KR101686890B1 - 환원된 그래핀 옥사이드와 금속나노입자의 복합체 필름 및 호스라디시 페록시다제를 포함하는 과산화수소 센서 및 그 제조방법 - Google Patents

환원된 그래핀 옥사이드와 금속나노입자의 복합체 필름 및 호스라디시 페록시다제를 포함하는 과산화수소 센서 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 산화인듐주석 전극에 환원된 그래핀 옥사이드와 금나노입자를 전착하여 호스라디시 페록시다제를 부착하는 것에 관한 것으로서, 경제적인 과산화수소 검출 바이오 센서를 제조하는 방법을 포함한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 그래핀 옥사이드와 금나노입자 복합체를 대시간전류법에 의해 전착시킨 ITO 개질 전극을 이용하여 H2O2를 검출하기 위한 HRP의 직접적 전자 전송을 개시함으로써, 민감성이 높고 재생가능한 과산화수소 검출 센서를 제조하고 이를 이용해 높은 수율로 과산화수소를 검출할 수 있는 효과가 있다.

Description

환원된 그래핀 옥사이드와 금속나노입자의 복합체 필름 및 호스라디시 페록시다제를 포함하는 과산화수소 센서 및 그 제조방법{H₂O₂ SENSOR ELECTRODEPOSITED OF ERGO-NP NANOCOMPOSITE FILMS COUPLED WITH HORSERADISH PEROXIDASE, AND METHOD THEREOF}
본 발명은 과산화수소 검출용 센서 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 환원시킨 그래핀 옥사이드와 금나노입자의 복합체에 호스라디시 페록시다제(Horseradish Peroxidase, HRP)를 부착하여 과산화수소를 검출하는 센서 및 그 제조방법에 관한 것이다.
전기화학 바이오센서는 그 민감성, 선택성, 간단성 및 낮은 가격에 의해 치료 진단, 식품 분석 및 환경감시(environmental monitoring) 분야에서 주목받고 있으며 주요 분석 도구로 자리매김하고 있다. 이런 이유로, 센서의 틀에 대한 새로운 전략이 이용된 민감성과 선택성이 뛰어난 전기화학 바이오센서의 등장은 꾸준히 발전하고 있다. 과산화수소(H2O2)는 활성산소 중의 하나로 산화 스트레스를 유도하고 성장을 억제하며 세포예정사(apoptosis) 또는 세포괴사(necrosis of cells)를 야기할 뿐만 아니라, 고농도의 과산화수소는 사람의 피부 및 건강상에 심각한 피해를 유발한다. 그리하여, 민감하고 효과적이며 정확한 과산화수소의 검출 센서가 생물학, 식품, 약학, 생물의학 및 환경감시적 중요성에 의해 많은 주목을 받아왔다. 과산화수소를 검출하기 위해 적정분석법(titrimetry) 크로마토그래피(chromatography), 분광법(spectroscopy) 및 전기화학적 방법(electrochemical methods)을 포함하여 다양한 기술들이 적용되고 있다. 그 중 전기화학적 방법은 그 저렴한 가격과 고유의 민감성 및 이용의 용이성에 힘입어 빠르게 개발되고 있다.
HRP(Horseradish Peroxidase)는 광범위하고 다양한 유기체 및 무기체의 산화반응을 촉진하는 효소로, 과산화수소에 대해서는 전자 수용체의 역할을 한다. HRP 단백질 구조의 숨겨진 내부에는 산화환원 중심(redox center)이 있어서, 크기가 크지만 느린 전자이동 활동(sluggish electron-transfer kinetics)을 주도하는 많은 분자들의 간섭을 피할 수 있는 이점이 있다. 그러나 HRP는 과산화수소의 전기화학적 검출을 위해 전극 표면에 직접적으로 흡착될 경우 생물활성을 잃는다. 이러한 한계를 극복하기 위하여, 적절한 전극 물질과 안정적인 단백질 고정화기술이 산화환원 단백질(redox proteins)의 직접전자전송(direct electron transfer, DET)을 용이하게 하면서 고정된 효소의 생물학적 활성을 유지하기 위해 적절한 전극 재료 선택과 전극 면에 안정적으로 단백질을 고정화하는 기술이 필요하다. 기존 전극을 이용한 경우보다 향상된 DET를 획득할 수 있도록 전극 면을 개조하고 단백질을 고정화하는 공정은 실용적인 바이오 검출센서 생산에 중요한 요소가 된다.
전기화학 바이오센서에 대한 대다수의 연구는 민감한 전기화학 센서를 고안함에 있어 금속 나노입자의 혼합에 주목해 왔다. 촉매 활성, 광학, 전기 및 자기력과 같은, 벌크(bulk) 구조에서는 나타나지 않는 나노입자 고유의 특성들에서 기인하여, 최근 많은 노력이 나노입자들의 전착에 집중되어왔다. 탄소 유래 물질 또한 높은 전도도와 귀금속 대비 낮은 가격으로 상당한 주목을 받고 있다. 많은 탄소 유래 물질들 중에서도 그래핀은 2차원의 얇은 판을 이루는 탄소 원자들이 벌집 유사한 격자 모양을 구성하고 있는 것으로, 물리적 전기적으로 독특한 성질을 가지며 화학적으로 안정하고, 비표면적이 넓고 생체에 적합한 특성을 갖추었다는 점에서 전기화학적 바이오센서로서의 관심이 높아지고 있다. 그래핀이 포함하는 카복실기 및 하이드록실기는 친수성 성질의 원인이 되는 것으로, 물과 유기 용매 모두에서 높은 분산성을 나타낸다. 따라서, 그래핀 유래의 나노구조들은 근래에 전극의 표면을 개질해 전기화학적 반응을 향상시키는 것에 이용되고 있다.
