—Nanotechnology for interacting, sensing or actuating, e.g. quantum dots as markers in protein assays or molecular motors

Definitions

  • the present invention relates to a microfluidic dual type sensor for simultaneous detection of glycated hemoglobin and hemoglobin, which can safely and safely detect total hemoglobin and glycated hemoglobin present in blood, and a method for simultaneous measurement of hemoglobin and glycated hemoglobin. will be.
  • Diabetes is caused by inadequate carbohydrate metabolism, which does not properly use glucose absorbed into the body, and is a disease that can cause various complications due to excessive blood sugar in the blood.
  • Hemoglobin A is a four polypeptide structure consisting of two alpha chains with 141 amino acids and two beta chains with 146 amino acids. Chromatographic analysis of hemoglobin A consists of about 95% of normal hemoglobin and about 5 to 6% of microglycosylated hemoglobin. These glycosylated hemoglobins are collectively called hemoglobin A1. 80% of hemoglobin A1 is known in the form of hemoglobin A1a, hemoglobin A1b, hemoglobin A1c, and the like in which glucose is attached to a valine residue at the beta chain N-terminus.
  • glycosylation The binding of sugar residues to non-enzymatic reactions of amino groups in proteins is called glycosylation, which is a very gradual irreversible reaction.
  • Glycosylated hemoglobin is formed by the combination of hemoglobin and blood glucose, and the ratio of hemoglobin and glycated hemoglobin is determined by the degree of exposure of red blood cells and blood glucose.
  • glucose binds to the valine residue of hemoglobin A to form a hemoglobin A1c precursor, which is a hemoglobin A1c having a stable ketoamine bond through a rearrangement reaction.
  • the contact frequency between glucose and hemoglobin increases, and the ratio of glycated hemoglobin also increases. Therefore, it is possible to accurately quantify the level of glucose in the blood by the ratio of glycated hemoglobin.
  • red blood cells have a lifespan of about 60 to 120 days, blood glucose concentration changes can be monitored for a relatively long period of time.
  • an object of the present invention is to use a microfluidic dual type sensor for simultaneous detection of glycated hemoglobin and hemoglobin by using time-current method, and the general public can also detect hemoglobin and glycated hemoglobin with rapid and accurate at home.
  • the present invention provides a method for simultaneously detecting a hemoglobin and glycated hemoglobin.
  • the present invention includes a first sensor for detecting hemoglobin and a second sensor for detecting hemoglobin
  • the first sensor comprises: an electrode; A gold nanoparticle layer coated on the electrode surface; A conductive polymer layer electrodeposited on the gold nanoparticle layer; And a receptor and an organic electron transfer medium of glycated hemoglobin covalently bonded on the conductive polymer layer
  • the second sensor comprises: an electrode; A conductive polymer composite layer electrodeposited on the electrode surface; And an organic electron transfer medium covalently bonded on the conductive polymer composite layer, wherein the conductive polymer composite layer is formed of a conductive polymer and an electrode catalyst material, and is provided in a dual type facing the first sensor and the second sensor. It provides a microfluidic dual type sensor for the simultaneous detection of glycated hemoglobin and hemoglobin, characterized in that formed by the sensor of.
  • the present invention comprises the steps of preparing a first sensor for detecting glycated hemoglobin; Manufacturing a second sensor for detecting hemoglobin; And manufacturing a dual type sensor disposed to face the first sensor for detecting glycated hemoglobin and the second sensor for detecting hemoglobin, wherein the manufacturing of the first sensor comprises: Coating a nanoparticle layer, adding a conductive monomer on the gold nanoparticle layer, electropolymerizing to electrodeposit a conductive polymer layer, activating a functional group of the conductive polymer layer, and conducting the activated functional group Covalently binding a glycosylated hemoglobin receptor, which is a glycosylated hemoglobin receptor, and an organic electron transport medium on the polymer layer, and fabricating the second sensor comprises preparing a mixture of a conductive monomer and an electrode catalyst material on an electrode surface.
  • Adding, electrolytic polymerization to electrodeposit the conductive polymer composite layer, the conductive polymer composite layer It provides a method of manufacturing a microfluidic dual type sensor for the simultaneous detection of glycated hemoglobin and hemoglobin, comprising the step of activating a functional group, and covalently bonding an organic electron transfer medium on the conductive polymer composite layer activated by the functional group. .
  • the present invention comprises the steps of hemolysis or treatment of hydrogen peroxide from the blood sample isolated from the human body; And the hemoglobin and glycated hemoglobin comprising the step of introducing a blood sample treated with hydrogen peroxide on the surface of the dual type sensor according to claim 1 to the catalytic reduction current of hydrogen peroxide or the reduction current of the organic electron transfer medium A simultaneous measurement current detection method is provided.
  • the present invention can be used to measure the concentration of hemoglobin and glycated hemoglobin in a blood sample quickly and accurately by using the current method instead of the conventional high performance liquid chromatography (HPLC) or impedance method, and the method of hemoglobin and glycated hemoglobin It is possible to measure the concentration of two substances at the same time without going through the separation step, so that the ratio can be obtained.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • Figure 1 (A) is a process for producing glycated hemoglobin (first sensor), hemoglobin (second sensor), and dual sensors (third sensor) for simultaneous detection of glycated hemoglobin and hemoglobin
  • Figure 1 (B) is a glycated hemoglobin and hemoglobin Schematic diagram of a microfluidic dual type sensor for simultaneous detection of.
  • FIG. 2 (A) shows CV recording electropolymerization of TTBA on AuNPs / SPCE
  • FIG. 2 (B) shows CV recorded for APBA / pTTBA / AuNPs / SPCE
  • FIG. 2 (C) shows APBA / pTTBA / AuNPs / SPCE layers.
  • FIG. 2 (D) shows the catalytic reduction current change of electron transfer mediator by capture of HbA 1c on antibody / TBO / pTTBA @ MWCNT / SPCE layer
  • FIG. 2 (E) shows a linear curve of change in oxidation / reduction current of TBO according to scanning speed.
  • FIG. 3 (A) and 3 (B) show the results of ESCA analysis, respectively, at the N1s and B1s peaks on the surfaces of pTTBA / AuNPs, and APBA / pTTBA / AuNPs, and FIG. 3 (C) shows the phases of pTTBA / AuNPs.
  • Figure 2 shows the frequency change (solid line) when APBA is immobilized and the frequency change (dotted line) when HbA 1c is immobilized on APBA / pTTBA / AuNPs.
  • 4 (A) is a temperature effect for the amperometric analysis of HbA 1c
  • 4 (B) is a pH effect for the amperometric analysis of HbA 1c
  • Figure 4 (C) is a hydrogen peroxide concentration for the amperometric analysis of HbA 1c Effect
  • Figure 4 (D) is a diagram showing the applied potential effect for the current analysis of HbA 1c .
  • FIG. 5 (A) shows a linear calibration curve of HbA 1c using a first sensor modified with a boronic acid derivative, and an insertion diagram shows a long-time current response.
  • FIG. 5 (B) shows HbA when an antibody / TBO is modified.
  • Figure 5c shows a linear calibration curve
  • Figure 5 (c) is a diagram showing a linear calibration curve of the HbA 1c through the impedance analysis using a first sensor modified with a boronic acid derivative as a Nyquist plot (Nyquist plot).
  • FIG. 6 (A) shows a glycosylated hemoglobin detection calibration curve at the time of analytical analysis using a first sensor modified with boronic acid derivative on a sample from which plasma has been separated through a syringe filter (Syringe Filter), and FIG. 6 (B) Shows the Nyquist plot of whole blood and pre-treated samples by impedance analysis using the first sensor modified with boronic acid derivative, Figure 6 (C) shows the results of impedance analysis in the pre-treated samples And the results of the amperometric analysis.
  • FIG. 7 (A) shows the current response of Hb by the cyclic scanning voltage method using the second sensor (hemoglobin sensor unit) of the TBO / pTTBA @ MWCNT / SPCE electrode
  • FIG. 7 (B) shows the second sensor.
  • the linear calibration curve of the used Hb, and the inset shows the large-time current response.
  • the present invention includes a first sensor for detecting hemoglobin and a second sensor for detecting hemoglobin, wherein the first sensor comprises: an electrode; A gold nanoparticle layer coated on the electrode surface; A conductive polymer layer electrodeposited on the gold nanoparticle layer; And a receptor and an organic electron transfer medium of glycated hemoglobin covalently bonded on the conductive polymer layer, wherein the second sensor comprises: an electrode; A conductive polymer composite layer electrodeposited on the electrode surface; And an organic electron transfer medium covalently bonded on the conductive polymer composite layer, wherein the conductive polymer composite layer is formed of a conductive polymer and an electrode catalyst material, and is provided in a dual type facing the first sensor and the second sensor. It provides a microfluidic dual type sensor for the simultaneous detection of glycated hemoglobin and hemoglobin, characterized in that formed by the sensor of.
  • the electrode may be a screen printed carbon electrode, but is not particularly limited as long as the electrode may serve as a sensor based on electrochemistry.
  • the conductive polymer is p-2,2 ': 5', 5 "-terthiophene-3'-p-benzoic acid (p-TTBA), p-5,2 ': 5.2" -terthiophene-3'-carboxyl Acid (p-TTCA) and p-2.5-di- (2-thienyl) -1H-pyrrole-P-benzoic acid (p-DTPBA), but is not limited thereto.
  • the receptor for glycated hemoglobin may be any one selected from boronic acid derivatives, antibodies, or aptamers, but is not limited thereto.
  • the boronic acid derivative is a receptor for glycated hemoglobin that detects glycated hemoglobin by cis-diol bond with glycated hemoglobin, and is amino-phenylboronic acid (APBA), phenyl boronic acid (PBA), thienyl boronic acid (TBA). And it may be selected from the group consisting of methyl boronic acid (MBA), if the one having a -B (OH) 2 substituent is not limited thereto.
  • APBA amino-phenylboronic acid
  • PBA phenyl boronic acid
  • TSA thienyl boronic acid
  • the aptamer is a molecular recognition material that specifically binds to a target molecule, and thus has a high affinity and specificity for the target molecule as compared with an antibody, and thus is specifically composed of an organic electron transport medium and a complex to glycosylated hemoglobin. can do.
  • the aptamer may be a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 (5′-AAA CCT GGT GTC TGG TGG GGG GGG GGC AGG CGG CGA GGA TTG CGG CGC TGC TAC ACA AAC AGA AGG AA-3 ′).
  • the organic electron transfer medium may be methylene blue (MB) or toluidine blue O (TBO), but is not limited thereto.
  • the organic electron transfer mediator may be used as a receptor for glycated hemoglobin by forming a complex with an antibody and an aptamer, and the sensor manufactured by covalently bonding the organic electron transfer mediator to the conductive polymer composite layer alone may be a total hemoglobin in a blood sample. Can be detected. Accordingly, the ratio of glycated hemoglobin to total hemoglobin is detected by simultaneously measuring the concentrations of the two substances without performing the separation of total hemoglobin and glycated hemoglobin based on the dual type sensor combined with the first and second sensors. can do.
  • the electrode catalyst material may be any one selected from the group consisting of carbon nanotubes (CNT), graphene oxide (GO), graphene oxide reduced product (rGO), and mixtures thereof, but is not limited thereto.
