CN115201300A - 聚合离子液体-还原氧化石墨烯复合材料的制备及其在辣根过氧化物酶修饰电极上的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物传感器技术领域，公开了一种聚合离子液体‑还原氧化石墨烯复合材料及在辣根过氧化物酶修饰电极上的应用，将还原氧化石墨烯成功修饰到聚合离子液体结构上，制备了复合材料聚合离子液体‑还原氧化石墨烯(PIL‑rGO)以提升修饰电极的电化学性能。基于材料聚合离子液体与聚合离子液体‑还原氧化石墨烯制备修饰电极：PIL‑rGO‑HRP‑Nafion/GCE表现了良好的电化学行为：该电极具有高电子转移速率，较好的稳定性和选择性，并且该生物传感器对H2O2、NaNO2具有较好的分析检测性能，可应用于实际样品中H2O2、NaNO2检测。
Description
技术领域
本发明公开涉及生物传感器技术领域，尤其涉及聚合离子液体-还原氧化石墨烯复合材料的制备及其在辣根过氧化物酶修饰电极上的应用。
背景技术
过氧化氢(H2O2)作为氧化剂广泛应用于制药、临床，环境保护等行业。此外，因其具有氧化还原特性，H2O2作为介质广泛应用于生物及食品行业。然而，过量的H2O2对人体的中枢神经系统具有破坏性影响，可引起阿兹海默症，帕金森病等。因此，实现 H2O2快速、灵敏、准确、实用的分析检测具有重要的意义。
目前，应用于测定H2O2可采用色谱法、化学发光法、滴定法、分光光度法荧光法、电化学方法等。其中，电化学传感器和生物传感器因其具有高灵敏度、良好的选择性、适用实时监测、成本低、操作简单等特点被广泛应用于H2O2的分析检测。酶生物传感器在具备以上优点的同时相较于非酶传感器可有效降低工作电位，进而提高电子传递动力学以及可有效避免其他电活性物质干扰等特点被广泛关注。
近年来，探索氧化蛋白质和酶等生物大分子在生命体内的生理作用及机制，开发无媒介体的新型生物传感器受到广泛的关注。但由于存在酶大分子结构复杂，氧化还原中心被深埋等问题，酶与电极表面的直接电子转移过程难以实现。
本发明通过应用合适的修饰材料固载酶生物大分子，在保持和提高酶生物活性同时，缩短酶活性中心与电极之间的距离，对实现直接电化学具有重要意义。
发明内容
鉴于此，本发明公开提供了一种聚合离子液体-还原氧化石墨烯复合材料及在辣根过氧化物酶修饰电极上的应用，该材料应用可以表现为对H2O2、NaNO2有良好的电催化性能。
本发明提供的技术方案，具体为，一种聚合离子液体-还原氧化石墨烯复合材料的制备方法；
步骤1：制备氧化石墨烯固体粉末GO；
步骤2：将氧化石墨烯固体粉末通过超声均匀分散在去离子水中，调整溶液为碱性条件，连续搅拌条件下，向其中逐滴缓慢加入PIL溶液，继续搅拌，再加入水合肼回流反应，反应结束后，低速离心除去未参与反应的氧化石墨烯固体粉末，将所得溶液滤膜过滤并水洗，冷冻干燥，即得到黑色粉末聚合离子液体-还原氧化石墨烯复合材料 PIL-rGO。
优选地，所述氧化石墨烯固体粉末GO的制备方法为：移取33.8mL的H2SO4溶液至三口圆底烧瓶中，继续加入1.0026g高纯石墨和0.8038g硝酸钠使其充分混合，向其中缓慢加入4.5063g高锰酸钾固体，该过程圆底烧瓶置于冰水浴中；之后控制温度保持在35℃，反应0.5h；反应结束后，生成灰褐色粘稠物，反应产物在室温条件下放置一周后，用热水将其稀释至560mL，滴加3％的过氧化氢至反应溶液为亮黄色，趁热离心，反应产物依次用0.01M 的NaOH，去离子水洗涤至中性，然后用钡盐检测无白色沉淀生成，再用乙醇洗涤三次，真空干燥备用。
优选地，所述步骤2制备PIL-rGO的方法为：称取0.1g氧化石墨烯固体粉末移至盛有去离子水的圆底烧瓶中，超声至GO均匀分散在水中，用NH3·H2O调整pH值为12。连续搅拌条件下，逐滴缓慢加入7.5mg/mL的PIL溶液，继续搅拌5min，加入5mL的水合肼， 100℃条件下回流反应24h。反应结束后，低速离心除去未参与反应的氧化石墨烯固体粉末。将所得溶液滤膜过滤并水洗三次，冷冻干燥，即得到黑色粉末PIL-rGO。
所述复合材料在辣根过氧化物酶修饰电极上的应用，HRP酶固载在所述复合材料上构建电极PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE。