그래핀-금나노입자, 그래핀-나노로드-PEG 복합체, 그래핀-그래핀 튜브 혼성체 및 그래핀-백금나노입자-IL 복합체와 같은 그래핀 기반 금속 나노입자들에 대한 많은 연구들은 전기화학적 센서를 위한 기능적인 접점의 도달에 접근하고 있다. 그래핀 기반 복합체에 대한 전통적인 접근은 그래핀 옥사이드와 메탈 옥사이드 둘 다를 환원시키기 위해 복합적 화학 물질을 활용한 환원 방법으로 시간이 오래 걸리는 문제가 있었다. 규모가 크고 수율이 높다는 장점에도 불구하고 이러한 방법들은 과도한 환원제 사용 시 많은 화학적 잔류물이 배출된다. 그리하여, 환원된 그래핀 옥사이드를 만들 수 있는 간단하고 빠른 방법이 필요하게 되었다. 구조 생성에 어려움을 겪어왔던 나노복합체의 형성을 위한 그래핀 옥사이드와 나노입자들의 전기화학적 환원반응을 위하여 순환전류전압측정법(Cyclic Voltammetry(CV))을 이용할 수 있다.
그러나 본 발명은 그래핀 옥사이드-나노입자의 전기화학적 공환원(co-reduction)을 위해 손쉽고 빠르며 환원 정도를 조절 가능한 대시간전류법(chronoamperometry, CA)을 제안한다.
본 발명의 핵심 구성은, 산화인듐주석(indium tin oxide(ITO)) 상에 구조를 변환시킨 환원된 그래핀 옥사이드(reduced graphene oxide(ERGO))와 금나노입자(NP) 복합체의 CA 기반 공전착(co-electrodeposition)과 과산화수소의 검출을 위한 HRP에의 DET 활용을 처음으로 개시했다는 데 있다. 효소의 아민기(amine terminals)와 ERGO의 카복실기 사이의 공유결합 및 3-MPA로 활성화된 NP는 EDC/NHS 결합을 통해 강한 아미드 결합을 형성하는 것을 유도한다. 센서 제조방법의 전체 프로세스는 도 1에 제시된다. NP의 첨가는 표면 검출에서의 전도성을 개선한다. ITO상의 ERGO-NP 구조 형성을 분석측정으로 확인하였고 전기화학적 측정으로 과산화수소 검출에 있어서 훌륭한 민감성, 개선된 검출한도 및 뛰어난 안정성을 확인하였다.
관련 종래기술로는 한국등록특허 제10-1140356호(은나노선을 이용한 과산화수소 검출용 바이오센서 및 이의 제조방법), 미국공개특허 US8871067(SENSOR FOR DETECTING HYDROGEN PEROXIDE), 한국공개특허 제10-2014-0058729호(과산화수소 센서 및 이의 제조방법) 등이 있다.
본 발명의 목적은, 산화인듐주석 전극에 환원된 그래핀 옥사이드와 금나노입자를 전착하여 호스라디시 페록시다제를 부착함으로써, 경제적인 과산화수소 검출 바이오 센서를 제조하는 방법을 제공함에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 전도성 산화물(conducting oxide) 기질 상에 흑연과 금속나노입자를 전착(electrodeposited)시키는 단계; (2) 상기 (1)단계에서 흑연과 금속나노입자를 전착시킨 기질을 활성화 물질에 담지시키는 단계; 및 (3) 상기 (2)단계에서 활성화 물질을 담지시킨 기질을 호스라디시 페록시다제(HRP) 용액에 담지시키는 단계;를 포함하는, 환원된 그래핀 옥사이드와 금속나노입자의 복합체 필름 및 호스라디시 페록시다제를 포함하는 과산화수소 센서 제조방법을 제공한다.
상기 (1)단계에서 전착되는 흑연은 환원된 그래핀 옥사이드인 것을 특징으로 한다.
상기 (1)단계에서 전착되는 금속나노입자는 금(Au)나노입자인 것을 특징으로 한다.
상기 (1)단계에서의 전착 방법은 대시간전류법(chronoamperometry, CA)을 이용하여 전압을 인가하는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 상기 첫번째 측면 또는 그의 실시태양에서 정의된 제조방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 과산화수소 센서를 제공한다.
또한 본 발명은 (1) 환원된 그래핀 옥사이드와 금속나노입자의 복합체 필름 및 호스라디시 페록시다제를 포함하는 과산화수소 센서를 포함하는 버퍼 용액을 준비하는 단계; (2) 상기 (1)단계의 버퍼 용액에 평형전위와 전위차가 -2.0 내지 +4.0 V인 전압을 가하는 단계; (3) 상기 (1)단계에서 혼합된 버퍼 용액에 분석하고자 하는 시료를 투입시키는 단계; 및 (4) 상기 (2)단계에서 발생하는 전기적 신호를 측정하여 과산화수소를 확인하는 단계;를 포함하는 과산화수소 검출방법을 제공한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면,
그래핀 옥사이드와 금나노입자 복합체를 대시간전류법에 의해 전착시킨 ITO 개질 전극을 이용하여 H2O2를 검출하기 위한 HRP의 직접적 전자 전송을 개시함으로써, 민감성이 높고 재생가능한 과산화수소 검출 센서를 제조하고 이를 이용해 높은 수율로 과산화수소를 검출할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 과산화수소를 검출하기 위한 HRP/ERGO-NP/ITO 전극의 표면 형성 과정의 모식도.