  • the present invention comprises the steps of preparing a first sensor for detecting glycated hemoglobin; Manufacturing a second sensor for detecting hemoglobin; And manufacturing a dual type sensor disposed to face the first sensor for detecting glycated hemoglobin and the second sensor for detecting hemoglobin, wherein the manufacturing of the first sensor comprises: Coating a nanoparticle layer, adding a conductive monomer on the gold nanoparticle layer, electropolymerizing to electrodeposit a conductive polymer layer, activating a functional group of the conductive polymer layer, and conducting the activated functional group Covalently binding a glycosylated hemoglobin receptor, which is a glycosylated hemoglobin receptor, and an organic electron transport medium on the polymer layer, and fabricating the second sensor comprises preparing a mixture of a conductive monomer and an electrode catalyst material on an electrode surface.
  • Adding, electrolytic polymerization to electrodeposit the conductive polymer composite layer, the conductive polymer composite layer It provides a method of manufacturing a microfluidic dual type sensor for the simultaneous detection of glycated hemoglobin and hemoglobin, comprising the step of activating a functional group, and covalently bonding the organic electron transfer medium on the conductive polymer composite layer activated by the functional group.
  • the conductive monomers are 2,2 ': 5', 5 "-terthiophene-3'-p-benzoic acid (TTBA), 5,2 ': 5.2" -terthiophene-3'-carboxylic acid (TTCA) and 2.5 It may be any one selected from the group consisting of -di- (2-thienyl) -1H-pyrrole-P-benzoic acid (DTPBA), but is not limited thereto.
  • the conductive monomer has excellent electrical conductivity and can be used for various applications, and has excellent thermal stability and chemical stability, thereby improving the performance or life of the sensor when synthesizing the conductive polymer through the conductive monomer.
  • the average thickness of the conductive polymer layer formed on the gold nanoparticle layer is an important factor for increasing the sensitivity and response time
  • the average thickness of the conductive polymer composite layer may be 100 to 300 nm. .
  • the average thickness of the conductive polymer layer When the average thickness of the conductive polymer layer is thinner than 100 nm, problems such as a lack of binding sites of the receptor may occur. Also, when the average thickness of the conductive polymer layer is thicker than 300 nm, sensitivity and response time due to a decrease in conductivity may be caused.
  • the conductive polymer layer and the conductive polymer composite layer used in the first and second sensors may easily absorb hemoglobin and glycated hemoglobin, which may cause problems such as reduction, and thus have an average thickness of 200 nm. It is more preferable to synthesize the conductive conductive polymer layer to the polymer composite layer having a.
  • the functional group is a carboxyl group
  • a method for activating the carboxyl group is a phosphate buffer solution containing a mixture of N-hydroxysuccinimide in a 1-ethyl-3- [3- (dimethylamino) propyl] carbodiimide hydrochloride solution. It can be immersed in (Phosphate Buffered Saline: PBS) to activate the carboxyl group of the conductive monomer, but is not limited thereto.
  • the present invention comprises the steps of hemolysis or treatment of hydrogen peroxide from the blood sample isolated from the human body; And the hemoglobin and glycated hemoglobin comprising the step of introducing a blood sample treated with hydrogen peroxide on the surface of the dual type sensor according to claim 1 to the catalytic reduction current of hydrogen peroxide or the reduction current of the organic electron transfer medium A simultaneous measurement current detection method is provided.
  • the blood sample may hemolyze red blood cells from which plasma is separated through a filter or centrifugation, or hemolysis whole blood, but separated through a syringe filter. After removing the plasma, the remaining red blood cells may be lysed using a hemolysis buffer, or more simply, the whole blood may be directly hemolyzed using a hemolysis buffer.
  • the methods are more preferable than the conventional method of erythrocyte hemolysis, which separates the plasma through centrifugation, and can easily process the blood discharged from the human body, and other simple glycosylated proteins in the blood through simple pretreatment using hydrogen peroxide. Interfering effects can be prevented, and glycated hemoglobin can be analyzed in situ quickly.
  • the concentration of hydrogen peroxide required to treat hydrogen peroxide in the blood sample isolated from the human body may be 2.0 to 4.0 mM, and the peak current gradually increases as the concentration of hydrogen peroxide increases from 2.0 mM to 4.0 mM, which is stable at 3.0 mM. It is more preferable that the concentration of hydrogen peroxide required for pretreatment of the separated blood sample is 3.0 mM.
  • the reduction current analysis of the hydrogen peroxide or the organic electron transfer medium may be pH 7.0 to 7.4, when the pH below 7.0 or pH 7.4 or more may cause problems such as reduced activity of glycated hemoglobin, the maximum current response at pH 7.4 As this occurs, it is more preferable to maintain pH 7.4.
  • the reduction current analysis of the hydrogen peroxide or the organic electron transfer medium may be a temperature of 25 to 35 °C, when less than 25 °C has a problem such as a decrease in the electron transfer rate between glycated hemoglobin and hydrogen peroxide or organic electron transfer medium, 35 °C or more At the temperature, a problem occurs in that the peak current decreases due to thermal modification of glycated hemoglobin, and it is more preferable to maintain a temperature of 30 ° C.
  • the reduction current analysis of the hydrogen peroxide or organic electron transfer mediator can be performed at an application potential of -0.50 V to -0.3 V, since the peak current increases when the application potential decreases to -0.3 V and the maximum reaction occurs at -0.45 V.
  • Running at a -0.45 V application potential can simultaneously detect hemoglobin and glycated hemoglobin with high sensitivity.
  • the reduction current analysis of the hydrogen peroxide or the organic electron transfer medium can be analyzed by time-zone method.
  • Deposition time 60 seconds, scanning speed 0.1 V / s, deposition potential -0.6V, three potential scans.
  • a conductive polymer composite layer of pTTBA was formed on the AuNPs / SPCE electrode by electropolymerization according to a conventionally known method (Biosens. Bioelectron. 2003, 18, 773-780, Biomaterials, 2010, 31, 7827-7835). More specifically, AuNPs / SPCE electrodes were first immersed in a solution containing TTBA. At this time, the solution was a mixture of di (propylene glycol) methyl ester and tri (propylene glycol) methyl ester in a 1: 1 weight ratio.
  • pTTBA was electrodeposited on the AuNPs / SPCE electrode by performing three potential scans of -0.1 V to 1.1 V (Ag / AgCl) at a 0.1 M phosphoric acid buffer solution (pH 7.4) at a scanning speed of 0.1 V / s.
  • pTTBA / AuNPs / SPCE electrodes were prepared.
  • the pTTBA / AuNPs / SPCE was converted to 10.0 mM 1-ethyl-3- [3- (dimethylamino) propyl] carbodiimide (1-Ethyl-3- [3- (dimethylamino) propyl] carbodiimide hydrochloride (EDC) and 10.0 It was immersed in 0.1 M phosphate buffer solution (pH 7.4) containing mM N-hydroxysuccinimide (NHS) mixture for 12 hours to activate the carboxyl group of pTTBA and washed with phosphate buffer solution.
  • phosphate buffer solution pH 7.4
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • Fabrication of the first sensor using boronic acid derivatives was carried out by reacting the pTTBA / AuNPs / SPCE electrode in a 10.0 mM 3-aminophenylboronic acid (APBA) solution for 12 hours at 40 ° C.
  • APBA 3-aminophenylboronic acid
  • TBO and antibodies (Abcam, UK; ab31152) or 5′-AAA CCT GGT GTC TGG TGG GGG GGG GGG GGC AGG CGG CGA GGA TGA CGG CGC TGC TAC ACA AAC AGA AGG AA-3 ′ on pTTBA / AuNPs / SPCE electrodes
  • the modified electrode of the first sensor was manufactured by simultaneously covalently binding an aptamer having a nucleotide sequence of.
  • the modified electrode (APBA / pTTBA / AuNPs / SPCE, aptamer-TBO / AuNPs / SPCE) through covalent linkage between the carboxyl group of TTBA and boronic acid derivatives, the amine group of antibody / TBO, or the amine group of aptamer / TBO , Antibody-TBO / AuNPs / SPCE were prepared.
  • Multi-walled carbon nanotubes were dispersed in a surfactant (0.5% triton X 100) solution, and the conductive polymer monomer TTBA was dissolved in acetonitrile solution to prepare each solution.
  • the two solutions were mixed to prepare a carbon nanotube and a conductive polymer monomer (TTBA @ MWCNT) mixed solution, and the mixed solution was coated on SPCE.
  • TTBA @ MWCNT / SPCE coated electrode was fabricated in three potential scans from -0.1 to 1.1V (Ag / AgCl) at 0.1 V / s in 0.1 M phosphate buffer solution (pH 7.4) A composite layer of carbon nanotubes and a conductive polymer (pTTBA @ MWCNT / SPCE) was formed.
  • pTTBA @ MWCNT / SPCE electrodes were prepared using 10.0 mM 1-ethyl-3- [3- (dimethylamino) propyl] carbodiimide (1-Ethyl-3- [3- (dimethylamino) propyl] carbodiimide hydrochloride (EDC) and It was immersed in 0.1 M phosphate buffer solution (pH 7.4) containing 10.0 mM N-hydroxysuccinimide (NHS) mixture for 12 hours to activate the carboxyl group of pTTBA and then washed with phosphate buffer solution. .
  • TBO was covalently bonded on the pTTBA @ MWCNT / SPCE electrode to prepare a second sensor modified electrode (TBO / pTTBA @ MWCNT / SPCE).
  • a microfluidic dual type sensor for simultaneously detecting glycated hemoglobin and hemoglobin was manufactured.
  • Electrochemical analysis was performed in a three-electrode cell reaction system using an integral SPCE.
  • the modified SPCE made the working electrode (area: 0.07 cm 2 ), and Ag / AgCl and carbon were used as standard electrodes, respectively.
  • SPCE was printed on polystyrene film using a screen printer (BANDO industrial, Korea).
  • Cyclic voltammogram (hereinafter referred to as CV) was measured using Potentiostat / Galvanostat (model: KST-P2, Kosentech), LSV was measured using Kosentech Model PT-1, and current analysis was performed using EG & G. It was measured using PAR Model PAR 273A. All electrochemical measurements were performed in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4).
  • Quartz Crystal Microbalance analysis ('QCM') was performed with SEIKO EG & G model QCA 917 and PAR model 263A potentiostat / galvanostat. Au working electrodes (area: 0.196 cm -2 ; 9 MHz; AT-cut quartz crystal) was used. Impedance analysis was measured using EG & G Princeton Applied Research PARSTAT 2263 at 100 kHz to 50 mHz at a sampling rate of 5 points per step (AC amplitude: 10 mV). X-ray photoelectron spectroscopy analysis (hereinafter referred to as 'XPS') was performed using a VG Scientific Escalab 250 XPS spectrometer (monochromed Al K ⁇ light source (KBSI Busan, Korea)).
  • FIG. 2 (A) the CV recording the electropolymerization of TTBA on AuNPs / SPCE is shown.
  • the pTTBA layer was formed through the anodic electropolymerization of AuNPs / SPCE surface in which monomer was added. Oxidation peaks at about 0.7 V in a first anodic scan of -0.2 V to 1.0 V indicate polymer formation through monomer oxidation, while other redox peaks of AuNPs were observed at 0.57 V / 0.15 V.
  • APBA or antibody-TBO or aptamer-TBO was immobilized on the pTTBA / AuNP / SPCE layer respectively.
