KR101338168B1 - 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물의 전기촉매현상을 이용한 전기화학 바이오 센서, 이의 제조방법 및 센싱방법 - Google Patents

전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물의 전기촉매현상을 이용한 전기화학 바이오 센서, 이의 제조방법 및 센싱방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물의 전기촉매현상을 이용한 전기화학 바이오 센서, 이의 제조방법 및 센싱방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물의 전기촉매현상을 이용한 전기화학 바이오 센서는 기존의 바이오 센서보다 우수한 선택성, 민감도 및 경제성을 제공한다. 또한 물질간의 결합에 따른 광학적 특성 변화를 유도하기 위한 염료(dye)가 필요하고, 표적 물질 또는 프로브 물질을 염료로 표지화(labeling)시켜야 하는 공정상의 필요가 있는 광학적 방식에 비해, 전기화학적 방식을 이용하여 센싱을 하는 본 발명은 경제성에 있어서 우수한 효과를 제공한다.

Description

전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물의 전기촉매현상을 이용한 전기화학 바이오 센서, 이의 제조방법 및 센싱방법 {Bio senser using electrocatalytic activity of electrochemically reduced graphene oxide, method for preparing the same, and sensing method thereof}
본 발명은 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물의 전기촉매현상을 이용한 전기화학 바이오 센서, 이의 제조방법, 및 센싱방법에 관한 것이다.
클락형(Clack-type) 포도당 센서의 출현 이후로, 전기화학적 바이오 센서는 그 선택성, 간단성, 민감도, 및 경제성 때문에 질병의 진단, 음식의 분석, 환경의 관찰 및 분석의 분야에서 우수한 분석 기술로 발전되어 왔다. 게다가 다른 바이오 센서에 비해서 그 성능의 저하가 없이도 소형화를 할 수 있다는 장점이 있다. 새로운 바이오 센서의 플랫폼과 새로운 전략을 이용하여 전기화학적 바이오 센서의 민감도와 선택성 등을 더욱 발달시키기 위한 연구가 진행되고 있다. 그 중에서도 그래핀을 이용한 바이오 센서의 플랫폼에 대한 관심이 높아지고 있다.
그래핀(graphene)은 탄소원자가 2차원(2D) 격자 내로 채워진 평면 단일층 구조를 의미하며, 이것은 모든 다른 차원구조의 흑연(graphite) 물질의 기본 구조를 이룬다. 즉, 상기 그래핀은 0차원 구조인 풀러린(fullerene), 1차원 구조인 나노튜브 또는 3차원 구조로 적층된 흑연의 기본 구조가 될 수 있다. 2004년 Novoselev 등은 SiO2/Si 기판의 상부 상에서 프리-스탠딩 그래핀 단일층을 수득하였다고 보고하였으며, 이것은 기계적인 미세 분할법에 의하여 실험적으로 발견되었다. 최근 많은 연구그룹들이 그래핀이 갖는 허니콤(벌집)형태의 결정 구조, 두 개의 상호침투하는 삼각 형태의 하위 격자 구조, 및 하나의 원자 크기에 해당하는 두께 등에 의하여 그래핀이 특이한 물리적 특성(예를 들면 제로 밴드갭)을 보이는 점에 주목하고 있다. 또한 그래핀은 특이한 전하 운송 특성을 갖는데, 이로 인하여 그래핀은 종래에는 관찰되지 않았던 독특한 현상을 보여준다. 예를 들면, 반정수 양자 홀 효과 및 바이폴라 초전류 트랜지스터 효과 등이 그 예이며, 이 또한 상기 설명한 그래핀의 특유한 구조에 기인하는 것으로 여겨진다.