优选地，所述构建电极PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE包括如下步骤：
1)电极预处理，得到GCE电极
2)配置PIL-rGO-HRP-Nafion混合溶液：准确称取0.3mg的PIL-rGO复合材料分散在盛有1mL去离子水的离心管中，超声10min，漩涡5min至PIL-rGO均匀分散，加入等体积的9mg/mL的HRP的PBS溶液，继续超声漩涡至溶液均匀混合后，向混合液中加入同样体积的质量百分含量为1％的Nafion溶液，漩涡至混合液均匀分散，得到PIL-rGO-HRP-Nafion混合溶液；其中PBS溶液的浓度为0.1M，pH＝7；
3)移取7μL的PIL-rGO-HRP-Nafion混合液垂直滴涂于GCE电极，4℃条件下隔夜干燥成膜，制备得到电极PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE。
优选地，电极PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE应用在H2O2、NaNO2电催化及分析检测方面。
本发明提供的一种聚合离子液体-还原氧化石墨烯复合材料及在辣根过氧化物酶修饰电极上的应用，将还原氧化石墨烯成功修饰到聚合离子液体结构上，制备了复合材料聚合离子液体-还原氧化石墨烯(PIL-rGO)以提升修饰电极的电化学性能。电极 PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE具有高电子转移速率，较好的稳定性和选择性，并且该生物传感器对H2O2、NaNO2具有较好的分析检测性能，可应用于实际样品中H2O2、NaNO2检测。
应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本发明的公开。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明公开实施例提供的还原氧化石石墨烯rGO分散在水中图片a，聚合离子液体-还原氧化石墨烯PIL-rGO分散在水中图片b，聚合离子液体-还原氧化石墨烯PIL-rGO水溶液的Zeta电位图c；
图2为本发明公开实施例提供的聚合离子液体-还原氧化石墨烯的TEM照片；
图3为本发明公开实施例提供的PIL-rGO a、HRP bPIL-rGO-HRP c的紫外- 可见吸收光谱图；
图4为本发明公开实施例提供的HRP a、PIL-rGO-HRP b的红外光谱对比谱图；
图5为本发明公开实施例提供的在含有5mM Fe(CN)6 3-/4-，0.1M KCl的支持电解液中修饰电极Bare/GCE、PIL/GCE、PIL-rGO/GCE、PIL-rGO-HRP/GCE的阻抗图谱；其中交流振幅：5mV，频率范围：0.1Hz-100 KHz；
图6为本发明公开实施例提供的PIL-Nafion/GCE(a)、PIL-rGO-Nafion/GCE(b)、PIL-HRP-Nafion/GCE(c)、PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE(d)在pH＝7的0.1M PBS溶液(N2饱和)中的循环伏安曲线图；扫描速率：200mV/s；
图7为本发明公开实施例提供的A扫描速率为100mV/s-800mV/s时 PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE电极在pH＝7的0.1M PBS溶液(N2饱和)中的循环伏安曲线图；B表示阴阳极峰值电流与扫速的关系；
图8为本发明公开实施例提供的APIL-rGO-HRP-Nafion/GCE电极在pH＝7的0.1MPBS溶液(N2饱和)中pH由5.5到8的循环伏安曲线图；B式电位与pH值的关系，扫描速率：200mV/s；C还原峰电流与pH值得关系图；
图9为本发明公开实施例提供的A PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE电极在pH＝7的0.1MPBS溶液(N2饱和)中50个循环伏安曲线，扫描速率：200mV/s；B扫描圈数与峰值电流的关系图；