  • FIG. 2 (B) which shows the CV recorded for APBA / pTTBA / AuNPs / SPCE
  • no redox peak was observed in the CV of pTTBA / AuNPs / SPCE without APBA, but in the case of modified APBA
  • Figure 2 (C) depicts the CV recorded for the catalytic reduction of hydrogen peroxide according to the change in current density due to the capture of the HbA 1c, by an oxidation-reduction process by heme groups of the HbA 1c captured on the APBA -0.34 V / - At 0.16 V a pair of redox peaks appeared.
  • the hydrogen peroxide concentration was increased from 1 mM to 5 mM, it was confirmed that the reduction current increases at -0.34 V.
  • the CV recorded on the reduction current of TBO by capturing HbA 1c in the antibody on the antibody-TBO / pTTBA / AuNPs / SPCE layer is shown.
  • the redox peak of TBO, an organic electron transfer mediator, was observed at -0.31 V / -0.26 V.
  • the concentration of HbA 1c bound to the antibody was increased, the reduction current size of TBO was increased. From these results, it can be seen that APBA or antibody-TBO was successfully immobilized on the pTTBA / AuNP / SPCE layer.
  • the catalytic reduction current of hydrogen peroxide or the reduction current of TBO is increased by the concentration of glycated hemoglobin bound to the first two types of sensors. It was confirmed that HbA 1c can be detected by analyzing the current change according to the concentration of glycated hemoglobin bound to these first sensors.
  • the frequency change (solid line) when APBA is immobilized on pTTBA / AuNPs, and the frequency change (dotted line) when HbA 1c is immobilized on APBA / pTTBA / AuNPs, are shown in pTTBA / AuNPs phase.
  • the total frequency change ( ⁇ f) is 78.4 Hz, corresponding to mass increase of 86.17 ng, and the surface category of APBA is 2.86 x 10 was calculated to be 9 mol / cm 2.
  • the frequency change with the probe with APBA occurred quickly by the interaction between HbA 1c -APBA in a solution containing 1.0% HbA 1c . That is, after about 20 minutes, a stable state was maintained while exhibiting a frequency change of 103.11 Hz. This frequency change represents a change in mass of 113.34 ng and HbA 1c Surface category is 1.03 x 10 - was calculated to be 10 mol / cm 2. Referring to FIG. 3 (C), it can be seen that the time for interaction between HbA 1c and APBA is very short, and thus may be usefully used for HbA 1c detection.
  • a first sensor was fabricated by covalently binding APBA or antibody-TBO, a glycosylated hemoglobin receptor having an amine group, and a reduction current of a hydrogen peroxide catalyst or a reduction current of an organic electron transfer mediator by glycated hemoglobin bound to the respective sensors.
  • concentration of glycated hemoglobin was quantitatively analyzed to change the temperature, pH, hydrogen peroxide concentration and application potential.
  • Electrodeposition of TTBA, a conductive polymer on AuNPs-coated SPCE, using electrochemical methods, to determine the optimal conditions for current analysis of HbA 1c using APBA or antibody-TBO-modified sensors A first sensor prepared by covalently binding APBA or antibody-TBO, a glycosylated hemoglobin receptor having an amine group, and a second sensor manufactured by covalently binding TBO on a pTTBA @ MWCNT / SPCE electrode were prepared.
  • the reduction current of the hydrogen peroxide catalyst by the glycated hemoglobin coupled to or the reduction current of the organic electron transfer mediator was monitored by time-current method to quantitatively analyze the concentrations of hemoglobin and glycated hemoglobin to change the temperature, pH, hydrogen peroxide concentration and application potential. Investigate.
  • FIG. 4 (A) shows a temperature effect for the current analysis of HbA 1c , and gradually increases the peak current from 10 ° C. to 30 ° C., but at temperatures above 35 ° C., glycated hemoglobin (HbA 1c). Since the peak current decreased due to thermal denaturation of), the optimum temperature was set to 30 ° C.
  • FIG. 4 (D) shows the effect of applied potential for the amperometric analysis of glycated hemoglobin (HbA 1c ), and the peak current increased when the applied potential decreased to ⁇ 0.3 V, and the maximum response was ⁇ 0.45 V. As observed, the optimum application potential was set at -0.45 V.
  • HbA 1c Amperometric analysis of HbA 1c was performed using APBA / pTTBA / AuNPs / SPCE or antibody-TBO / pTTBA / AuNPs / SPCE under the optimal assay conditions identified above. That is, APBA / pTTBA / AuNP / SPCE or antibody-TBO / pTTBA / AuNPs / SPCE were reacted in HbA 1c- containing solution at various concentrations for 2 minutes, and then washed with 0.1 M phosphate buffer solution.
  • a linear calibration curve of HbA 1c is used for inserting a linear calibration curve of HbA 1c using two types of first sensors modified with boronic acid derivatives or antibody-TBO.
  • concentration of HbA 1c captured increased, the reduction current of the hydrogen peroxide or the electron transport medium was specifically promoted by HbA 1c , and the catalytic reduction current increased.
  • HbA 1c The electrochemical catalytic reaction for detection was linear at 0.1-1.5% and the HbA 1c detection limit was found to be 0.052 ⁇ 0.02%.
  • the first sensor modified with antibody-TBO was linear at 2.5-12%.
  • the concentration of hydrogen peroxide which affects the response of the first sensor to detect and detect glycated hemoglobin, was optimized to 3.0 mM, temperature of 30 ° C., pH of 7.4, and measurement voltage of -0.45 V.
  • HbA 1c The linearly sensitive concentration range of was 1 to 15% and the detection limit was 0.52 ⁇ 0.2%.
  • APBA / pTTBA / AuNPs / SPCE were analyzed and compared with the results of current analysis.
  • APBA / pTTBA / AuNPs / SPCE were reacted for 5 minutes in various concentrations of HbA 1c containing solution before impedance analysis, and then washed with 0.1 M phosphate buffer solution.
  • the HbA 1c -APBA interaction occurring on the surface of the first sensor causes a change in interfacial properties, resulting in an impedance response. As the concentration of HbA 1c increases, the impedance increases.
  • the linear calibration curve of HbA 1c and the Nyquist plot of the insertion are shown.
  • the captured HbA 1c is linear in the range of 0.5 to 6.0%, and the detection limit is The detection sensitivity was 0.27%, indicating that the detection sensitivity was lower than that of the previous amperometric analysis.
  • Hemoglobin sensor of the current measurement was used TBO / pTTBA @ MWCNT / AuNPs / SPCE (see Figure 7). As the concentration of hemoglobin increased, it was confirmed that the reduction current of TBO, an electron transfer mediator, increased. 7 (B) shows the linear calibration curve of Hb using the sensor, and the insertion time shows the large-time current response. Hb linear concentration appeared linear at 0.1-10 ⁇ M.
  • the hemoglobin and glycated hemoglobin concentrations were measured using a first sensor for detecting glycated hemoglobin and a dual type of dual sensor for simultaneously detecting hemoglobin and glycated hemoglobin, and the concentration ratio of the two detection substances was calculated to calculate more precise glycation. The concentration of hemoglobin could be inferred.
  • the results of detecting hemoglobin and glycated hemoglobin in real human blood using the time-current method which is a method for detecting hemoglobin and glycated hemoglobin according to the present invention, are compared with the results of conventional analysis using HPLC and impedance.
  • the time-phase current method according to the present invention glycosylated hemoglobin can be detected more easily, safely, and more sensitively, and thus can be usefully used for disposable current-type glycated hemoglobin for on-site diagnosis of diabetes.
  • the filtration method using a syringe filter for the analysis of glycated hemoglobin using the first sensor modified boronic acid derivative is collected on the syringe filter (pore size: 0.45 ⁇ m) of 2 ⁇ l of whole blood obtained from the finger terminal, and then the plasma is removed. It was. The red blood cells obtained on the filter were then washed three times with 0.9% NaCl solution. Hemoglobin was eluted on the filter page by adding 18 ⁇ l of hemolysis buffer to the red blood cells, and impedance and current measurements were performed after 15 minutes, respectively.
  • blood can be pretreated in a simpler manner than the above method.
  • 1 ⁇ l of whole blood discharged from the human finger was hemolyzed with 10 ⁇ l hemolysis buffer, and dilute 400 times with 0.1 M phosphate buffer solution (pH 7.4) to perform a current measurement.
  • HbA 1c was analyzed using whole blood containing unpretreated glucose, glycated albumin, and other glycated proteins, and samples pretreated with syringe filters or centrifugation. Interference effects were reviewed.
  • HbA 1c the concentration of HbA 1c could not be detected by the current equation due to the disturbance factors such as glucose in whole blood, but using a syringe-filtered sample as in the present invention, it was 4.72 ⁇ through the amperometric analysis as shown in FIG. 6 (A). HbA 1c was detected at 0.12%, and as shown in FIG. 6 (B), the pre-treated whole blood showed 430.6 k ⁇ and the pre-treated sample had a ⁇ R p value of 230.7 k ⁇ .
  • the first sensor using a different type of antibody-TBO only HbA 1c reacts specifically so that there is no other interference effect. Therefore, when the first sensor modified with antibody-TBO is used, glycated hemoglobin can be detected by a simple blood pretreatment method.
  • the impedance analysis results and the current analysis results are consistent with each other in the pretreated sample.
  • Table 1 shows a calibration curve for the data comparing the results of the concentration of HbA 1c in real blood using the first and second sensors developed through the present invention and the conventional method of HPLC, which is 5.64 ⁇ 0.09 %, 7.76 ⁇ 0.04%, healthy volunteers were 5.18 ⁇ 0.02%, 5.38 ⁇ 0.05%, and 4.72 ⁇ 0.12%, respectively, and 5.26 ⁇ 0.03%, which is the result of HbA 1c concentration analysis of healthy volunteers by centrifugation, 5.41 ⁇ 0.09%, and 4.92 ⁇ 0.08%.
  • the concentration of HbA 1c obtained through HPLC experiments currently used in hospitals for diabetics was 5.7%, and 7.5%, which is consistent with the results using the sensor developed through the present invention.
  • HbA 1C concentration (%) using the blood pretreatment method according to the present invention HbA 1C concentration (%) using conventional blood pretreatment Normal blood sample 5.2 5.3 5.4 5.4 4.7 4.9 HbA 1C concentration (%) through amperometric method HbA 1C concentration (%) via HPLC analysis Patient blood samples 5.6 5.7 7.8 7.5

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Abstract

본 발명은 본 발명은 혈액 중에 존재하는 총 헤모글로빈과 당화 헤모글로빈을 간단하면서도 높은 민감도로 안전하게 검출할 수 있는 헤모글로빈 및 당화 헤모글로빈의 일회용 동시 검출 전류식 검출방법에 관한 것으로서, 종래 사용해 오던 고성능 액체크로마토그래피(HPLC) 또는 임피던스 방법 등의 측정방법 대신 전류법을 사용함으로써, 혈액 시료 내의 헤모글로빈 및 당화 헤모글로빈의 농도를 빠르고 정확하게 측정할 수 있고, 헤모글로빈과 당화 헤모글로빈의 분리단계를 거치지 않고 동시에 두 물질의 농도를 측정하여 그 비율을 구할 수 있어, 현장 즉시형의 일회용 전류식 분석방법으로 당뇨병을 효과적으로 진단할 수 있다.