그래핀 산화물(Graphene Oxide, GO)과 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물(Electrochemically Reduced Graphene Oxide, ERGO)은 바이오 센서의 구성물, 세포 이미징(cellular imaging), 약물 전달 등에 있어서 활용 가능성이 높은 물질로 알려져 있다. 이들은 기존의 그라파이트보다 매우 큰 표면적을 가지며, 높은 전기전도도 및 강력한 기계적 강도를 가진다. 또한 부서지기 쉬운 그라파이트보다 유연하여, 유연성이 필요한 전기제품 등에 대해서 장점을 가지며, 그라파이트보다 더 많은 균일분포된 전기화학적 활성사이트를 가진다. 또한 기존에 전극표면의 재료로 많이 사용되어온 카본나노튜브가 많은 정제과정을 거친다고 하더라도, 카본나노튜브 내부에 촉매로 사용된 금속나노입자가 남아있는 것은 확인된 사실이며, 이 불순물은 전기화학적 성질을 가지기 때문에 카본나노튜브의 전기화학적 성질이 변하게 된다는 점에서, 이러한 단점을 가지지 않는 그래핀은 우수한 전극 표면 재료라는 평가를 받고 있다.
효소면역분석법(ELISA, Enzyme-linked immunosorbent assay)은 효소를 표식자로 하여 항원항체반응을 이용한 항원 또는 항체량의 측정 방법을 말한다. 그 중에서도 샌드위치 효소면역분석법(sandwich ELISA)은 1, 2차 항원 항체 반응을 이용하여 알아내고자 하는 특정 단백질, 항원 또는 항체 등의 유무 및 양을 측정하는 데에 쓰인다.
따라서, 그래핀 산화물 및 샌드위치 효소면역분석법을 이용하여 만든, 선택성 및 민감도가 월등한 전기화학적 바이오 센서에 대한 연구의 필요성이 절실히 요구되고 있다.
본 발명자들은 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물을 재료로 이용하여 만든 전극을 이용하고 샌드위치 효소면역분석법을 응용한, 전기화학적 바이오 센서가 기존의 바이오 센서에 비해 선택성 및 민감도가 월등하다는 사실을 밝혀내고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물의 전기촉매현상을 이용한 전기화학 바이오 센서를 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물의 전기촉매현상을 이용한 전기화학 바이오 센서의 제조방법 및 센싱방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물의 전기촉매현상을 이용한 전기화학 바이오 센서를 제공한다.
또한, 본 발명은 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물의 전기촉매현상을 이용한 전기화학 바이오 센서의 제조방법 및 센싱방법을 제공한다.
본 발명에 따른 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물의 전기촉매현상을 이용한 전기화학 바이오 센서는 기존의 바이오 센서보다 우수한 선택성, 민감도 및 경제성을 제공한다. 또한 물질간의 결합에 따른 광학적 특성 변화를 유도하기 위한 염료(dye)가 필요하고, 표적 물질 또는 프로브 물질을 염료로 표지화(labeling)시켜야 하는 공정상의 필요가 있는 광학적 방식에 비해, 전기화학적 방식을 이용하여 센싱을 하는 본 발명은 경제성에 있어서 우수한 효과를 제공한다.
도 1은 본 발명의 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물을 이용한 전기화학 바이오 센서의 제조과정과 센싱방법을 나타낸 도이다.
도 2는 주사전자현미경을 이용하여 촬영된 ITO 전극, AEBD/ITO 전극, GO/AEBD/ITO 전극 및 ERGO/AEBD/ITO 전극에 대한 표면구조 나타낸 도이다.
도 3은 poly(B.P.N.)/ERGO/AEBD/ITO 전극 표면에 대해 H2O2의 농도별로 측정한 순환전압전류법에 따른 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 BSA의 양에 따른 백그라운드 전류의 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 ITO 전극 표면, AEBD/ITO 전극 표면, GO/AEBD/ITO 전극 표면 및 ERGO/AEBD/ITO 전극 표면에 대한 순환전압전류법의 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 원자력 현미경에 의해 촬영된 그래핀 산화물의 구조를 나타낸 도이다.
도 7은 항원의 검출 이후에 poly(B.P.N.)/GO/AEBD/ITO 전극 표면 및 poly(B.P.N.)/ERGO/AEBD/ITO 전극 표면에 대한 순환전압전류법의 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 poly(B.P.N.)/ERGO/AEBD/ITO 전극 표면에 대해, 다른 종류의 항원을 이용하여 측정한 순환전압전류법의 결과를 나타낸 도이다.