도 2는 전기화학측정법으로 확인한 전착과정. a) ERGO : -1.2 V에서 120 s 소요. b) Au NP : -0.9 V에서 30 s 소요. c) ERGO 및 Au NP : -1.2 V 및 -0.9 V에서 150 s 소요.
도 3은 UV-Vis 흡수 스펙트럼으로 확인한 전극 표면의 전착 필름 반응. a) NP, b) ERGO 및 c) ERGO-NP.
도 4는 각각 a) ERGO/ITO 표면의 라만 분석; 및 b) NP/ITO 및 c) ERGO-NP/ITO 표면의 SERS 분석.
도 5는 전기화학 임피던스의 보드 선도(bode plot). (a) 임피던스 크기(magnitude) (|Z|); (b) 주파수(frequency(f)) 대비 위상(phase(Φ)); (c) Nyquist 선도(Z'(resistance), 임피던스 실수부) 대비 Z"(reactance), 임피던스 허수부)) 및 (d) 4 mM [Fe(CN)6]3-/4-에서의 순수 ITO, NP/ITO, ERGO/ITO, ERGO-NP/ITO 및 HRP/ERGO-NP/ITO; 주사속도(scan rate)가 50 mVs-1 일 때 CV 값.
도 6은 (a) pH 7.0의 10 mM PBS 속에서 주사속도가 50 mVs-1일 때 ERGO-NP/ITO 및 HRP/ERGO-NP/ITO 전극 표면의 CV값; (b) pH 7.0의 10 mM PBS 속에서 주사속도가 0.01 Vs-1 내지 0.2 Vs-1일 때 주사속도에 따른 HRP/ERGO-NP/ITO 표면의 CV값; (c) v 대비 음극(cathodic(ipc)) 및 양극(anodic(ipa)) 피크(peak) 전류 값, 및 (d) log(v) 대비 HRP/ERGO-NP/ITO 전극의 음극(Epc) 및 양극(Epa) 피크 전압(voltages)로부터의 CV값.
도 7은 (a) 5 μL의 100 mM H2O2 부분 표본(aliquots)을 pH 7.0의 10 mM PBS 5 ml에 계속적으로 투여시 HRP/ERGO-NP/ITO 전극의 CV; (b) 질소 분위기 하에서 -0.1 V 전위(potential) 인가 시 5 μL의 100 mM H2O2 부분 표본을 5 mL의 10 mM PBS에 연속적 주입에 따른 HRP/ERGO-NP/ITO 전극(세부 사진은 H2O2 농도 대비 CA 선도); (c) ERGO-NP/ITO 전극; 및 (d) 순수 ITO 전극의 CA(I/t) 곡선.
도 8은 -0.1 V 전압 인가 시 UA, AA, NaNO2 또는 H2O2 5 μL(0.1 mM)를 pH 7.0인 5mL의 PBS 버퍼에 계속적으로 투입했을 때 HRP/ERGO-NP/ITO 전극의 CA(I/t) 곡선.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 (1) 전도성 산화물(conducting oxide) 기질 상에 흑연과 금속나노입자를 전착(electrodeposited)시키는 단계; (2) 상기 (1)단계에서 흑연과 금속나노입자를 전착시킨 기질을 활성화 물질에 담지시키는 단계; 및 (3) 상기 (2)단계에서 활성화 물질을 담지시킨 기질을 호스라디시 페록시다제(HRP) 용액에 담지시키는 단계;를 포함하는, 환원된 그래핀 옥사이드와 금속나노입자의 복합체 필름 및 호스라디시 페록시다제를 포함하는 과산화수소 센서 제조방법을 제공한다.
상기 (1)단계에서 전착되는 흑연은 환원된 그래핀 옥사이드일 수 있다.
상기 (1)단계에서 전착되는 금속나노입자는 금(Au)나노입자일 수 있다.
상기 (1)단계에서의 전착 방법은 대시간전류법(chronoamperometry, CA)을 이용하여 전압을 인가하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 첫번째 측면 또는 그의 실시태양에서 정의된 제조방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 과산화수소 센서를 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 환원된 그래핀 옥사이드와 금속나노입자의 복합체 필름 및 호스라디시 페록시다제를 포함하는 과산화수소 센서를 포함하는 버퍼 용액을 준비하는 단계; (2) 상기 (1)단계의 버퍼 용액에 평형전위와 전위차가 -2.0 내지 +4.0 V인 전압을 가하는 단계; (3) 상기 (1)단계에서 혼합된 버퍼 용액에 분석하고자 하는 시료를 투입시키는 단계; 및 (4) 상기 (2)단계에서 발생하는 전기적 신호를 측정하여 과산화수소를 확인하는 단계;를 포함하는 과산화수소 검출방법을 제공한다.
시약
Graphene oxide(GO), gold(III) chloride trihydrate(HAuCl4·3H2O), Horseradish peroxidase(HRP), 3-Mercaptopropionic acid(3-MPA), 1-ethyl-3-(3-dimethylminopropyl) carbodimide(EDC), N-hydroxysuccinimide (NHS), L-ascorbic acid(AA), uric acid(UA), sodium nitrite(NaNO2) 는 Sigma-Aldrich에서 구매하였다. Hydrogen peroxide는 OCI Ltd.(Seoul, Korea)에서 구매하여 증류수에 희석하여 몰 용액으로 준비되었다. Carbonate buffer(pH 9.0) 및 10 mM phosphate buffer solution(PBS) 버퍼 용액(pH 7.0)은 전기화학적 실험에 이용되었다. 다른 모든 용액은 증류수에 의해 준비되었고(18 MΩcm), 이는 Milli-Q system(Millipore, Bedford, MA, USA)에 의해 정제되었다.