Description

헤모글로빈 및 당화 헤모글로빈의 동시 측정 일회용 전류식 검출방법
본 발명은 혈액 중에 존재하는 총 헤모글로빈과 당화 헤모글로빈을 간단하면서도 높은 민감도로 안전하게 검출할 수 있는 당화 헤모글로빈과 헤모글로빈 동시 검출용 마이크로 플루이딕 듀얼 타입 센서 및 헤모글로빈 및 당화 헤모글로빈의 동시 측정 전류식 검출방법에 관한 것이다.
당뇨병은 체내에 흡수된 포도당을 제대로 사용하지 못하는 부적절한 탄수화물 대사로 인하여 발생하며, 혈액 내에 과다한 혈당을 가지게 되어 다양한 합병증을 유발할 수 있는 질환이다.
당뇨병을 진단하는 방법으로는 요당측정, 혈중 포도당 측정 등 여러 가지가 있지만, 요당측정은 신뢰할 수 없으며, 혈중 포도당은 식사, 운동 등 여러 요인의 영향을 받아 부정확하다. 따라서, 당뇨병을 관리하고 치료하기 위해서는, 3개월 간의 평균 혈당치가 중요시 되고 있으므로, 혈액 중 당화 헤모글로빈(HbA1c)을 측정하는 것이 효과적이다.
성인의 헤모글로빈은 97%의 헤모글로빈 A, 2.5%의 헤모글로빈 A2 및 0.5%의 헤모글로빈 F의 세 종류로 구성되어 있다. 이중 헤모글로빈 A는 141개의 아미노산을 가진 두 개의 알파체인과 146개의 아미노산을 가진 두 개의 베타체인으로 이루어진 네 개의 폴리펩타이드 구조이다. 헤모글로빈 A를 크로마토그래피법으로 분석해 보면 약 95%의 일반적인 헤모글로빈과 약 5 내지 6% 정도의 미량 당화 헤모글로빈으로 구성되며, 이들 당화 헤모글로빈을 통칭하여 헤모글로빈 A1라고 한다. 이러한, 헤모글로빈 A1의 80%는 베타사슬 N-말단의 발린 잔기에 포도당이 결합된 형태로 헤모글로빈 A1a, 헤모글로빈 A1b, 헤모글로빈 A1c 등이 알려져 있다.
단백질의 아미노기에 당 잔기가 비효소적인 반응으로 결합하는 것을 당화 과정이라 하며, 이 반응은 매우 점진적인 비가역적인 반응이다. 당화 헤모글로빈은 헤모글로빈과 혈중 포도당의 결합에 의해 형성되고, 헤모글로빈과 당화 헤모글로빈의 비율은 적혈구와 혈중 포도당의 노출 정도에 의해 결정된다. 구체적으로, 당화 과정에서는 헤모글로빈 A의 발린 잔기에 포도당이 결합하여 헤모글로빈 A1c 전구물질을 형성하게 되며, 이는 재배열 반응을 통해 안정적인 케토아민 결합을 가진 헤모글로빈 A1c가 된다. 이때 혈액 내의 포도당 수치가 높아지면 포도당과 헤모글로빈의 접촉빈도가 높아지고, 당화 헤모글로빈의 비율도 증가하게 된다. 따라서 당화 헤모글로빈의 비율로써 혈액 내 포도당 수치의 정확한 정량이 가능하다. 또한, 적혈구의 수명은 60 내지 120일 정도이므로 비교적 긴 기간 동안 혈중 포도당 농도변화를 모니터링 할 수 있다.
혈액 내의 당화 헤모글로빈을 측정하기 위한 다양한 측정법이 개발되어 왔다. 현재 상업적으로 응용되고 있는 방법으로는 이온교환 크로마토그래피법, 친화성 크로마토그래피법, 전기영동법, 복합착색법 등이 있다. 그러나, 이러한 방법들은 다량의 혈액 (정맥혈), 혈액의 전처리/분석을 위한 고가 장비들 (초고속 원심분리기, 고성능 액체 크로마토그래피) 및 분석을 위한 많은 시간이 요구된다. 당화 헤모글로빈의 측정은 통상 병원에서 전문 인력이 수행하는 방법으로 당뇨환자들이 주기적으로 병원을 방문해서 당화 헤모글로빈의 수치를 검사해야 하는 번거로움과 사회적 비용이 발생한다.
따라서, 상기 지적된 문제점을 극복하기 위해 전위차 분석법을 이용한 당화 헤모글로빈의 측정용 센서에 대한 개발이 진행 중에 있으나, 아직까지 전류법을 이용하여 헤모글로빈 및 당화 헤모글로빈을 높은 민감도로 검출하면서 동시 측정 검출 방법에 대해서는 전무한 상황이다.
이에, 본 발명의 목적은 시간대-전류법을 이용한 당화 헤모글로빈과 헤모글로빈 동시 검출용 마이크로 플루이딕 듀얼 타입 센서를 이용하여 일반인들도 가정에서 신속성 및 정확성이 구비된 헤모글로빈 및 당화 헤모글로빈을 검출할 수 있는 일회용의 헤모글로빈 및 당화 헤모글로빈의 동시 검출 전류식 검출방법을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 당화 헤모글로빈 검출용 제1센서 및 헤모글로빈 검출용 제2센서를 포함하며, 상기 제1센서는, 전극; 상기 전극 표면 상에 코팅된 금나노입자층; 상기 금나노입자층 상에 전착된 전도성 고분자 층; 및 상기 전도성 고분자 층 상에 공유결합된 당화 헤모글로빈의 수용체와 유기전자전달 매개체를 포함하고, 상기 제2센서는, 전극; 상기 전극 표면 상에 전착된 전도성 고분자 복합층; 및 상기 전도성 고분자 복합층 상에 공유결합된 유기전자전달 매개체를 포함하며, 상기 전도성 고분자 복합층은 전도성 고분자와 전극 촉매 물질로 이루어진 것이고, 상기 제1센서와 제2센서를 대향하여 배치한 듀얼 타입의 센서로 형성된 것을 특징으로 하는, 당화 헤모글로빈과 헤모글로빈 동시 검출용 마이크로 플루이딕 듀얼 타입 센서를 제공한다.
또한 본 발명은 당화헤모글로빈을 검출하는 제1센서를 제작하는 단계; 헤모글로빈을 검출하는 제2센서를 제작하는 단계; 및 상기 당화헤모글로빈을 검출하는 제1센서와 헤모글로빈을 검출하는 제2센서를 대향하여 배치한 듀얼 타입의 센서를 제작하는 단계를 포함하며, 상기 제1센서를 제작하는 단계는, 전극 표면 상에 금나노입자 층을 코팅하는 단계, 상기 금나노입자 층 상에 전도성 단량체를 첨가하고, 전해중합하여 전도성 고분자 층을 전착시키는 단계, 상기 전도성 고분자 층의 작용기를 활성화시키는 단계, 및 상기 작용기가 활성화된 전도성 고분자 층 상에 당화 헤모글로빈의 수용체인 당화 헤모글로빈의 수용체와 유기전자전달 매개체를 공유결합시키는 단계를 포함하고, 상기 제2센서를 제작하는 단계는, 전극 표면 상에 전도성 단량체와 전극 촉매물질의 혼합물을 첨가하고, 전해중합하여 전도성 고분자 복합층을 전착시키는 단계, 상기 전도성 고분자 복합층의 작용기를 활성화시키는 단계, 및 상기 작용기가 활성화된 전도성 고분자 복합층 상에 유기전자전달 매개체를 공유결합시키는 단계를 포함하는, 당화 헤모글로빈과 헤모글로빈 동시 검출용 마이크로 플루이딕 듀얼 타입 센서의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 인체로부터 분리된 혈액 시료를 용혈시키거나 과산화수소를 처리하는 단계; 및 상기 용혈시키거나 과산화수소를 처리된 혈액 시료를 청구항 1에 따른 듀얼 타입의 센서 표면에 도입하여 과산화수소의 촉매 환원전류 또는 유기전자전달 매개체의 환원전류를 분석하는 단계를 포함하는, 헤모글로빈 및 당화 헤모글로빈의 동시 측정 전류식 검출방법을 제공한다.
본 발명은, 종래 사용해 오던 고성능 액체크로마토그래피(HPLC) 또는 임피던스 방법 등의 측정방법 대신 전류법을 사용함으로써, 혈액 시료 내의 헤모글로빈 및 당화 헤모글로빈의 농도를 빠르고 정확하게 측정할 수 있고, 헤모글로빈과 당화 헤모글로빈의 분리단계를 거치지 않고 동시에 두 물질의 농도를 측정하여 그 비율을 구할 수 있어, 현장 즉시형의 일회용 전류식 분석방법으로 당뇨병을 효과적으로 진단할 수 있다.
도 1(A)는 당화 헤모글로빈(제1센서), 헤모글로빈(제2센서), 및 당화 헤모글로빈과 헤모글로빈 동시 검출용 듀얼센서(제3센서) 제작 과정이며, 도 1(B)는 당화 헤모글로빈과 헤모글로빈의 동시 검출용 마이크로 플루이딕 듀얼 타입 센서의 모식도이다.
도 2(A)는 AuNPs/SPCE 상의 TTBA의 전해중합을 기록한 CV, 도 2(B)는 APBA/pTTBA/AuNPs/SPCE에 대해 기록한 CV, 도 2(C)는 APBA/pTTBA/AuNPs/SPCE 층 상에서 HbA1c의 캡처에 의한 과산화수소의 촉매적 환원전류에 대한 CV, 도 2(D)는 항체/TBO/pTTBA@MWCNT/SPCE 층 상에서 HbA1c의 캡처에 의한 전자전달 매개체의 촉매 환원전류 변화에 대해 기록한 CV, 도 2(E)는 주사속도에 따른 TBO의 산화/환원 전류 변화에 대한 선형곡선을 나타낸 도면이다.
도 3(A) 및 도 3(B)는 pTTBA/AuNPs, 및 APBA/pTTBA/AuNPs의 표면에 대한 N1s 및 B1s 피크에서 각각의 ESCA 분석 결과를 나타낸 것이며, 도 3(C)는 pTTBA/AuNPs 상에 APBA를 고정화 시 주파수 변화(실선)와, APBA/pTTBA/AuNPs 상에 HbA1c을 고정화 시 주파수 변화(점선)를 나타낸 도면이다.
도 4(A)는 HbA1c의 전류식 분석을 위한 온도 효과, 도 4(B)는 HbA1c의 전류식 분석을 위한 pH 효과, 도 4(C)는 HbA1c의 전류식 분석을 위한 과산화수소 농도 효과, 및 도 4(D)는 HbA1c의 전류식 분석을 위한 적용 전위 효과를 나타낸 도면이다.
도 5(A)는 보론산 유도체가 개질된 제1센서를 이용한 HbA1c의 선형 검량선을, 삽입도는 대시간 전류 반응을 나타낸 것이고, 도 5(B)는 항체/TBO가 개질된 경우의 HbA1c의 선형 검량선을 나타낸 것이며, 도 5(C)는 보론산 유도체가 개질된 제1센서를 이용하여 임피던스 분석을 통한 HbA1c의 선형 검량선을 나이키스트 선도(Nyquist plot)로 나타낸 도면이다.