도 9은 마우스 IgG의 농도를 변화시키며 각각 (A) femtograms/mL (B) picograms/mL (C) nanograms/mL (D) micrograms/mL의 스케일로 나타낸 순환전압전류법의 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 항원의 농도에 따른 환원 피크 전류의 변화 그래프를 나타낸 도이다.
GO는 Graphene Oxide,
ERGO는 Electrochemically Reduced Graphene Oxide,
AEBD는 Aminoethyl benzenediazonium,
poly(B.P.N)은 poly(BMA-r-mPEGMA-r-NAS)를 각각 나타낸다.
본 발명은 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물의 전기촉매현상을 이용한 전기화학 바이오 센서를 제공한다.
상기 바이오 센서는 산화 인듐-주석(indium tin oxide, ITO) 전극에 대해, 아미노에틸 벤젠디아조늄(Aminoethyl benzenediazonium, AEBD)을 전착시키고, 그래핀 산화물(Graphene oxide, GO)를 코팅한 뒤, 전기화학적으로 환원시키고, 이어서 poly(B.P.N.)를 결합하여 만든 전극에 1차 프로브 물질, 표적 물질, 및 2차 프로브 물질을 부착하여 제조된다.
상기 표적 물질은 항원이고, 1차 프로브 물질 및 2차 프로브 물질은 항체인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은
1) 산화 인듐-주석(ITO)을 포함하는 전극을 그래핀 산화물(GO)로 코팅하고, 전기화학적으로 환원시키는 단계; 및
2) 상기 1)단계에서 얻은 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물(ERGO)이 코팅된 전극에 1차 프로브 물질을 결합하고, 표적 물질을 결합한 뒤, 효소가 결합된 2차 프로브 물질을 결합하는 단계;
를 포함하는 바이오 센서의 제조방법을 제공한다.
상기 표적 물질은 항원이고, 1차 프로브 물질 및 2차 프로브 물질은 항체인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
하기에, 본 발명에 따른 바이오 센서의 제조방법에 대해 단계별로 상세히 설명한다. 모든 실험은 실온에서 진행한다.
상기 1)단계는 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물(Electrochemically Reduced Graphene Oxide, ERGO)이 코팅된 산화 인듐-주석 전극을 제조하는 단계로, 먼저 ITO를 포함하는 전극을 아세톤, 에탄올 및 물을 이용해 세척한 후, 질소 기체 하에서 건조시킨다. 이후, 상기 전극을 piranha 용액(H2SO4 : H2O2 = 3 : 1)에 담근 뒤, 다량의 물로 세척하고 질소 기체 하에서 건조시킨다. 이후, 전기화학적 반응을 일으키기 전에 질소 기체를 이용하여 15분간 AEBD의 공기를 제거하고, 아세토니트릴 하에서 0.05M~0.2M의 Bu4NBF4(tetrabutylammonium tetrafluoroborate)과 함께, 바람직하게는 0.1M Bu4NBF4과 함께 아미노에틸벤젠디아조늄염(AEBD salt) 용액 1~5mM, 바람직하게는 2mM을 전극과 혼합한 뒤, 삼극식셀을 이용하여 +0.1V에서 -1.0V까지 20~80mV/s의 주사 속도(scan rate)로, 바람직하게는 50mV/s의 주사 속도로 전극에 AEBD를 전착시킨다. 전착 후, 상기 전극을 물 및 아세토니트릴을 이용하여 세척한 뒤, 질소 기체 하에서 건조시킨다.
이후, 상기 전극을 그래핀 산화물(~0.1mg/mL) 용액에 2~6시간 동안, 바람직하게는 4시간 동안 잠기게 하여 그래핀 산화물이 코팅된 산화 인듐-주석 전극을 제조한다.