기구 및 측정방법
순수(bare) ITO의 표면 지형(topography)과 ITO 표면에 전착된 필름은 Nanoscope IV/Multimode(Digital Instruments, USA)를 이용한 Atomic force microscopy(AFM)로 확인되었다. 모든 AFM 이미지들은 250.300 kHz의 공명(resonance) 주파수 하에서 실리콘 캔틸레버(silicon cantilever)를 이용하여 tapping 모드로 기록되었다. UV-Vis 분광측정법은 ITO로 코팅된 수정 기질 상의 변성된 전극에 Optizen Pop(Mecasys, Daejeon, Korea)을 이용하였고 모든 전기화학적 측정법은 일반적인 용도의 전기화학적 소프트웨어에 IVIUM compactstat을 연결하여 실시되었다. 라만분광법(Raman spectroscopy)는 XYZ가 (100 X 100 X 6) μm인 scan 범위(range)를 포함한 RamanNTEGRAspectra (NT-MDT, Russia)로 XY plane은 200 nm, Z axis은 500 nm로 실시되었다. 스펙트럼은 785 nm의 파장에서 NIR laser가 발생하는 빛으로 기록된다. 5초 간 500 cm-1 내지 2300 cm-1의 범위에서 여러 번의 scan을 기록하여 평균 데이터를 이용하였다. CV 및 전기화학적 임피던스 분광법(electrochemical impedance spectroscopy(EIS))은 작업 전극(working electrode)인 기질과 상대 전극(counter electrode)인 백금선 및 기준 전극(reference electrode)인 Ag/AgCl/KClsat 각각의 변성 과정에 의해 IVIUM compact stat potentiostat (Eindhoven, Netherlands)을 이용하여 실시되었다. ZView software(Scribner Associates Inc.)에 따른 비선형적(non-linear) 곡선의 임피던스 데이터는 이중층 용량(double layer capacitance)을 위상상수요소(constant phase element(CPE))로 대체한 Randles 전기적등가회로(electrical equivalent circuit)와 일치한다. 전류적정(I/t) 측정방법은 다양한 H2O2 농도하에서 HRP/ERGO-NP/ITO 전극에 대해 실시되었다. 인가 전압은 -0.1 V로 설정되었고, 5 mL의 10 mM PBS (pH 7.0) 버퍼(buffer)에 대한 5 μL 단위의 100 mM H2O2의 계속적인 투입 후 I-t 곡선(curves)이 기록되었다. 전류적정법 측정 동안의 대류적인 운반은 900 rpm의 자력교반(magnetic stirring)을 통해 실시하였다. 버퍼는 순도 높은 질소 기체의 흐름을 통해 제거되었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. HRP/ERGO-NP/ITO 전극의 준비
유리 및 수정 기판에 200 nm의 두께로 코팅된 ITO(10Ω/cm2)는 전기화학적 또는 광학적 측정에 각각 이용된다. 상기 투명한 기판은 Tween 20/증류수(1:5, v/v), 증류수 및 에탄올에서 최소 30분씩 연속적인 초음파처리(sonication)를 통해 세정된다. 상기 ITO 전극은 1:1:5의 비율로 혼합된 NH4OH:H2O2:H2O 용액 내에서 40분간 80 ℃로 가열되고, 물로 세척한 후 질소 분위기 하에서 건조된다. 모든 전착은 세 개의 전극 시스템으로 Ag/AgCl을 기준 전극, 백금선을 상대 전극으로 포함시키고 IVIUM compact stat potentiostat(Eindhoven, Netherlands)를 이용하여 실온에서 실시되었다. 1 mm의 지름을 가지는 원형 디스크 전극(Circular disc electrode)은 ITO 유리 기질 상에 일반적인 전극 제조 방식을 통해 제작되어 작업 전극으로 사용되었다. 전기화학 bath는 pH 9.0인 0.1 M의 carbonate 버퍼 내의 그래핀 옥사이드(1 mg/mL)로 구성되며 gold 용액(HAuCl4.3H2O; 0.5 mM) 은 그래핀 옥사이드 용액과 실온에서 혼합하였다. 전착을 위해 실온에서 Ag/AgCl 전극을 이용하여 ERGO의 전착에 -1.2 V, NP의 전착에 -0.9 V로 인가하였다. 각 전착 이후에, 변성된 전극의 결과물은 증류수로 세척하여 질소 분위기 하에서 건조하였다. 상기 변성된 ERGO-NP 나노복합체 층(layer)이 형성된 ITO 전극 표면은 3-MPA로 활성화되고 2 mg/mL의 25 ℃ EDC/NHS 용액에 15분간 담지하였다. 상기 기질을 0.1 M PBS로 세척 후, 20 μL의 0.1 mg/mL HRP 용액을 떨어뜨려 상기 전극에 cast시키고 공유결합을 위해 humid chamber에 3시간 배양(incubate)하였다. 최종적으로 같은 버퍼로 세척한 뒤, 상기 전극은 사용하기 전까지 4 ℃의 습한 환경에서 보관하였다(도 1).