图10为本发明公开实施例提供的PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE电极在pH＝7的0.1MPBS 溶液(N2饱和)中含有0μM，100μM，300μM的H2O2的循环伏安曲线，扫描速率：200mV/s；
图11为本发明公开实施例提供的A PIL-HRP-Nafion/GCE(a)；PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE(b)电极在pH＝7的0.1M PBS溶液(N2饱和)中连续添加不同浓度的H2O2的安培响应曲线，工作电位：-0.35V；B电催化电流与H2O2浓度的变化曲线；
图12为本发明公开实施例提供的PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE电极在pH＝7的0.1MPBS 溶液(N2饱和)中连续加入0.1mM H2O2，1mM Glu，1mM AA，1mM UA，1mM DA和 0.1mM H2O2的安培响应曲线，工作电位：-0.35V；
图13为本发明公开实施例提供的PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE电极在含有100μM H2O2的pH＝7的0.1M PBS溶液(N2饱和)中第一天和储存10天电流响应柱状图；
图14为本发明公开实施例提供的PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE电极在pH＝7的0.1MPBS溶液(N2饱和)中含有0mM，100mM，200mM，500mM，1000mM的NaNO2的循环伏安曲线，扫描速率：200mV/s；
图15为本发明公开实施例提供的A PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE电极在pH＝7的0.1MPBS溶液(N2饱和)中连续添加不同浓度的NaNO2的安培响应曲线，工作电位：-0.75V；B电催化电流与NaNO2浓度的变化曲线。
具体实施方式
这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本发明相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本发明的一些方面相一致的系统的例子。
为解决现有技术中，酶与电极表面的直接电子转移过程难以实现等问题，本实施方案提供了一种聚合离子液体-还原氧化石墨烯复合材料及其在辣根过氧化物酶修饰电极上的应用，聚合离子液体(PIL)是由离子液体单体聚合而成的聚合物。PIL同时具备离子液体和聚合物的优点，如较高的离子导电性，热稳定性，和优异的机械性能；PIL作为一种新型的高分子材料，近年来，在生物电化学领域得到广泛应用，并且PIL可作为各种纳米材料合成和功能化的有效稳定剂和载体。
石墨烯(GO)是由sp2杂化碳原子形成共价键构成的，一种典型的二维碳基纳米材料。具有大的比表面积，电化学窗口宽，电荷转移电阻小，电催化活性高等电化学特性。由于GO特殊的结构及优异的物理和化学性能，在生物电化学领域受到高度关注，得到了广泛的应用。然而，石墨烯纳米层间存在强烈的范德华力和π-π键相互作用，易发生不可逆的聚集，从而丧失其单层二维纳米片的独特结构，减少其表面积。此外，GO表面具有疏水性，阻碍了与水溶性大分子的作用，限制其在生物电化学领域的应用。而本实施方案中还原氧化石墨烯(rGO)在制备过程中，通过共价或非共价相互聚合作用，生成具有大量羟基，羧基等官能团的产物。即rGO不仅保持了GO的固有性质，还增加了石墨烯表面的电荷密度，促进了GO在水介质中的稳定分散；
本实施方案成功合成了复合材料聚合离子液体-还原氧化石墨烯(PIL-rGO)，该复合材料兼具石墨烯高导电性及聚合离子液体良好成膜性、生物相容性等特性。应用材料PIL-rGO实现HRP酶成功固载，制备得到PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE生物传感器，并发现该电极的直接电化学行为，以及对H2O2、NaNO2电催化性能表现优异的性能。