상기에서 얻어진 그래핀 산화물이 코팅된 산화 인듐-주석 전극을 전기화학적으로 환원시키기 위하여, 0.0V을 기점으로 20~80mV/s의 속도로, 바람직하게는 50mV/s의 속도로 전위 소인(potential scan)을 시행한다. 그리고 0.2~0.8M의, 바람직하게는 0.5M의 NaCl 용액 내에서, 약 -1.0V로 측정된 피크 전위로 15초~30초간, 바람직하게는 20초간 유지하여 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물이 코팅된 산화 인듐-주석 전극을 제조한다.
상기 2)단계는 상기 1)단계에서 얻은 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물이 코팅된 전극에 1차 프로브 물질을 결합하고, 표적 물질을 결합한 뒤, 효소가 결합된 2차 프로브 물질을 결합하는 단계로서, 먼저 1차 프로브 물질을 용이하게 전극 표면에 결합시키기 위해서 15~40mg/mL, 바람직하게는 20mg/mL 농도의 poly(B.P.N.) 40~70μL, 바람직하게는 50μL을 상기 전극에 떨어뜨려 상기 전극에 코팅한다.
1차 프로브 물질을 결합시키기 위하여, 1차 프로브 물질 용액 30~70μL, 바람직하게는 50μL를 상기 전극 표면에 떨어뜨리고, 1~4시간 동안, 바람직하게는 2시간 동안 배양한다. 이후, PBST(poly butylene succinate-co-terephthalate)와 물로 세척하고, 질소 기체 하에서 건조시킨다.
추가적인 활성 그룹과 비특이적인 결합부위를 막기 위해 PBS(phosphate buffered saline) 용액 내에서, 상기 전극을 2~5% BSA(bovin serum albumin)와 함께, 바람직하게는 3% BSA와 함께 약 1시간 동안 배양한다. 이후, 전극 표면을 PBS 용액과 물로 세척하고, 질소 기체 하에서 건조시킨다.
표적 물질을 상기 1차 프로브 물질이 결합된 전극 표면에 떨어뜨리고, 30분~3시간, 바람직하게는 1시간 동안 배양한다. 이후, PBST와 물로 세척하고, 질소 기체 하에서 건조시킨다.
효소가 결합된 2차 프로브 물질을 상기 전극 표면에 떨어뜨리고, 30분~3시간, 바람직하게는 1시간 동안 배양한다. 이후, PBST와 물로 세척하고, 질소 기체 하에서 건조시킨다.
상기 표적 물질은 항원이고, 1차 프로브 물질 및 2차 프로브 물질은 항체인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은
1) 산화 인듐-주석을 포함하는 전극을 그래핀 산화물로 코팅하고, 전기화학적으로 환원시키는 단계;
2) 상기 1)단계에서 얻은 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물이 코팅된 전극에 1차 프로브 물질을 결합하고, 표적 물질을 결합한 뒤, 효소가 결합된 2차 프로브 물질을 결합하는 단계; 및
3) 상기 2)단계의 2차 프로브 물질에 결합된 효소의 촉매반응에 의해 생성되는 생성물의 산화-환원반응에 의한 전류를 측정하는 단계를 포함하는 바이오 센싱방법을 제공한다.
하기에, 본 발명에 따른 바이오 센서의 센싱방법에 대해 상세히 설명한다.
표적 물질의 검출을 위하여, 전극을 1.0~2.0mM, 바람직하게는 1.5mM의 H2O2와 1.0~3.0mM, 바람직하게는 2.0mM의 hydroquinin(HQ)이 포함된 PBS 용액에 담그어, 효소 반응이 일어나는 동안, 약 5분간 방치한다. 이후, -0.03V부터 0.2V 사이에서 순환전압전류법(Cyclic Voltammetry)을 시행한다. 효소 반응으로부터 생성된 Benzoquinin(BQ)으로 부터의 환원 피크 전류(Reduction peak current)를 기록한다.