실시예 2. ERGO-NP/ITO 전극의 전기화학적 특성화
그래핀 옥사이드(ERGO)(도 2a)의 전기화학적 환원, 금나노입자 전착(NP)(도 2b)을 각각 -1.2 V (120 s), -0.9 V (30 s) 조건하에서 또는 그래핀 옥사이드-금나노입자(ERGO-NP)(도 2c)를 150초 간 -1.2 V와 -0.9 V에서의 choronoamperogram을 도 2에 각각 표시하였다. ERGO-NP 필름의 얇은 단일층을 형성하기 위해, 각각의 전극 표면 개질 시 전류를 관측함으로써 전착 시간과 농도를 최적화하였다. 그래핀 옥사이드는 sp2 결합 네트워크(bonding networks) 파열로 전기적으로 절연성을 갖는다. 그러나, 환원을 통해 그래핀 옥사이드의 π-network 복구를 통해 전기적 전도성이 향상될 수 있다. 그래핀 옥사이드의 환원은 전기화학적으로 -1.2 V(Ag/AgCl 전극대비)에서 산소 기능(oxygen functionalities)의 소멸을 나타낸다. 환원된 그래핀 옥사이드의 형성에 대해 제안된 반응 기작은 아래와 같다.
Graphene oxide + aH+ + be- → Reduced graphene oxide + cH2O
ITO 전극 상의 금 전착 공정은 AuCl 4 -의 환원으로부터 유도되므로 잘 분포된 나노입자 구조들을 상기 표면에 형성한다. 상기 전류의 밀도는 처음 5초 동안 빠른 증가를 보이고 대략 15초 정도에서의 정류값(stationary value)을 향해 점진적으로 감소하였다. 상기 나노입자 구조들은 처음 10초 동안의 핵 생성(nucleation)과 Au 전착의 증가로 형성되었다. 초기 전하 이동(charge transfer) 제어 전류는 전극 표면의 AuCl 4 - 농도 감소에 따라 감소한다. 이후, AuCl 4 - 이온의 공핍(depletion)으로 확산에 의한 물질수송이 상기 환원 반응을 결정한다. 확산 층(diffusion layer)의 두께가 증가할수록, Cottrell의 법칙에 따라 전류는 전극 표면의 이온 농도 구배가 저하됨에 따라 감소한다. 또한, two step 전착 포텐셜에서 상기 ERGO 및 NP 혼합 용액은 금과 그래핀 옥사이드의 환원과 연계하여 ITO 표면에 Au로 둘러싸인 환원된 그래핀 옥사이드 나노구조층의 형성을 야기하였다. AFM 이미지는 ITO 전극 표면 개질 공정에 따른 전극면(electrode surfaces)을 나타낸다.
실시예 3. UV-VIS 분광분석법(spectroscopic survey scan)
UV-Vis 분광분석법은 220 내지 790 nm의 파장 범위 안에서 ERGO/ITO, NP/ITO 및 ERGO-NP/ITO와 같이 표면이 개질된 전극들에 대하여 수행되었다(도 3). 245 nm에서의 흡광(absorption) 피크는 방향성 C=C 고리의 π-π* 전이(transition)의 결과로 보이며 290 nm에서의 shoulder peak는 ERGO의 C=O 결합의 n-π* 전이를 나타낸다. 반면에, ITO 표면에 전착된 Au의 경우, 545 nm에서의 스펙트럼이 플라스몬(plasmon) 공명의 broadband로 특정되었다. ERGO-NP/ITO 표면의 경우, Au의 545 nm와 240 nm(π-π* 전이)에서의 흡광과 두 개의 흡광 피크가 일치했다. 290 nm(n-π* 전이)에서의 shoulder peak는 ERGO와 관계되므로, ERGO-NP/ITO 전극 표면이 형성되었음을 보여준다. 특정 파장 범위 내에서 각 피크는 명확하게 관찰되고, 가시광선 범위(Vis range)에서 측정된 Au NP에서는 broad peak가 발견되었다. 스펙트럼 분석은 전체 파장 범위에서 개질된 세가지 전극 표면의 변화를 확인하기 위해 수행되었다.
실시예 4. 라만 분석( Raman spectra )
도 4에서 보여지듯이, ERGO의 1320 cm-1 및 1550 cm-1에서 확인된 라만 분석에서 D 및 G bands와 같은 두 개의 Raman-active bands가 발견되었다. 레이저 여기(laser excitation)에 의한 Stokes 음자 에너지 변화(phonon energy shift)는 라만 분석에서 이 두 개의 피크를 만들어낸다: 주 면내 진동모드(in-plane vibrational mode) G(1550 cm-1), 면내 진동의 2차배음 D(1320 cm-1). D 밴드는 ERGO에서의 그래핀 시트의 접힘 및 잔여 산소의 존재 같은, 구조적으로 있을 수 있는 disorder 존재의 결과로 본다. G 밴드는 ERGO에서의 평면의 sp2 결합된 탄소를 나타낸다. 라만 스펙트럼에서 피크 강도의 비(ID/IG)를 통해 그래핀 옥사이드에서의 disorder의 수치를 분석할 수 있었다. "낮은" 결함 밀도(defect density) 상황에서 결함 밀도가 증가할수록 탄성산란이 더욱 증가하므로 ID/IG 값은 증가한다(ERGO의 경우 약 1.9). "높은" 결함 밀도 상황에서는 라만 피크를 축소시키는 더 많은 비정질 탄소 구조(amorphous carbon structure)로 결함 빈도가 증가하여 ID/IG값이 줄어들기 시작한다(ERGO-NP에서 약 1.2). 더욱이, 금나노입자가 함유된 ERGO 표면의 SERS 에서는 피크들을 볼 수 있었다. ITO 표면에 전착된 Au의 경우, SERS의 600 cm-1, 866 cm-1, 993 cm-1, 1200 cm-1 및 1279 cm-1에서 Au 나노구조체의 피크들을 나타내었다. 이 피크들은 ERGO-NP/ITO 표면에서도 관찰되었다. 표면에 전착된 나노입자들은 SERS 결과 입자들 사이에 많고 깊은 틈(gap)을 가지고 있는 것이 확인되었다.