具体，本实施方案提供一种聚合离子液体-还原氧化石墨烯复合材料的制备方法，包括：
步骤1：制备氧化石墨烯固体粉末GO；移取33.8mL的H2SO4溶液至三口圆底烧瓶中，继续加入1.0026g高纯石墨和0.8038g硝酸钠使其充分混合，向其中缓慢加入4.5063 g高锰酸钾固体(该过程圆底烧瓶置于冰水浴中)。之后控制温度保持在35℃，反应0.5 h。反应结束后，生成灰褐色粘稠物。反应产物在室温条件下放置一周后，用热水将其稀释(560mL)，滴加3％的过氧化氢至反应溶液为亮黄色，其目的消除剩余高价锰离子。趁热离心，反应产物依次用0.01M的NaOH，去离子水洗涤至中性。然后用钡盐检测无白色沉淀生成，再用乙醇洗涤三次，真空干燥备用。
步骤2制备PIL-rGO的方法为：称取0.1g氧化石墨烯固体粉末移至盛有去离子水的圆底烧瓶中，超声至GO均匀分散在水中，用NH3·H2O调整pH值为12。连续搅拌条件下，逐滴缓慢加入7.5mg/mL的PIL溶液(PIL制备方法同2.4.1)，继续搅拌5min，加入5mL 的水合肼，100℃条件下回流反应24h。反应结束后，低速离心除去未参与反应的氧化石墨烯固体粉末。将所得溶液滤膜过滤并水洗三次，冷冻干燥，即得到黑色粉末PIL-rGO。
其中，聚合离子液体的合成由单体1-乙烯基-3-乙基咪唑溴盐常规的自由基聚合方法合成PIL。将10g的单体与0.2g偶氮二异丁腈完全溶解于50mL氯仿中。向该混合液通30min N2，确保该溶液在饱和氮气，60℃条件下回流反应5h。聚合反应后，待反应溶液冷温度达到室温，用氯仿洗涤数次，70℃真空干燥后，得到黄白色固体PIL。
应用上述复合材料在电化学中的应用，HRP酶固载在所述复合材料上构建电极PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE。
其中，构建电极PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE包括如下步骤：
1)电极预处理：不同粒径的氧化铝粉末打磨抛光玻碳电极，去离子水冲洗，再分别用去离子水，乙醇，去离子水超声清洗。应用循环伏安法测定GCE在电极检测液中的峰位差小于 70mV时，达到清洗标准，N2吹干，备用。
2)配置PIL-rGO-HRP-Nafion混合溶液：准确称取0.3mg的PIL-rGO复合材料分散在盛有1mL去离子水的离心管中，超声10min，漩涡5min至PIL-rGO均匀分散，加入等体积的9mg/mL的HRP的PBS溶液，继续超声漩涡至溶液均匀混合后，向混合液中加入同样体积的质量百分含量为1％的Nafion溶液，漩涡至混合液均匀分散，得到PIL-rGO-HRP-Nafion混合溶液；其中PBS溶液的浓度为0.1M，pH＝7；
3)移液枪移取移取7μL的PIL-rGO-HRP-Nafion混合液垂直滴涂于GCE电极，4℃条件下隔夜干燥成膜，制备得到电极PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE。
为了对比本实施方案提供的电极PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE在H2O2、NaNO2电催化及分析检测方面表现出优异性能，按照上述同样方法，本实施方案还制备得到了PIL-Nafion/GCE、 PIL-rGO-Nafion/GCE、PIL-HRP-Nafion/GCE修饰电极。
首先如图1所示，为对上述聚合离子液体-还原氧化石墨烯复合材料的Zeta表征，还原氧化石石墨烯rGO分散在水中图片a，聚合离子液体-还原氧化石墨烯PIL-rGO分散在水中图片 b，聚合离子液体-还原氧化石墨烯PIL-rGO水溶液的Zeta电位图c，从图3中的a线、b线中可知，rGO在水中溶解性较差，不能均匀分散，通常聚集在溶液底部。复合材料PIL-rGO为黑色悬浊液，在一定时间内悬浊液保持稳定，这说明PIL的存在赋予了复合材料聚合离子液体-还原氧化石墨烯溶液良好的稳定性和分散性。图c中为PIL-rGO在中性水溶液中的Zeta 电位图，Zeta电位值为10.6mV，证明了rGO被成功修饰在PIL表面上。