상기 제조된 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물의 전기촉매현상을 이용한 전기화학 바이오 센서는 기존의 바이오 센서보다 우수한 선택성, 민감도 및 경제성을 제공한다. 또한 물질간의 결합에 따른 광학적 특성 변화를 유도하기 위한 염료(dye)가 필요하고, 표적 물질 또는 프로브 물질을 염료로 표지화(labeling)시켜야 하는 공정상의 필요가 있는 광학적 방식에 비해, 전기화학적 방식을 이용하여 센싱을 하는 본 발명은 경제성에 있어서 우수한 효과를 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예1. 마우스 IgG 센싱
1. 아미노에틸 벤젠디아조늄(AminoEthyl BenzeneDiazonium, AEBD), 그래핀 산화물(Graphene Oxide, GO), poly(BMA-r-mPEGMA-r-NAS)의 제조
전극의 재료로 쓰이는 상기 재료는 각각 하기의 논문에 나와 있는 제조방법에 따라 제조되었다.
1) 아미노에틸 벤젠디아조늄은 Griveau, S.; Mercier, D.; Vautrin-UI, C.; Chausse, A. Electrochem. Commun. 2007, 9, 2768-2773에 기재된 제조방법에 따라 제조하였다.
2) 그래핀 산화물은 수정된 Hummers method에 따라 Hummers, W.; Offeman, R. J. Am. Chem. Soc. 1958, 80, 1339., Cote, L. J.; Kim, F.; Huang, J. J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 1043-1049., Xu, Y.; Wu, Q.; Sun, Y.; Bai, H.; Shi, G. ACS Nano 2010, 4, 7358-7362에 기재된 제조방법에 따라 제조하였다.
3) poly(BMA-r-mPEGMA-r-NAS)은 Sung, D.; Shin, D. H.; Jon, S. Biosens. Bioelectron. 2011, 26, 3967-3972에 기재된 제조방법에 따라 제조하였다.
2. ITO/AEBD/GO/poly(B.P.N.) 전극의 제조
2-1 산화 인듐-주석(ITO)을 포함하는 전극에 대한 AEBD 및 GO의 전착
ITO를 포함하는 전극을 아세톤, 에탄올 및 물을 이용해 세척한 후, 질소 기체 하에서 건조시켰다. 이후, 상기 전극을 piranha 용액(H2SO4 : H2O2 = 3 : 1)에 담근 뒤, 다량의 물로 세척하고 질소 기체하에서 건조시켰다. 아세토니트릴 하에서 0.1M의 Bu4NBF4(tetrabutylammonium tetrafluoroborate)과 함께 아미노에틸벤젠디아조늄염(AEBD salt) 용액 2mM을 이용하여 아미노에틸 벤젠디아조늄이 전착된 산화 인듐-주석 전극을 만들었다. 보다 구체적으로 전기화학적 반응을 일으키기 전에 질소 기체를 이용하여 15분간 AEBD의 공기를 제거하고, 아세토니트릴 하에서 0.1M Bu4NBF4과 함께 아미노에틸벤젠디아조늄염(AEBD salt) 용액 2mM을 전극과 혼합한 뒤, 삼극식셀을 이용하여 +0.1V에서 -1.0V까지 50mV/s의 주사 속도(scan rate)로 전극에 AEBD를 전착시켰다. 전착 후, 상기 전극을 물 및 아세토니트릴을 이용하여 세척한 뒤, 질소 기체 하에서 건조시켰다.
상기 전극을 그래핀 산화물(~0.1mg/mL) 용액에 4시간 동안 잠기게 하여 그래핀 산화물이 코팅된 산화 인듐-주석 전극을 제조하였다.
2-2 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물(ERGO)이 코팅된 산화 인듐-주석 전극의 제조
상기에서 얻어진 그래핀 산화물이 코팅된 산화 인듐-주석 전극을 전기화학적으로 환원시키기 위하여, 0.0V부터 50mV/s의 속도로 전위 소인(potential scan)을 시행하였다. 그리고 0.5M의 NaCl 용액 내에서, 약 -1.0V로 측정된 피크 전위로 20초간 유지하였다.
2-3 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물(ERGO)이 코팅된 산화 인듐-주석 전극에 poly(B.P.N.)의 코팅
1차 항체를 용이하게 전극 표면에 결합시키기 위해서, 20mg/mL 농도의 poly(B.P.N.) 50μL를 상기 전극에 떨어뜨려 상기 전극에 코팅하였다.