실시예 5. 전기화학 임피던스 보드 선도(EIS bode plot)
HRP/ERGO-NP/ITO 전극 표면 개질과 순차적(step-wise) 개질 형성 분석을 위해 EIS 방법이 이용되었다. EIS는 전극의 계면 특성(interfacial properties)을 조사하는 효과적인 도구이다. 상기 ITO 전극 위에서 ERGO, NP, ERGO-NP 및 HRP/ERGO-NP를 각각 포함하여 ITO 전극을 개질하였다. 각 개질된 전극들의 주파수에 대한 임피던스 크기와 위상을 측정한 보드 선도를 도 5a, 5b에 나타내었다. 측정된 임피던스 스펙트럼은 Randles 회로 모델(circuit model)에 의한 특성을 나타낸다. 부유 정전용량(stray capacitance) 및 전해질용액(electrolyte solution(R s))의 옴 저항(ohmic resistance)이 관측되는 100 kHz 이상의 고주파 영역에서는 순차적 전극 표면 개질에 따른 유의미한 변화가 관찰되지 않았다. 중간(intermediate) 주파수 범위에서는 전극 계면 임피던스(interfacial impedance)의 정전용량 특성(capacitive characteristics)이 나타났는데 이는 위상상수요소(CPE)로서 모델링할 수 있다. CPE의 임피던스는 i가 허수(imaginary unit)이고 ω가 각주파수(angular frequency)일 때 1/[CPE-Tㅇ(iω) CPE-P ]이다. 100 Hz보다 낮은 주파수에서는, 개질된 전극 표면의 DET가 관여하는 확산임피던스와 전하이동저항(charge transfer resistance, R ct)이 드러난다.
단백질이 흡착된 전극의 등가 회로는 금속 평면 전극(metal planar electrode)의 전기적 특성 모델로 이용되었던 Randles 회로에 따라 설명 가능하다. Randles 회로로부터 추정된 변수들(Extrapolated parameters)을 표 1에 나타내었다. ITO(68.6 kΩ), NP/ITO(27.9 kΩ), ERGO/ITO(10.1 kΩ), 및 ERGO-NP/ITO(3.2 kΩ)의 R ct가 전극면 개질에 따라 줄어들었다. HRP/ERGO-NP/ITO 전극은 ferry/ferrocyanide가 전극 표면에 도달하는 것을 방해하는 HRP의 존재로 인한 복합된 효과 또는, R ct에 영향을 미칠 수 있는 HRP와 연계된 carboxyl/-NH 그룹의 영향으로 인해 R ct값의 미세한 증가(5.5 kΩ)가 나타났다. 또한 전도성 측정 방법(conductivity measurements)으로써, CV 측정을 통해 상기 개질 전극의 전기화학적 특성을 검출하였다. 도 5d에서 보여진 바와 같이 상기 ERGO/ITO 및 NP/ITO 전극은 산화환원 피크 전류(redox peak currents) 값을 증가시키는 것으로 나타났고 ERGO-NP/ITO은 피크 전류를 ITO에서보다 5배 증가시킴을 보였다.
Figure 112015001806533-pat00001
실시예 6. ERGO-NP/ITO 전극의 전기화학적 특성
HRP가 공유결합으로 전극면에 고정된 HRP/ERGO-NP/ITO 및 ERGO-NP/ITO 전극의 전기화학적 특성을 확인하기 위해 pH 7.0의 0.1 M PBS에서 CV 곡선을 기록하였다. 도 6에서 보이듯이, ERGO-NP/ITO 전극에서는 산화환원 피크가 명확하지 않다. 반면 HRP/ERGO-NP/ITO 전극에서는 Ag/AgCl 대비 약 50 및 120 mV 정도에서 산화환원 피크 한 쌍이 관찰되었다. 이러한 산화환원 피크는 공유결합으로 고정된 HRP에서의 (FeIII/FeII)의 전자 이동에서 기인한다. 상기 산화환원 반응의 반파전위(E1/2; E pa 및 E pc의 평균으로 지정)는 Ag/AgCl 기준 전극 대비 약 85 mV를 나타내며 산화환원 피크간 전위는 70 mV였다. 이는 합성물 레이어(composite layer)가 효소고정(enzyme immobilization)에 적합하면서 효소와 전극 사이에서 전자 이동을 돕는다는 것을 나타낸다. 일반적으로 가역반응을 특정짓기 위해 세 가지가 CV 측정으로부터 도출된다(i) 피크 전위간 간격; 모든 주사율(v), 25 ℃에서 △E p = E pc - E pa = 59/n mV; ii) 모든 v에서 피크 전류비(current ratio)는 I pa/I pc = 1; iii) 피크 전류가 ν 1/2에 비례하는 확산 지배(diffusion controlled) 공정). 따라서, 도 6b에서 보이듯이 HRP/ERGO-NP/ITO 전극에 대한 주사율 분석은 v의 범위가 0.01 내지 0.2 Vs-1일 때 pH 7.0의 10 mM PBS를 이용해 실시하였다. 이는 회귀식(regression equations)이 I pc = 2.486 X 10-9 v + 2.41 X 10-9 (R2 = 0.9985) 및 I pa = - 2.192 X 10-9 v - 2.0 X 10-9 (R2 = 0.9982)일 때, 도 6c에서 보이듯이 v에 대한 패러데이 전류(faradaic current)가 좋은 직선성(linearity)를 보였다. 추가적으로, 피크 간 전위차는 70 mV로 표면지배(surface-controlled) 준가역(quasi-reversible) 반응을 보였다. 한편, 피크전압 간격은 주사율 증가에 따라 미세하게 변경되었다. 또한, 도 6d에서 보여지듯이, Ep = f(log ν)음극과 양극 피크 전류에 대해 -2.3RT/αnF and 2.3RT/(1-α)nF인 기울기(slope)를 갖는 두 개의 직선을 각각 도출한다. 그러므로, 전하이동 계수(coefficient) α값은 아래 공식에 근거하여(k a(0.0205)는 상기 E pa = f(log ν)에서 도출되는 선의 기울기; k c(0.0217)는 상기 E pc = f(log ν)에서 도출되는 선의 기울기) 0.48로 추정된다.