도 6(A)는 시린지 필터(Syringe Filter)를 통해 분리된 혈장을 제거한 시료를 보론산 유도체가 개질된 제1센서를 이용한 전류식 분석 시의 당화 헤모글로빈 검출 검량선을 나타낸 것이고, 도 6(B)는 보론산 유도체가 개질된 제1센서를 이용하여 임피던스 분석을 통해 전처리하지 않은 전혈과 전처리한 시료의 나이키스트 선도(Nyquist plot)를 나타낸 것이고, 도 6(C)는 전처리한 시료에서 임피던스 분석 결과와 전류식 분석 결과를 비교한 것이다.
도 7(A)는 TBO/pTTBA@MWCNT/SPCE 전극의 제2센서 (헤모글로빈 센서부)를 이용하여 순환주사전압법으로 Hb의 전류 반응을 나타내 것이고, 도 7(B)는 상기 제2센서를 이용한 Hb의 선형 검량선을, 삽입도는 대시간 전류 반응을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 당화 헤모글로빈 검출용 제1센서 및 헤모글로빈 검출용 제2센서를 포함하며, 상기 제1센서는, 전극; 상기 전극 표면 상에 코팅된 금나노입자층; 상기 금나노입자층 상에 전착된 전도성 고분자 층; 및 상기 전도성 고분자 층 상에 공유결합된 당화 헤모글로빈의 수용체와 유기전자전달 매개체를 포함하고, 상기 제2센서는, 전극; 상기 전극 표면 상에 전착된 전도성 고분자 복합층; 및 상기 전도성 고분자 복합층 상에 공유결합된 유기전자전달 매개체를 포함하며, 상기 전도성 고분자 복합층은 전도성 고분자와 전극 촉매 물질로 이루어진 것이고, 상기 제1센서와 제2센서를 대향하여 배치한 듀얼 타입의 센서로 형성된 것을 특징으로 하는, 당화 헤모글로빈과 헤모글로빈 동시 검출용 마이크로 플루이딕 듀얼 타입 센서를 제공한다.
이때, 상기 전극은 스크린 프린트 카본 전극을 사용할 수 있지만, 전기화학을 기반으로 하는 센서 역할을 할 수 있는 전극이라면 특별히 제한되는 것은 아니다.
상기 전도성 고분자는 p-2,2':5',5"-터티오펜-3'-p-벤조산(p-TTBA), p-5,2':5.2"-터티오펜-3'-카르복실산(p-TTCA) 및 p-2.5-디-(2-티에닐)-1H-피롤-P-벤조산(p-DTPBA)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 당화 헤모글로빈의 수용체는 보론산 유도체, 항체, 또는 압타머 중에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 보론산 유도체는 당화 헤모글로빈과의 시스-다이올 결합에 의해 당화 헤모글로빈을 검출하는 당화 헤모글로빈의 수용체로서, 아미노-페닐보론산(APBA), 페닐 보로닉산(PBA), 티에닐 보로닉산(TBA) 및 메틸 보로닉산(MBA)로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, -B(OH)2 치환기를 가지는 것이라면 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 압타머(Aptamer)는 표적분자에 대해 특이적으로 결합하는 분자 인식 물질로서 항체와 비교할 때 표적분자에 대해 높은 친화성과 특이성을 가지기 때문에 유기전자전달 매개체와 복합체로 이루어져 당화 헤모글로빈에 특이적으로 결합할 수 있다.
구체적으로, 상기 압타머는 서열목록 1로 표시되는 염기서열(5′-AAA CCT GGT GTC TGG TGG GGG GGG GGC AGG CGG CGA GGA TTG CGG CGC TGC TAC ACA AAC AGA AGG AA-3′)일 수 있다.
상기 유기전자전달 매개체는 메틸렌 블루(methylene blue, MB) 또는 톨루이딘 블루(toluidine blue O, TBO)일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 유기전자전달 매개체는 항체 및 압타머와의 복합체를 형성하여 당화 헤모글로빈의 수용체로 사용할 수 있고, 상기 유기전자전달 매개체 단독으로 전도성 고분자 복합층에 공유결합하여 제작된 센서는 혈액 시료중의 총 헤모글로빈을 검출 할 수 있다. 따라서 상기 제1센서 및 제2센서가 결합된 듀얼 타입의 센서를 기반으로 측정된 총 헤모글로빈과 당화 헤모글로빈의 분리단계를 거치지 않고 동시에 두 물질의 농도를 측정하여 총 헤모글로빈에 대한 당화 헤모글로빈의 비율을 검출할 수 있다.
상기 전극 촉매 물질은 탄소나노튜브(CNT), 산화그래핀(GO), 산화그래핀 환원물(rGO) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 본 발명은 당화헤모글로빈을 검출하는 제1센서를 제작하는 단계; 헤모글로빈을 검출하는 제2센서를 제작하는 단계; 및 상기 당화헤모글로빈을 검출하는 제1센서와 헤모글로빈을 검출하는 제2센서를 대향하여 배치한 듀얼 타입의 센서를 제작하는 단계를 포함하며, 상기 제1센서를 제작하는 단계는, 전극 표면 상에 금나노입자 층을 코팅하는 단계, 상기 금나노입자 층 상에 전도성 단량체를 첨가하고, 전해중합하여 전도성 고분자 층을 전착시키는 단계, 상기 전도성 고분자 층의 작용기를 활성화시키는 단계, 및 상기 작용기가 활성화된 전도성 고분자 층 상에 당화 헤모글로빈의 수용체인 당화 헤모글로빈의 수용체와 유기전자전달 매개체를 공유결합시키는 단계를 포함하고, 상기 제2센서를 제작하는 단계는, 전극 표면 상에 전도성 단량체와 전극 촉매물질의 혼합물을 첨가하고, 전해중합하여 전도성 고분자 복합층을 전착시키는 단계, 상기 전도성 고분자 복합층의 작용기를 활성화시키는 단계, 및 상기 작용기가 활성화된 전도성 고분자 복합층 상에 유기전자전달 매개체를 공유결합시키는 단계를 포함하는, 당화 헤모글로빈과 헤모글로빈 동시 검출용 마이크로 플루이딕 듀얼 타입 센서의 제조방법 제공한다.
상기 전도성 단량체는 2,2':5',5"-터티오펜-3'-p-벤조산(TTBA), 5,2':5.2"-터티오펜-3'-카르복실산(TTCA) 및 2.5-디-(2-티에닐)-1H-피롤-P-벤조산(DTPBA)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 전도성 단량체는 우수한 전기전도도를 갖고 다양한 응용이 가능하며, 열적 안정성과 화학적 안정성이 우수하므로, 전도성 단량체를 통한 전도성 고분자 합성 시 센서의 성능 내지는 수명을 향상시킬 수 있는 장점이 있다.
상기 제1센서를 제조하는 과정에서, 금나노입자층 상에 형성된 전도성 고분자 층의 평균 두께는 민감성과 응답시간을 높이기 위한 중요한 요소이며, 상기 전도성 고분자 복합층의 평균 두께는 100 내지 300 nm일 수 있다.
상기 전도성 고분자 층의 평균 두께가 100 nm보다 얇을 경우 수용체의 결합 사이트의 결핍과 같은 문제점이 발생할 수 있으며, 또한 상기 전도성 고분자 층의 평균 두께가 300 nm보다 두꺼운 경우 전도성 저하로 인한 민감도 및 응답시간의 감소와 같은 문제점을 야기할 수 있는 바, 제1센서 및 제2센서에 이용되는 전도성 고분자 층 내지 전도성 고분자 복합층은 헤모글로빈 및 당화 헤모글로빈을 쉽게 흡착할 수 있게 하는 역할을 수행하므로 200 nm의 평균 두께를 가지는 전도성 전도성 고분자 층 내지 고분자 복합층을 합성하는 것이 보다 바람직하다.
상기 작용기는 카르복시기이며, 카르복시기를 활성화 시키는 방법은, 1-에틸-3-[3-(디메틸아미노)프로필]칼보디이미드 하이드로클로라이드 용액에 N-하이드록시석신이미드의 혼합물을 함유한 인산완충용액(Phosphate Buffered Saline:PBS)에 담구어 전도성 단량체의 카르복시기를 활성화시킬 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 인체로부터 분리된 혈액 시료를 용혈시키거나 과산화수소를 처리하는 단계; 및 상기 용혈시키거나 과산화수소를 처리된 혈액 시료를 청구항 1에 따른 듀얼 타입의 센서 표면에 도입하여 과산화수소의 촉매 환원전류 또는 유기전자전달 매개체의 환원전류를 분석하는 단계를 포함하는, 헤모글로빈 및 당화 헤모글로빈의 동시 측정 전류식 검출방법을 제공한다.
상기 혈액 시료는, 인체로부터 배출된 혈액을 필터 또는 원심분리를 통해 혈장이 분리된 적혈구를 용혈 시키거나, 전혈(Whole blood)을 용혈(Hemolysis) 시킬 수 있으나, 시린지 필터(Syringe Filter)를 통해 분리된 혈장을 제거한 후 남은 적혈구를 용혈 버퍼 (lysis buffer)를 이용하여 용혈 시키는 방법, 또는 보다 간단하게 전혈을 바로 용혈 버퍼를 이용하여 용혈 시킬 수 있는 방법이 있다.
상기 방법들은 기존의 원심분리를 통해 혈장을 분리한 적혈구 용혈 시키는 방법보다 복잡한 과정 없이도 간단히 인체로부터 배출된 혈액을 처리 할 수 있어 보다 바람직하며, 과산화수소를 이용한 간단한 전처리 과정을 통해 혈액 내 다른 당화 단백질 등에 의한 방해효과를 방지할 수 있으며, 신속하게 당화 헤모글로빈을 현장에서 분석을 할 수 있다.
상기 인체로부터 분리된 혈액 시료에 과산화수소를 처리 시 필요한 과산화수소의 농도는 2.0 내지 4.0 mM일 수 있으며, 2.0 mM에서 4.0 mM까지 과산화수소 농도가 점점 증가하면 점차적으로 피크 전류도 증가하는 바, 3.0 mM에서 안정된 상태에 도달 분리된 혈액 시료의 전처리시 필요한 과산화수소의 농도는 3.0 mM인 것이 보다 바람직하다.
상기 과산화수소 또는 유기전자전달 매개체의 환원전류 분석은 pH 7.0 내지 7.4 일 수 있으며, pH 7.0 이하 또는 pH 7.4 이상인 경우에는 당화 헤모글로빈의 활성 감소와 같은 문제점이 발생할 수 있는 바, 상기 pH 7.4에서 최대 전류 반응이 일어나므로 pH 7.4를 유지하는 것이 보다 바람직하다.
상기 과산화수소 또는 유기전자전달 매개체의 환원전류 분석은 25 내지 35℃의 온도일 수 있으며, 25℃ 이하인 경우에는 당화 헤모글로빈과 과산화수소 또는 유기전자전달 매개체간의 전자전달 속도 저하와 같은 문제점이 있고, 35℃ 이상의 온도에서는 당화 헤모글로빈의 열적 변성으로 인해 피크 전류가 감소하는 문제점이 발생하는 바, 바람직하게는 30℃의 온도를 유지하는 것이 보다 바람직하다.
상기 과산화수소 또는 유기전자전달 매개체의 환원전류 분석은 -0.50 V 내지 -0.3 V의 적용 전위에서 실행할 수 있으며, 적용 전위가 -0.3 V까지 감소하면 피크 전류가 증가하며 최대 반응이 -0.45 V에서 일어나기 때문에 -0.45 V 적용 전위에서 실행하는 것이 높은 민감도로 헤모글로빈 및 당화 헤모글로빈을 동시에 검출할 수 있다.