3. 1차 항체, 항원, 및 2차 항체의 결합 및 센싱
3-1 전극에의 1차 항체의 결합 및 비사용 부위에 대한 비활성화
항-마우스 IgG(immunoglobulin G) 1차 항체를 상기 poly(B.P.N.)이 코팅된 전극에 결합시키기 위하여, 항-마우스 IgG(100㎍/ml in PBST) 용액 50μL를 상기 전극 표면에 떨어뜨리고, 2시간 동안 배양하였다. 이후, PBST와 물로 세척하고, 질소 기체 하에서 건조시켰다.
추가적인 활성 그룹과 비특이적인 결합부위를 막기 위해 PBS 용액 내에서, 3% BSA와 함께 1시간 동안 배양하였다. 이후, 전극 표면을 PBS와 물로 세척하고, 질소 기체 하에서 건조시켰다.
3-2 항원 및 2차 항체의 전극에의 결합
마우스 IgG를 검출하기 위해, 마우스 IgG 50μL를 상기 항-마우스 IgG 1차 항체가 결합된 전극 표면에 떨어뜨리고, 1시간 동안 배양하였다. 이후, PBST와 물로 세척하고, 질소 기체 하에서 건조시켰다.
HRP(Horseradish Peroxidase)가 결합된 항-마우스 IgG 2차 항체(20㎍/mL in PBST)를 상기 전극 표면에 떨어뜨리고, 1시간 동안 배양하였다. 이후, PBST와 물로 세척하고, 질소 기체 하에서 건조시켰으며 모든 실험은 실온에서 진행되었다.
3-3 순환전압전류법에 의한 항원의 검출
상기 과정을 통해 전극을 0.45cm2 의 크기로 제작하였다. 전극을 1.5mM의 H2O2와 2.0mM의 hydroquinin(HQ)이 포함된 PBS 용액에 담그어, 효소 반응이 일어나는 동안, 약 5분간 방치하였다. 이후, -0.03V부터 0.2V 사이에서 순환전압전류법(Cyclic Voltammetry)을 시행하였다. 효소 반응으로부터 생성된 Benzoquinin(BQ)으로 부터의 환원 피크 전류(Reduction peak current)를 기록하였다.
실험예1. 주사전자현미경(Scanning electron microscope, SEM)
ITO 전극, AEBD/ITO 전극, GO/AEBD/ITO 전극 및 ERGO/AEBD/ITO 전극에 대한 표면구조는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, ITO 전극과 AEBD가 전착된 ITO전극은 깨끗한 표면을 가지고 있었다. 반면 그래핀 산화물(GO)과 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물(ERGO)가 결합된 ITO 전극의 경우는 표면이 거칠었으며, 이는 GO와 ERGO의 존재를 나타내는 것이다. GO가 부착된 전극의 표면과 ERGO가 부착된 전극의 표면에서, 부착된 그래핀의 밀도의 차이가 거의 없는 것이 확인되었는데, 이는 -1.0V의 높은 환원 전위에서도 ERGO의 손실이 거의 없었다는 것을 의미한다. 이는 곧, 전극 상에서 ERGO와 AEBD간의 π-π결합이 여전히 유효하게 존재하고 있다는 것을 의미한다.
실험예2. H 2 O 2 의 농도에 따른 백그라운드 전류의 측정
poly(B.P.N.)/ERGO/AEBD/ITO 전극 표면에 대해 H2O2의 농도를 바꿔가며 측정한 순환전압전류법에 따른 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, H2O2의 농도가 2.0mM이하 에서는 환원 전류가 매우 낮은 반면에, 농도가 5.0mM인 경우에는 환원 전류가 급격히 증가하였다. 따라서 백그라운드 전류를 줄이기 위해서는 H2O2의 농도를 줄여야 한다는 것을 나타낸다. 하지만 H2O2의 농도가 지나치게 낮으면 HRP의 효소 반응이 잘 일어나지 않을 것이기 때문에, 본 발명에서는 1.5mM의 농도를 선택하였다.