Figure 112015001806533-pat00002
Ep = -RT/F ln k s 에 따르면, 전하이동 비율(electron transfer rate) 상수 k s 는 HRP/ERGO-NP/ITO 전극에서 도출된 2.21 s-1과 일치하고 또한, v 대비 I의 선형 plot에서의 기울기로부터 상기 전기화학적 활성물질(electroactive species(Γ))의 표면 농도는 HRP 몇 분자가 전자이동 프로세스에 참여하여 변성된 전극 상에 공유결합으로 흡착된 것을 나타낸 I p = n 2 F 2 AΓν/4RT의 공식에 따라 약 2.66 X 10-14 mol·cm-2으로 추측 가능하다
실시예 7. CV와 I-t 분석에 근거한 과산화수소의 검출
HRP/ERGO-NP/ITO의 H2O2 전기촉매 환원은 CV에 의하여 확인되었다(도 7a). H2O2 존재하에서 ERGO-NP/ITO 전극 상에서 관찰된 촉매 작용의 전류는 없었다. H2O2가 HRP/ERGO-NP/ITO 전극을 포함한 전기화학 cell에 추가되면, 환원 피크가 증가하고 관찰되던 산화 전류가 거의 완전히 사라지는 것을 볼 수 있었다. CV 측정결과에서 볼 수 있듯이(도 7a), 5 μL의 100 mM H2O2 부분 표본을 5 mL PBS 버퍼 용액 (10 mM) 속의 HRP/ERGO-NP/ITO에 첨가하면 음극 피크 전류가 증가함을 보이는데, 이는 개질된 전극 표면의 H2O2 환원 촉매 반응에 따른 결과이다. H2O2를 투입할 때마다 제조한 HRP/ERGO-NP/ITO 전극의 H2O2 검출에 대한 뛰어난 전자촉매 반응이 명확하게 나타난다. 전류적정(I/t)과 같은 분석적인 방법 또한 HRP/ERGO-NP/ITO 상에서 H2O2에 대한 전자촉매 반응을 설명하기 위해 실시된다.
H2O2의 전자촉매 환원 기작은 아래와 같이 설명된다.
HRP + H2O2 → Compound I + H2O
Compound I + AH2 → Compound II + AH●
Compound II + AH2 → HRP + AH● + H2O
각각 두 개 및 한 개의 전자 산화 상태(oxidation states)인 compound I 및 compound II의 위치는 자연 상태의 ferriperoxidase보다 높다. compound I은 포르피린(porphyrin) π-양이온(cation) 라디칼(radical)(FeIV = O P+)과 약하게 스핀 결합(spin-coupled)하는 ferryl(i.e. tetravalent) 이온을 포함하고 있는 것으로 알려져 있다. Compound I은 1전자(one-electron) 환원에 의해 ferryl iron center(FeIV = O)를 포함하고 있는 compound II로 붕괴한다. 더 나아가 compound II의 환원은 HRP를 휴지 상태(resting state)(FeIII)로 되돌린다. 상기 compound I에서 II로의 부식 단계는 빠르고 감지가 어려운 데 반해 compound II의 FeIII로의 변환은 더 느린 단계이다(FeIII도 FeII로 변환한다). 이는 상기 compound I가 HRP(compound II를 경유하여)로 변환 사이클에 의해 전극 표면에서 0.2 내지 -0.2 V의 전압 범위 하에서 H2O2의 환원을 검출할 수 있는 이유이다.