상기 과산화수소 또는 유기전자전달 매개체의 환원전류 분석은 시간대-전류법으로 분석할 수 있다.
이하, 하기 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 개질 전극 제작
1. 제1센서의 개질 전극 제작
(1) 전극 표면 상에 금나노입자층의 코팅(AuNPs/SPCE)
0.001% 염화금산(HAuClO4)을 함유한 0.5M 황산(H2SO4)용액을 1.5 V 전위에서 0.4V 전위로 일정속도 전위 훑음법(linear sweep voltammetry; 이하 'LSV')을 이용하여 스크린 프린트 카본 전극(SPCE) 상에 전기증착시켜 금나노입자(AuNPs)층을 코팅시켰다. 이때, 상기 전기증착 조건은 하기와 같다:
증착시간 60초, 주사속도 0.1 V/s, 증착전위 -0.6V, 3회 전위 주사.
(2) AuNPs/SPCE 상에 전도성 고분자 층의 형성(pTTBA/AuNPs/SPCE)
종래 알려진 방법(Biosens. Bioelectron. 2003, 18, 773-780, Biomaterials, 2010, 31, 7827-7835)에 따라 상기 AuNPs/SPCE 전극 상에 전해중합을 통해 pTTBA의 전도성 고분자 복합층을 형성시켰다. 보다 상세하게는, AuNPs/SPCE 전극을 먼저 TTBA가 함유된 용액 중에 침지시켰다. 이때, 상기 용액은 디(프로필렌글리콜)메틸에스테르와 트리(프로필렌글리콜) 메틸에스테르가 1:1 중량비로 혼합된 용액을 사용하였다. 그 후, 0.1 M의 인산완충용액(pH 7.4)에서, 0.1 V/s의 주사속도로 -0.1 V에서 1.1 V까지(Ag/AgCl) 3회 전위 주사를 함으로써 AuNPs/SPCE 전극 상에 pTTBA 전착시켜 pTTBA/AuNPs/SPCE 전극을 준비하였다.
(3) 전도성 고분자 층의 카르복실기 활성화 과정
상기 pTTBA/AuNPs/SPCE를 10.0 mM의 1-에틸-3-[3-(디메틸아미노)프로필]칼보디이미드 (1-Ethyl-3-[3-(dimethylamino)propyl]carbodiimide hydrochloride; EDC) 및 10.0 mM의 N-하이드록시석신이미드(N-hydroxysuccinimide; NHS) 혼합물을 함유한 0.1 M의 인산완충용액(pH 7.4)에 12시간 동안 담구어 pTTBA의 카르복시기를 활성화시킨 후 인산완충용액으로 세정하였다.
(4) 활성화된 카르복실기와 보론산 유도체와의 공유결합을 통한 제1센서 개질 전극 제작
보론산 유도체를 이용한 제1센서의 제작은, pTTBA/AuNPs/SPCE 전극을 40℃ 온도조건에서 12시간 동안 10.0 mM의 3-아미노페닐보로닉산(3-aminophenylboronic acid; APBA) 용액에서 반응시켜 제1센서 개질 전극을 제작하였다.
또한, pTTBA/AuNPs/SPCE 전극 상에 TBO와 항체(Abcam, UK; ab31152) 또는 5′-AAA CCT GGT GTC TGG TGG GGG GGG GGC AGG CGG CGA GGA TTG CGG CGC TGC TAC ACA AAC AGA AGG AA-3′의 염기서열을 갖는 압타머를 동시에 공유 결합시켜 제1센서의 개질 전극을 제작하였다.
최종적으로, TTBA의 카르복시기와 보론산 유도체, 항체/TBO의 아민기, 또는 압타머/TBO의 아민기 간의 공유결합을 통한 개질 전극(APBA/pTTBA/AuNPs/SPCE, 압타머-TBO/AuNPs/SPCE, 항체-TBO/AuNPs/SPCE를 준비하였다.
2. 제2센서의 개질 전극 제작
(1) 전극 표면 상에 탄소나노튜브와 전도성 고분자 단량체의 혼합물의 코팅
다중벽 탄소나노튜브(MWCNT)를 계면활성제(0.5 % triton X 100) 용액에 분산시켰고, 전도성 고분자 단량체인 TTBA는 아세토나이트릴 용액에 용해시켜 각각의 용액을 준비하였다. 상기 두 용액을 혼합하여 탄소나노튜브와 전도성 고분자 단량체(TTBA@MWCNT) 혼합 용액을 준비하였고, 상기 혼합 용액을 SPCE 위에 코팅하였다.
(2) TTBA@MWCNT 전극 상에 전도성 고분자 복합층의 형성
TTBA@MWCNT/SPCE가 코팅된 전극을 0.1 M의 인산완충용액(pH 7.4)에서 0.1 V/s의 주사속도로 -0.1에서 1.1V까지(Ag/AgCl) 3회 전위 주사를 함으로써 제2센서 제작을 위한 탄소나노튜브와 전도성 고분자(pTTBA@MWCNT/SPCE)의 복합층이 형성되었다.
(3) 전도성 고분자 층의 카르복실기 활성화 과정
pTTBA@MWCNT/SPCE 전극을, 10.0 mM의 1-에틸-3-[3-(디메틸아미노)프로필]칼보디이미드 (1-Ethyl-3-[3-(dimethylamino)propyl]carbodiimide hydrochloride; EDC) 및 10.0 mM의 N-하이드록시석신이미드(N-hydroxysuccinimide; NHS) 혼합물을 함유한 0.1 M의 인산완충용액(pH 7.4)에 12시간 동안 담구어 pTTBA의 카르복시기를 활성화시킨 후 인산완충용액으로 세정하였다.
(4) 활성화된 카르복실기와 TBO와의 공유결합을 통한 제2센서 개질 전극 제작
pTTBA@MWCNT/SPCE 전극 상에 TBO를 공유결합 시켜 제2센서 개질 전극을 제작(TBO/pTTBA@MWCNT/SPCE)하였다.
3. 당화 헤모글로빈과 헤모글로빈 동시 검출용 마이크로 플루이딕 듀얼 타입의 센서 제작
상기 준비된 제1센서 및 제2센서를 대향하여 배치함으로써 당화 헤모글로빈과 헤모글로빈 동시 검출용 마이크로 플루이딕 듀얼 타입의 센서를 제작하였다.
<실시예 2> 전기화학적 분석
1. 전기화학적 분석 방법
전기화학적 분석은 일체형 SPCE를 사용하여 3전극셀 반응계에서 수행되었다. 즉, 개질 된 SPCE가 작동전극(면적: 0.07 cm2)을 이루었고, 표준전극으로 Ag/AgCl 및 반대전극으로 카본을 각각 사용하였다. SPCE는 스크린 프린터(BANDO industrial, Korea)를 이용하여 폴리스티렌계 필름 상에 프린트 되었다.
순환 전압전류(cyclic voltammogram; 이하 'CV')는 Potentiostat/Galvanostat(모델: KST-P2, Kosentech)를 이용하여 측정하였으며, LSV는 Kosentech Model PT-1를 이용하여 측정하였고, 전류분석은 EG & G PAR Model PAR 273A를 이용하여 측정하였다. 모든 전기화학적 측정은 0.1M의 인산완충용액(pH 7.4)에서 수행되었다.
미세 진동 저울 분석(Quartz Crystal Microbalance analysis; 이하 'QCM')은 SEIKO EG&G 모델 QCA 917 및 PAR 모델 263A potentiostat/galvanostat로 수행하였으며, QCM 분석을 위하여 Au 작동전극(면적: 0.196 cm-2; 9 MHz; AT-cut quartz crystal)을 이용하였다. 임피던스 분석은 계단 당 5포인트의 샘플링 속도에서 100 kHz에서 50 mHz까지 개방전압에서 EG&G Princeton Applied Research PARSTAT 2263을 이용하여 측정하였다(AC 진폭: 10 mV). X선 광전자 분광 분석(X-ray photoelectron spectroscopy analysis; 이하 'XPS')은 VG Scientific Escalab 250 XPS 분광계[단색화된 Al Kα 광원 (KBSI Busan, Korea)]를 이용하여 수행하였다.
2. 전기화학적 분석 결과
(1) APBA 개질 pTTBA의 전기화학적 특성
도 2(A)를 참조하면, AuNPs/SPCE 상의 TTBA의 전해중합을 기록한 CV를 나타낸 것으로서, pTTBA 층은 단량체가 적가된 AuNPs/SPCE 표면의 양극 전해중합을 통해 형성되었다. -0.2 V에서 1.0 V의 제1 양극 주사에서 약 0.7 V에서의 산화피크는 단량체 산화를 통한 고분자 형성을 의미하며, AuNPs의 다른 산화환원 피크는 0.57 V/0.15 V에서 관찰되었다. 전해중합 후, APBA 또는 항체-TBO (또는 압타머-TBO)는 pTTBA/AuNP/SPCE 층에 각각 고정되었다.
도 2(B)를 참조하면, APBA/pTTBA/AuNPs/SPCE에 대해 기록한 CV를 나타낸 것으로서, APBA가 없는 pTTBA/AuNPs/SPCE의 CV에서는 어떠한 산화환원 피크도 관찰되지 않았지만, APBA가 개질된 경우에서는 0.076 V/0.107 V에서 한쌍의 산화환원 피크가 관찰되었다. 도 2(C)는 HbA1c의 캡처에 의한 과산화수소 농도에 따른 촉매적 환원전류 변화에 대해 기록한 CV를 나타낸 것이고, APBA 상에 캡처된 HbA1c의 헴기에 의한 산화환원 공정에 의해 -0.34 V/-0.16 V에서 한 쌍의 산화환원 피크가 나타났다. 이때 과산화수소 농도를 1 mM에서 5 mM로 증가시킬 경우 -0.34 V에서 환원전류가 증가하는 것을 확인하였다.
도 2(D)를 참조하면, 항체-TBO/pTTBA/AuNPs/SPCE층 상에서 항체에 HbA1c의 캡처에 의한 TBO의 환원전류 변화에 대해 기록한 CV를 나타낸 것이다. 유기전자전달 매개체인 TBO의 산화환원 피크는 -0.31 V/-0.26 V 에서 관찰되었다. 항체에 결합된 HbA1c의 농도가 증가함에 따라 TBO의 환원전류 크기가 증가하는 확인하였다. 이러한 결과로부터, APBA 또는 항체-TBO가 pTTBA/AuNP/SPCE 층에 성공적으로 고정되었음을 알 수 있다.
또한, TBO/pTTBA@MWCNT/SPCE층 상에서 주사 속도 변화에 대한 TBO의 환원 전류 크기의 변화에 대해 측정한 결과를 도 2(E)에 나타내었다. 주사 속도 증가에 따라 TBO의 산화/환원 전류 크기와 비례하며, 이는 전극의 흡착종에 의한 현상임을 알 수 있다. Laviron 식을 이용한 TBO의 전자전달 속도 ks 값은 2.17 sec-1이었다.
따라서, 상기 두 가지 타입의 제1센서에 결합된 당화 헤모글로빈의 농도에 의해 과산화수소의 촉매적 환원전류 또는 TBO의 환원전류 크기가 증가하는 것을 알 수 있다. 이들 제1센서에 결합된 당화 헤모글로빈의 농도에 따른 전류 변화 분석을 통해 HbA1c검출이 가능함을 확인하였다.