실험예3. BSA(Bovine Serum Albumin)의 양에 따른 백그라운드 전류의 측정
BSA의 양에 따른 백그라운드 전류의 측정 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, BSA가 존재하지 않는 경우에 비해, BSA의 양이 증가하는 경우 비특이적인 결합이 매우 줄었음을 알 수 있다.
실험예4. 전극 표면 재료의 차이에 따른 순환전압전류법(Cyclic Voltammetry, CV)
ITO 전극 표면, AEBD/ITO 전극 표면, GO/AEBD/ITO 전극 표면 및 ERGO/AEBD/ITO 전극 표면에 대한 순환전압전류법의 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, ITO 전극표면에 대해 AEBD 또는 GO의 결합이 있은 후에도, ITO 전극의 전기화학적 성질은 크게 변하지 않았다. 그러나 전기화학적으로 환원되어 ERGO가 결합된 ITO 전극은 피크 전류가 크게 증가하였으며, 이는 Benzoquinin에 대한 환원에 있어서, ERGO/AEBD/ITO의 전기촉매적인 활성이 높아졌음을 의미한다.
실험예5. 원자력현미경 (Atomic Force Microscopy, AFM)
그래핀 산화물의 구조를 도 6에 나타내었다.
실리콘 기질을 아세톤, 에탄올 및 물로 세척한 뒤, 3-아미노프로필트리에톡시실레인(3-aminopropyltriethoxysilane, APTES) 수용액에 가하여, 15분 동안 보관하였다. 이후, 물로 세척하고 질소 기체 하에서 건조시킨 뒤, 상기 수정된 실리콘 기질을 그래핀 산화물 수용액에 가하여 3분간 보관하였다. 이후, 물로 세척하고 질소 기체 하에서 건조시켜서 샘플을 준비하였다. 그래핀 산화물의 크기는 몇십에서 몇백 나노미터로 다양했고, 평균적인 높이는 약 1.0 나노미터로 나타났다.
실험예6. ERGO 전극 표면과 GO 전극 표면에 대한 순환전압전류법
항원의 검출 이후에 poly(B.P.N.)/GO/AEBD/ITO 전극 표면 및 poly(B.P.N.)/ERGO/AEBD/ITO 전극 표면에 대한 순환전압전류법의 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, HQ와 H2O2를 포함하는 PBS 용액 내에서 GO만을 포함하고 있거나 GO 또는 ERGO를 포함하지 않는 전극 표면에서는, 뚜렷한 환원 피크 전류가 측정되지 않았다. 이는 poly(B.P.N.)가 GO보다는 ERGO에 대해 π-π결합을 통해서 더욱 잘 결합하기 때문이며, 또한 ERGO가 GO보다 더욱 전기촉매적으로 활성이 강하기 때문임을 알 수 있다.
실험예7. 항원의 종류에 따른 특이성의 측정
poly(B.P.N.)/ERGO/AEBD/ITO 전극 표면에 대해, 다른 종류의 항원을 이용하여 측정한 순환전압전류법의 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, 항원을 가하지 않은 경우, 마우스 IgG, 및 래빗 IgG를 가한 경우 모두 0.1M 의 PBS, 2mM의 HQ 및 1.5mM의 H2O2를 사용하였다. 마우스 IgG를 넣은 경우에는 뚜렷한 환원 피크 전류가 나타났고, 항원을 가하지 않은 경우 및 래빗 IgG를 가한 경우에는 환원 피크 전류가 나타나지 않았다. 이는 본 발명의 바이오 센서가 우수한 특이성과 선택성을 가지고 있다는 것을 나타낸다.
실험예8. 항원의 농도에 따른 환원 피크 전류의 변화 측정
마우스 IgG의 농도를 변화시키며 각각 (A) femtograms/mL (B) picograms/mL (C) nanograms/mL (D) micrograms/mL의 스케일로 나타낸 순환전압전류법의 결과를 도 9에 나타내었다.