HRP의 완전 환원을 위해, HRP의 환원 전위보다 0.1 V 음의 전위를 설정하였다. 따라서, -0.1 V 전위를 인가하여 대시간전류 응답을 획득하였다. 낮은 working 전극 전위를 제어하는 것이 전극에서 전극활성물질로 인한 간섭을 피하거나 감소시키기에 더 바람직하다. 교정 곡선을 획득하기 위해, PBS 버퍼 용액 내에서 바이오 센서에 다양한 농도의 H2O2를 첨가한 후 산소 간섭을 피하기 위해 N2 주입과 함께 대시간전류를 기록하였다(도 7b). 응답 곡선(response curve)(도 7b)에서 삽입된 그림은 H2O2 농도가 100 μM 내지 1400 μM 사이 일 때 측정한 결과이다. 선형회귀식(linear regression equation)(y = 14.227x + 0.2753; R 2 = 0.9778)으로부터, H2O2에 대한 HRP/ERGO-NP/ITO 전극의 민감도(회귀곡선(regression curve)의 기울기/전극의 면적(πr 2; r = 0.5 mm))는 1808.9 μAmM-1cm-2로, 검출 한도는 (LOD = k X std background , k는 신호대잡음비, std background 는 기본 신호 표준 편차) 0.6 μM으로 계산된다. 이러한 검출한도는 표 2에서 보이듯이 H2O2 센서에 대한 기존의 선행문헌들이 보고하는 검출한도보다 더 낮았다. H2O2의 투입 후 반응 전류는 3초 안에 95%의 평형(steadystate) 전류에 도달하였다. 최근 3년간 HRP 기반의 H2O2 센서 연구 자료를 요약한 표 2를 보면, 본 연구결과가 더 낮은 검출 한도와 높은 민감성 및 빠른 반응시간을 나타내었다. 또한, 도 7c와 7d에서 보이듯이, 같은 양의 H2O2가 ERGO-NP/ITO 또는 ITO에(HRP/ERGO-NP/ITO를 이용하는 것과 같은 조건 하에서) 투입될 때, HRP/ERGO-NP/ITO와 비교하여 유의미한 전류의 증가는 없다. ERGO-NP/ITO 전극은 Au NP가 과산화효소의 활성을 모방할 수 있기 때문에 H2O2에 대해 반응을 보이지만 반응 전류는 안정적이지 않다. 순수 ITO 전극은 민감성이 전혀 없고 반응도 감소함을 보이며 상기 반응 또한 H2O2를 투입한 지 몇 초 안 되어 포화(saturation) 상태에 도달했다. 상기 세 개의 전극에 있어서, HRP/ERGO-NP/ITO는 안정성을 보여주고 H2O2의 환원에 있어 HRP가 H2O2에 반응하는 고유의 양상과 같이 훌륭한 민감성을 나타낸다.
Figure 112015001806533-pat00003
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실시예 8. 선택성, 안정성 및 재생가능성
선택성이란 바이오 센서의 실용적인 사용 측면에 있어 중요한 요소이다. 개발한 전극의 선택성을 평가하기 위해 0.1 mM AA, UA, 및 NaNO2와 같은 세 가지 물질을 사용하였다. 바이오 센서의 전류적정 반응 상기 언급한 방해물질(0.1 mM)과 H2O2 5 μL를 투입하면서 측정하였다(도 8). 상기 결과에 따르면 AA, UA, 또는 NaNO2에 대한 반응은 무시할만한 수준으로 HRP/ERGO-NP/ITO 바이오 센서의 높은 선택성을 나타냈다. HRP/ERGO-NP/ITO의 안정성은 변성 전극의 +0.4 내지 -0.2 V 전위 범위 내에서 연속적인 수 회 사이클링(cycling) 후 전류에 대한 반응을 관찰 후 측정하였다. 바이오 센서의 재현성은 실용적인 적용에 매우 중요하다. 본 실험에서는, 6개의 바이오 센서를 제조한 후 1.0 X 10-6 mol H2O2를 측정한 결과, 상대적인 표준 편차가 3.82%(n = 6)로 개발한 전기화학 바이오 센서가 높은 재현성을 보임을 관찰할 수 있었다. 추가적으로, 이 바이오 센서의 재사용가능성을 H2O2의 선형 범위 안에서 연구하였다. 4 ℃에서 2주 동안 보관한 후, pH 7.0의 5 mM PBS 속의 H2O2에 대한 HRP/ERGO-NP/ITO의 검출 반응 능력에는 어떤 변화도 관찰되지 않았다. 2주 후에도 상기 센서는 H2O2에 대한 초기 반응의 95 %를 유지하고 있었다. 그러므로, ERGO-NP는 더 효과적인 전자 이동과 HRP를 고정하기 위한 생체 적합 기질을 제공하는 역할을 한다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims (5)

  1. (1) 전도성 산화물(conducting oxide) 기질 상에 전압을 인가하여 흑연과 금속나노입자를 전착(electrodeposited)시키는 단계;
    (2) 상기 (1)단계에서 흑연과 금속나노입자를 전착시킨 기질을 3-메르캅토프로피온산(3-MPA)으로 활성화하여 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디미드/N-히드록시숙신이미드(EDC/NHS)용액에 담지시키는 단계; 및
    (3) 상기 (2)단계에서 3-메르캅토프로피온산(3-MPA)으로 활성화하여 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디미드/N-히드록시숙신이미드(EDC/NHS)용액에 담지시킨 기질을 호스라디시 페록시다제(HRP) 용액에 담지시키는 단계;를 포함하는, 환원된 그래핀 옥사이드와 금속나노입자의 복합체 필름 및 호스라디시 페록시다제를 포함하는 과산화수소 센서 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 (1)단계에서 전착되는 흑연은 환원된 그래핀 옥사이드인 것을 특징으로 하는, 환원된 그래핀 옥사이드와 금속나노입자의 복합체 필름 및 호스라디시 페록시다제를 포함하는 과산화수소 센서 제조방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 (1)단계에서의 전착 방법은 대시간전류법(chronoamperometry, CA)을 이용하여 전압을 인가하는 것을 특징으로 하는 환원된 그래핀 옥사이드와 금속나노입자의 복합체 필름 및 호스라디시 페록시다제를 포함하는 과산화수소 센서 제조방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 하나의 제조방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 과산화수소 센서.
  5. (1) 청구항 1항에 기재된 방법으로 제조된 과산화수소 센서를 포함하는 버퍼 용액을 준비하는 단계;
    (2) 상기 (1)단계의 버퍼 용액에 평형전위와 전위차가 -2.0 내지 +4.0 V인 전압을 가하는 단계;
    (3) 상기 (1)단계에서 혼합된 버퍼 용액에 분석하고자 하는 시료를 투입시키는 단계; 및
    (4) 상기 (2)단계에서 발생하는 전기적 신호를 측정하여 과산화수소를 확인하는 단계;를 포함하는 과산화수소 검출방법.
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