(2) APBA 개질 전극에서의 XPS 및 QCM 분석 결과
APBA 개질 pTTBA 층에서의 화학적 결합을 규명하기 위하여, pTTBA/AuNPs 및 APBA/pTTBA/AuNPs의 표면에 대한 N1s(도 3(A) 참조) 및 B1s(도 3(B) 참조) 피크에서 ESCA 분석을 수행한 결과, N1s 스펙트럼에서는 APBA 고정 후 399.4 eV 근처에서 분명한 피크가 나타난 반면, pTTBA/AuNPs 층은 분자 내에 질소 원자가 존재하지 않아 어떠한 피크도 나타나지 않았다. 또한, B1s 스펙트럼은 191.2 eV에서 피크가 나타났으며, C-B 결합에 대응한다. 이러한 결과로부터 APBA는 pTTBA 층에 성공적으로 고정화 되었음을 알 수 있다.
도 3(C)를 참조하면, pTTBA/AuNPs 상에 APBA를 고정화 시 주파수 변화(실선)와, APBA/pTTBA/AuNPs 상에 HbA1c을 고정화 시 주파수 변화(점선)를 나타낸 것으로서, pTTBA/AuNPs 상에 APBA를 고정화 시킨 경우에는 느린 APBA 고정화로 인하여 약 2시간 정도 되어야 안정한 상태가 되며, 총 주파수 변화(△f)는 78.4 Hz이고, 86.17 ng의 질량 증가에 대응하며, APBA의 표면 범주는 2.86 x 10- 9 mol/cm2으로 산출되었다. 그러나, APBA를 갖는 탐침을 이용한 주파수 변화는 1.0% HbA1c를 함유한 용액에서 HbA1c-APBA 간의 상호작용에 의해 재빠르게 일어났다. 즉, 약 20분 후 103.11 Hz의 주파수 변화를 나타내면서 안정한 상태를 유지하였다. 이러한 주파수 변화는 113.34 ng의 질량 변화를 나타내며, HbA1c 표면 범주는 1.03 x 10- 10 mol/cm2으로 산출되었다. 도 3(C)를 참조하면, HbA1c-APBA 간의 상호작용을 위한 시간이 매우 짧아 HbA1c 검출에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
(3) HbA1c의 전류식 분석
APBA 또는 항체-TBO가 개질된 센서를 이용한 HbA1c의 전류식 분석을 위한 최적 조건 규명을 위하여, AuNPs가 코팅된 SPCE 위에 전도성 고분자인 TTBA을 전기화학적인 방법을 이용하여 전착시키고, 카르복시기를 가지는 TTBA에 아민기를 가지는 당화 헤모글로빈의 수용체인 APBA 또는 항체-TBO를 공유결합 시켜 제1센서를 각각 제작하였고, 상기 각 센서에 결합된 당화 헤모글로빈에 의한 과산화수소 촉매의 환원전류 또는 유기전자전달 매개체의 환원전류를 시간대-전류법으로 모니터링하여 당화 헤모글로빈의 농도를 정량 분석하여 온도, pH, 과산화수소 농도 및 적용 전위를 변화시켜 조사하였다.
APBA 또는 항체-TBO가 개질된 센서를 이용한 HbA1c의 전류식 분석을 위한 최적 조건 규명을 위하여, AuNPs가 코팅된 SPCE 위에 전도성 고분자인 TTBA을 전기화학적인 방법을 이용하여 전착시키고, 카르복시기를 가지는 TTBA에 아민기를 가지는 당화 헤모글로빈의 수용체인 APBA 또는 항체-TBO를 공유결합 시켜 제작된 제1센서 및 pTTBA@MWCNT/SPCE 전극 상에 TBO를 공유결합 시켜 제작된 제2센서를 각각 제작하였고, 상기 각 센서에 결합된 당화 헤모글로빈에 의한 과산화수소 촉매의 환원전류 또는 유기전자전달 매개체의 환원전류를 시간대-전류법으로 모니터링하여 헤모글로빈 및 당화 헤모글로빈의 농도를 정량 분석하여 온도, pH, 과산화수소 농도 및 적용 전위를 변화시켜 조사하였다.
도 4(A)를 참조하면, HbA1c의 전류식 분석을 위한 온도 효과를 나타낸 것으로서, 10℃에서 30℃까지는 온도가 올라가면 점차적으로 피크 전류도 증가하였으나, 35℃ 이상의 온도에서는 당화 헤모글로빈(HbA1c)의 열적 변성으로 인해 피크 전류가 감소하였기 때문에, 최적 온도를 30℃로 정하였다.
도 4(B)를 참조하면, 당화 헤모글로빈(HbA1c)의 전류식 분석을 위한 pH 효과를 나타낸 것으로서, pH 5.8에서 7.4까지는 pH가 증가하면 점차적으로 피크 전류도 증가하였으나, pH 7.4에서 최대 전류 반응이 관찰되었기 때문에, 최적 pH를 생체 pH인 7.4 로 정하였다.
도 4(C)를 참조하면, HbA1c의 전류식 분석을 위한 과산화수소 농도 효과를 나타낸 것으로서, 과산화수소 농도를 1.0 mM에서 5.0 mM까지 과산화수소 농도가 점점 증가하면 점차적으로 피크 전류도 증가하였으며, 3.0 mM에서 안정된 상태에 도달하였기 때문에, 최적 과산화수소 농도를 3.0 mM 정하였다.
도 4(D)를 참조하면, 당화 헤모글로빈(HbA1c)의 전류식 분석을 위한 적용 전위 효과를 나타낸 것으로서, 적용 전위가 -0.3 V까지 감소하면 피크 전류가 증가하였고, 최대 반응이 -0.45 V에서 관찰되었기 때문에, 최적 적용 전위를 -0.45 V로 정하였다.
앞서 규명된 최적 분석 조건 하에서 APBA/pTTBA/AuNPs/SPCE 또는 항체-TBO/pTTBA/AuNPs/SPCE를 이용하여 HbA1c의 전류식 분석을 수행하였다. 즉, APBA/pTTBA/AuNP/SPCE 또는 항체-TBO/pTTBA/AuNPs/SPCE를 다양한 농도의 HbA1c 함유 용액 중에서 2분 동안 반응시킨 후, 0.1 M의 인산완충용액으로 세정하였다. 이때, 보론산 유도체가 개질된 제1센서를 이용한 과산화수소의 환원에 대한 전류 분석은 3.0 mM의 과산화수소가 함유된 0.1 M의 인산완충용액(pH 7.4)에서 기록되었고, 항체-TBO가 개질된 센서의 경우, TBO의 환원전류 분석은 0.1 M의 인산완충용액(pH 7.4)에서 기록되었다.
도 5(A) 및 도 5(B)를 참조하면, 보론산 유도체 또는 항체-TBO가 개질된 두 가지 타입의 제1센서를 이용하여 HbA1c의 선형 검량선을, 삽입도는 대시간 전류 반응을 나타낸 것으로서, 포획된 HbA1c의 농도가 증가할수록 과산화수소 또는 전자전달 매개체의 환원전류가 특이적으로 HbA1c에 의해 촉진되어 촉매적 환원전류가 증가하였다. HbA1c 검출을 위한 전기화학적 촉매적 반응은 0.1 내지 1.5%에서 선형으로 나타났으며, HbA1c 검출한계는 0.052 ± 0.02%로 확인되었다. 반면, 항체-TBO가 개질된 제1센서의 경우 2.5 내지 12%에서 선형으로 나타났다. 이들 제1센서는 4℃에서 한달동안 HbA1c의 검출 반응 효과를 92% 이상 유지할 수 있었다.
결론적으로, 당화 헤모글로빈의 측정하여 검출하는 제1센서의 감응에 영향을 미치는 과산화수소 농도는 3.0 mM, 온도는 30 ℃, pH는 7.4, 측정 전압은 -0.45 V로 최적화 되었고, 최적화 된 조건에서 HbA1c의 직선 감응 농도 범위는 1 내지 15%이고 검출한계는 0.52 ± 0.2% 이었다.
(4) HbA1c의 임피던스 검출
임피던스 분석을 위해 개방회로전압에서 APBA/pTTBA/AuNPs/SPCE의 특성과 HbA1c의 분석을 수행하여 전류식 분석 결과와 비교하였다. 먼저, 임피던스 분석 전에 APBA/pTTBA/AuNPs/SPCE를 다양한 농도의 HbA1c 함유 용액 중에서 5분 동안 반응시킨 후, 0.1 M의 인산완충용액으로 세정하였다. 제1센서 표면에서 발생한 HbA1c-APBA 상호작용은 계면특성의 변화를 야기하여 임피던스 반응이 일어나게 하는데, HbA1c의 농도가 증가함에 따라 임피던스가 증가하였다.
도 5(B)를 참조하면, HbA1c의 선형 검량선을, 삽입도는 나이키스트 선도(Nyquist plot)를 나타낸 것으로서, 포획된 HbA1c은 0.5 내지 6.0%의 범주에서 선형을 나타내었고, 검출한계는 0.27%로 나타나 앞선 전류식 분석에 비해 검출 민감도가 낮은 것으로 확인되었다.
(5) Hb의 전류식 검출
전류 측정식의 헤모글로빈 센서는 TBO/pTTBA@MWCNT/AuNPs/SPCE를 사용하였다 (도 7 참조). 헤모글로빈의 농도가 증가함에 따라 전자전달 매개체인 TBO의 환원전류가 증가하는 것을 확인하였다. 또한 도 7(B)는 상기 센서를 이용하여 Hb의 선형 검량선을, 삽입도는 대시간 전류 반응을 나타낸 것이다. Hb 선형농도는 0.1 내지 10 μM에서 선형으로 나타났다. 본 발명에서 제안하는 당화 헤모글로빈을 검출하는 제1센서와 헤모글로빈 및 당화 헤모글로빈을 동시 검출하는 듀얼 타입의 제2센서를 이용하여 헤모글로빈과 당화 헤모글로빈 농도를 측정하여 두 검출물질의 농도비를 계산하여 보다 정밀한 당화 헤모글로빈의 농도를 유추할 수 있었다.
특히, 본 발명에 따른 헤모글로빈 및 당화 헤모글로빈 검출방법인 시간대-전류법을 이용하여 실제 사람의 혈액에 대해서 헤모글로빈 및 당화 헤모글로빈을 검출한 결과와 기존의 분석법인 HPLC, 임피던스로 분석한 결과를 비교 평가하면, 본 발명에 따른 시간대-전류법을 통하여 간편하고 안전하며 보다 민감하게 당화 헤모글로빈을 검출할 수 있어, 당뇨병의 현장 진단을 위한 일회용 전류식 당화 헤모글로빈 검출에 유용하게 사용될 수 있다.
<실시예 3> 실제 시료 분석
1. 혈액 시료 전처리
부산대학 병원에서 확보된 3명의 건강한 지원자와 2명의 당뇨병 환자의 혈액 시료에서 본 발명에 따른 센서를 이용하여 HbA1c의 농도를 측정하였다. 필터법과 원심분리법을 이용하여 혈액을 전처리한 후, 표준물첨가법을 수행하였다.