또한, 항원의 농도에 따른 환원 피크 전류의 변화를 나타낸 그래프를 도 10에 나타내었다.
도 9 및 도 10에 나타난 바와 같이, 100nanograms/mL 이상의 농도부터는 항원의 농도가 증가함에 따라 환원 피크 전류가 커짐을 알 수 있다.

Claims (11)

  1. 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물(Electrochemically Reduced Graphene Oxide, ERGO)이 코팅된, 산화 인듐-주석을 포함하는 전극; 상기 전극에 결합된 항-마우스 IgG 1차 항체; 마우스 IgG 항원; 및 HRP(Horseradish peroxidase) 효소가 결합된 항-마우스 IgG 2차 항체를 포함하며,
    상기 전극은, 황산과 과산화수소가 3:1의 부피비로 혼합된 피라나 용액 및 물로 세척한 산화 인듐-주석을 포함하는 전극에 0.1M 내지 0.2M의 Bu4NBF4(tetrabutylammonium tetrafluoroborate) 및 2 내지 4mM의 아미노에틸벤젠디아조늄을 혼합하고, 삼극식셀을 이용하여 40 내지 60mV/s의 속도로 주사하여 아미노에틸벤젠디아조늄을 전극에 전착시킨 후, 그래핀 산화물로 코팅하고, 40 내지 60mV/s 의 속도로 전위 소인을 하여 전기화학적으로 환원시키며,
    상기 전극에 결합된 항-마우스 IgG 1차 항체는 40 내지 60 μL의 항-마우스 IgG 항체를 전극 표면에 떨어뜨려 1 내지 3시간 동안 배양하여 제조하고,
    상기 항-마우스 IgG 2차 항체에 결합된 효소의 촉매반응에 의해 생성되는 생성물의 환원 피크 전류가, 그래핀 산화물(Graphene Oxide, GO)이 코팅된 산화 인듐-주석을 포함하는 전극에 의한 환원 피크 전류보다 크게 나타나는 것을 특징으로 하는 바이오 센서.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 1) 황산과 과산화수소가 3:1의 부피비로 혼합된 피라나 용액 및 물로 세척한 산화 인듐-주석을 포함하는 전극에 0.1M 내지 0.2M의 Bu4NBF4(tetrabutylammonium tetrafluoroborate) 및 2 내지 4mM의 아미노에틸벤젠디아조늄을 혼합하고, 삼극식셀을 이용하여 40 내지 60mV/s의 속도로 주사하여 아미노에틸벤젠디아조늄을 전극에 전착시킨 후,
    상기 아미노에틸벤젠디아조늄이 전착된 전극을 그래핀 산화물로 코팅하고, 40 내지 60mV/s 의 속도로 전위 소인을 하여 전기화학적으로 환원시키는 단계;
    2) 상기 전기화학적으로 환원된 그래핀 산화물이 코팅된 전극을 10 내지 30mg/mL 농도의 poly(BMA-r-mPEGMA-r-NAS) 40 내지 60 μL로 코팅하는 단계; 및
    3) 상기 poly(BMA-r-mPEGMA-r-NAS)이 코팅된 전극에 항-마우스 IgG 1차 항체를 결합하고, 마우스 IgG 항원을 결합한 뒤, HRP(Horseradish peroxidase) 효소가 결합된 항-마우스 IgG 2차 항체를 결합하는 단계를 포함하고,
    상기 3)단계에서, 전극에 결합된 항-마우스 IgG 1차 항체는 40 내지 60 μL의 항-마우스 IgG 항체를 전극 표면에 떨어뜨려 1 내지 3시간 동안 배양하여 제조된 것을 특징으로 하는, 바이오 센서의 제조방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제 1항의 바이오 센서를 과산화수소와 하이드로퀴논(hydroquinone)이 포함된 인산염 완충용액(PBS)에 담근 후, 생성되는 생성물의 산화-환원 반응에 의한 전류를 -0.03V ~ -0.2V 사이에서 순환전압전류법으로 측정하는 것을 특징으로 하는, 바이오 센싱 방법.
  11. 삭제
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