인간 전혈은 원심 분리법 또는 시린지 여과법을 이용하여 전처리하였다. 먼저, 원심 분리법은 2 mL의 전혈을 4℃, 3,000 rpm에서 10분 동안 원심분리 하여 상등액으로 혈장을 분리하였다. 상기 혈장을 폐기하여 포도당 및 다른 당화 단백질과 분자들을 제거하였다. 남아있는 적혈구 세포는 생리학적 식염수(0.9% NaCl 용액)으로 3회 세정하여 완전하게 혈장을 제거하였다. 이렇게 세정된 적혈구 세포(0.5 mL)에 0.5 mL의 용혈 완충액(26 mM NaH2PO4, 7.4 mM, Na2HPO4 및 13.5 mM KCN 포함)을 첨가하여 적혈구를 용혈시켰다. 이렇게 얻어진 시료를 0.1M의 인산완충용액(pH 7.4)으로 10배 희석하여 전류식 측정을 수행하였다.
한편, 보론산 유도체가 개질된 제1센서를 이용한 당화 헤모글로빈 분석을 위해 시린지 필터를 사용한 여과법은 손가락 단자에서 얻은 2 ㎕의 전혈을 시린지 필터(기공크기: 0.45 ㎛)상에 모은 후, 혈장을 제거하였다. 그 후, 필터 상에 얻어진 적혈구 세포는 0.9% NaCl 용액으로 3회 세정하였다. 상기 적혈구 세포에 18 ㎕의 용혈 완충액을 첨가하여 필터페이지 상에 헤모글로빈이 용출되었고, 15분 후 임피던스 및 전류 측정을 각각 수행하였다.
또 다른 타입의 항체-TBO가 개질된 제1센서의 경우는 상기 방법보다 더욱 간편한 방법으로 혈액의 전처리가 가능하다. 인체의 손가락에서 배출된 1 ㎕의 전혈을 10 ㎕ 용혈 완충액으로 용혈 시키고 0.1 M의 인산완충용액(pH 7.4)로 400 배 희석하여 전류식 측정을 수행하였다.
2. 방해효과
보론산 유도체가 개질된 제1센서의 경우, 전처리 하지 않은 포도당, 당화 알부민, 다른 당화 단백질 등을 포함한 전혈과, 전혈을 시린지 필터나 원심분리를 통해 전처리한 시료를 이용하여 HbA1c의 분석을 통해 방해효과를 검토하였다.
지금까지는 전혈 중 포도당 등 방해인자로 인해 전류식으로는 HbA1c의 농도를 검출할 수 없었으나, 본 발명과 같이 시린지 필터한 시료를 이용하여 도 6(A)와 같이 전류식 분석을 통해 4.72 ± 0.12%로 HbA1c를 검출하였고, 도 6(B)와 같이 임피던스 분석을 통해 전처리 하지 않은 전혈은 430.6 kΩ, 전처리 한 시료는 230.7 kΩ의 △Rp 값을 나타내었다. 반면 다른 타입의 항체-TBO를 이용한 제1센서의 경우에는 HbA1c만 특이적으로 반응함으로 다른 방해효과 없다. 따라서 항체-TBO가 개질된 제1센서를 사용할 경우 간단한 혈액의 전처리 방법으로 당화 헤모글로빈을 검출 할 수 있다.
도 6(C)를 참조하면, 전처리한 시료에서 임피던스 분석 결과와 전류식 분석 결과가 일치함을 나타내었다.
3. 실제 시료 분석
표 1은 본 발명을 통해 개발된 제1센서 및 제2센서와 기존의 분석법인 HPLC를 이용한 실제 혈액에서의 HbA1c의 농도 결과를 비교한 자료에 대한 검량선을 나타낸 것으로서, 당뇨병 환자는 5.64 ± 0.09%, 7.76 ± 0.04%, 건강한 지원자는 5.18 ± 0.02%, 5.38 ± 0.05%, 및 4.72 ± 0.12% 로 각각 나타났으며, 원심분리를 통한 건강한 지원자의 HbA1c의 농도 분석 결과인 5.26 ± 0.03%, 5.41 ± 0.09%, 및 4.92 ± 0.08%과 거의 일치하였다. 그리고, 당뇨병 환자를 위해 현재 병원에서 사용하는 HPLC 실험을 통해 얻어진 HbA1c의 농도가 5.7%, 및 7.5%로 본 발명을 통해 개발된 센서를 이용한 결과와 일치하였다.
본 발명에 의한 혈액 전처리 방법을 이용한 HbA1C 농도(%) 기존의 혈액 전처리 방법을 이용한 HbA1C 농도(%)
정상인 혈액 샘플 5.2 5.3
5.4 5.4
4.7 4.9
전류식 분석법을 통한 HbA1C 농도(%) HPLC 분석을 통한 HbA1C 농도(%)
환자 혈액 샘플 5.6 5.7
7.8 7.5
이상과 같이, 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 이것에 의해 한정되지 않으며 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술 사상과 아래에 기재될 청구범위의 균등 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능함은 물론이다.

Claims (15)

  1. 당화 헤모글로빈 검출용 제1센서 및 헤모글로빈 검출용 제2센서를 포함하며,
    상기 제1센서는, 전극; 상기 전극 표면 상에 코팅된 금나노입자층; 상기 금나노입자층 상에 전착된 전도성 고분자 층; 및 상기 전도성 고분자 층 상에 공유결합된 당화 헤모글로빈의 수용체와 유기전자전달 매개체를 포함하고,
    상기 제2센서는, 전극; 상기 전극 표면 상에 전착된 전도성 고분자 복합층; 및 상기 전도성 고분자 복합층 상에 공유결합된 유기전자전달 매개체를 포함하며, 상기 전도성 고분자 복합층은 전도성 고분자와 전극 촉매 물질로 이루어진 것이고,
    상기 제1센서와 제2센서를 대향하여 배치한 듀얼 타입의 센서로 형성된 것을 특징으로 하는, 당화 헤모글로빈과 헤모글로빈 동시 검출용 마이크로 플루이딕 듀얼 타입 센서.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 전도성 고분자는,
    p-2,2':5',5"-터티오펜-3'-p-벤조산(p-TTBA), p-5,2':5.2"-터티오펜-3'-카르복실산(p-TTCA) 및 p-2.5-디-(2-티에닐)-1H-피롤-P-벤조산(p-DTPBA)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 당화 헤모글로빈과 헤모글로빈 동시 검출용 마이크로 플루이딕 듀얼 타입 센서.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 당화 헤모글로빈의 수용체는,
    보론산 유도체, 항체, 또는 압타머 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 당화 헤모글로빈과 헤모글로빈 동시 검출용 마이크로 플루이딕 듀얼 타입 센서.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 보론산 유도체는,
    아미노-페닐보론산(APBA), 페닐 보로닉산(PBA), 티에닐 보로닉산(TBA) 및 메틸 보로닉산(MBA)으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는, 당화 헤모글로빈과 헤모글로빈 동시 검출용 마이크로 플루이딕 듀얼 타입 센서.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 압타머는,
    서열번호 1로 표시되는 염기서열인 것을 특징으로 하는, 당화 헤모글로빈과 헤모글로빈 동시 검출용 마이크로 플루이딕 듀얼 타입 센서.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 유기전자전달 매개체는,
    메틸렌 블루(methylene blue, MB) 또는 톨루이딘 블루(toluidine blue O, TBO)중 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 당화 헤모글로빈과 헤모글로빈 동시 검출용 마이크로 플루이딕 듀얼 타입 센서.
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 전극 촉매 물질은,
    탄소나노튜브(CNT), 산화그래핀(GO), 산화그래핀 환원물(rGO) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는, 당화 헤모글로빈과 헤모글로빈 동시 검출용 마이크로 플루이딕 듀얼 타입 센서.
  8. 당화헤모글로빈을 검출하는 제1센서를 제작하는 단계;
    헤모글로빈을 검출하는 제2센서를 제작하는 단계; 및
    상기 당화헤모글로빈을 검출하는 제1센서와 헤모글로빈을 검출하는 제2센서를 대향하여 배치한 듀얼 타입의 센서를 제작하는 단계를 포함하며,
    상기 제1센서를 제작하는 단계는, 전극 표면 상에 금나노입자 층을 코팅하는 단계, 상기 금나노입자 층 상에 전도성 단량체를 첨가하고, 전해중합하여 전도성 고분자 층을 전착시키는 단계, 상기 전도성 고분자 층의 작용기를 활성화시키는 단계, 및 상기 작용기가 활성화된 전도성 고분자 층 상에 당화 헤모글로빈의 수용체인 당화 헤모글로빈의 수용체와 유기전자전달 매개체를 공유결합시키는 단계를 포함하고,
    상기 제2센서를 제작하는 단계는, 전극 표면 상에 전도성 단량체와 전극 촉매물질의 혼합물을 첨가하고, 전해중합하여 전도성 고분자 복합층을 전착시키는 단계, 상기 전도성 고분자 복합층의 작용기를 활성화시키는 단계, 및 상기 작용기가 활성화된 전도성 고분자 복합층 상에 유기전자전달 매개체를 공유결합시키는 단계를 포함하는, 당화 헤모글로빈과 헤모글로빈 동시 검출용 마이크로 플루이딕 듀얼 타입 센서의 제조방법.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 전도성 단량체는,
    2,2':5',5"-터티오펜-3'-p-벤조산(TTBA), 5,2':5.2"-터티오펜-3'-카르복실산(TTCA) 및 2.5-디-(2-티에닐)-1H-피롤-P-벤조산(DTPBA)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 당화 헤모글로빈과 헤모글로빈 동시 검출용 마이크로 플루이딕 듀얼 타입 센서의 제조방법.
  10. 청구항 8에 있어서,
    상기 작용기는,
    카르복시기인 것을 특징으로 하는, 당화 헤모글로빈과 헤모글로빈 동시 검출용 마이크로 플루이딕 듀얼 타입 센서의 제조방법.
  11. 인체로부터 분리된 혈액 시료를 용혈시키거나 과산화수소를 처리하는 단계; 및
    상기 용혈시키거나 과산화수소를 처리된 혈액 시료를 청구항 1에 따른 듀얼 타입의 센서 표면에 도입하여 과산화수소의 촉매 환원전류 또는 유기전자전달 매개체의 환원전류를 분석하는 단계를 포함하는, 헤모글로빈 및 당화 헤모글로빈의 동시 측정 전류식 검출방법.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 혈액 시료를 용혈시키는 단계는,
    인체로부터 배출된 혈액을 시린지 필터를 통해 혈장을 분리한 적혈구를 용혈시키거나, 또는 전혈을 용혈시킨 것을 특징으로 하는, 헤모글로빈 및 당화 헤모글로빈의 동시 측정 전류식 검출방법.
  13. 청구항 11에 있어서,
    상기 과산화수소의 농도는,
    2.0 내지 4.0 mM인 것을 특징으로 하는, 헤모글로빈 및 당화 헤모글로빈의 동시 측정 전류식 검출방법.
  14. 청구항 11에 있어서,
    상기 과산화수소 또는 유기전자전달 매개체의 환원전류 분석은,
    pH 7.0 내지 7.4, 25 내지 35℃의 온도 및 -0.50 내지 -0.3 V의 적용 전위에서 수행한 것을 특징으로 하는, 헤모글로빈 및 당화 헤모글로빈의 동시 측정 전류식 검출방법.
  15. 청구항 11에 있어서,
    상기 과산화수소 또는 유기전자전달 매개체의 환원전류 분석은,
    시간대-전류법으로 분석하는 것을 특징으로 하는, 헤모글로빈 및 당화 헤모글로빈의 동시 측정 전류식 검출방법.
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