如图2所示，聚合离子液体-还原氧化石墨烯复合材料的TEM表征，通过TEM进一步考察了PIL-rGO的表面形貌。从图中可得复合材料PIL-rGO为超薄透明单层状结构，边缘清晰。合成的PIL-rGO存在较少的不可逆团聚，具有良好的稳定性。
如图3所示为固载后PIL-rGO-HRP复合物的表征，通过紫外-可见吸收光谱分析，讨论了HRP在纳米复合材料膜中的包埋情况。其中血红素Soret吸收带的位置可有效判断HRP固载前后酶结构是否发生变化。从图3可以看到，游离的HRP(曲线b)在402nm处存在特征吸收带，归属于血红素的典型的Soret带。曲线a中，在波长范围内材料PIL-rGO没有出现任何吸收带，材料PIL-rGO固定HRP后(曲线c)，在曲线a相同位置出现特征吸收峰。由此说明HRP与材料结合后未发生酶蛋白变性，保持其生物结构。
如图4所示为HRP(a)、PIL-rGO-HRP(b)的FT-IR光谱图。从图中可知，PIL-rGO-HRP(b)光谱曲线上出现了位于1232cm-1，1151cm-1分别归属于rGO的C-O-C的伸缩振带，PIL 咪唑环上C-N伸缩振动的特征峰，并且在1536cm-1、1657cm-1存在归属于HRP(曲线a) 的酰胺I(C＝O)和II(N-H)红外特征吸收峰。因此，进一步证明了酶生物大分子被成功固载同时，酶的结构保持完好。
如图5所示为探究所制备的不同种修饰电极电极界面的电化学性质，在含有5mMFe(CN)6 3-/4-，0.1M KCl的支持电解液中检测各修饰电极的阻抗。裸电极Bare/GCE的电荷转移阻力值为83.32ohm、PIL/GCE(23.28ohm)、PIL-rGO/GCE(3.012ohm)电极的电荷转移电阻值明显小于裸电极，说明材料PIL、PIL-rGO具有良好电子传输性。其中电极PIL-rGO/GCE 的电阻值明显减小为3.012ohm，这是由于材料rGO具有独特的单层二维纳米片结构为电子转移提供足够的空间以及超高导电性降低了界面电阻，电导率明显增大的结果。PIL-rGO-HRP/GCE的阻抗曲线结果可知，相对于PIL-rGO/GCE其Rct值明显增大至51.3ohm，这是由于酶生物大分子在电极表面具有较弱的导电性，导致界面电阻明显增加，也进一步证明了HRP 被成功包埋在纳米材料复合膜中。
从图6可以得知，在0.2～-0.8V电位扫面范围内，材料电极PIL-Nafion/GCE(黑色曲线)、 PIL-rGO-Nafion/GCE(红色曲线)不存在氧化还原峰，不具有电化学活性。 PIL-HRP-Nafion/GCE(蓝色曲线)、PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE(绿色曲线)均观察到一对的氧化还原峰，归属于HRP氧化还原活性中心FeⅢ/FeⅡ特征峰，即实现了HRP的直接电化学。电极PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE氧化还原峰电流值明显增大，说明了PIL-rGO可有效促进HRP 与电极表面之间的直接电子转移过程。
由图可得Epa1＝-0.267V、Epc1＝-0.325V，Epa2＝-0.307V、Epc2＝-0.345V分别为修饰电极PIL-HRP-Nafion/GCE，PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE的氧化还原峰电位，峰位差和式电位可通过计算得知，在表1显示了PIL-HRP-Nafion/GCE、PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE电极的峰电流，峰位差及式电位。通过比较得知，电极PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE峰值电流得到明显的提升，氧化还原峰值电流比更接近1，峰位差较小，则PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE具有良好的电化学可逆性。
表1修饰电极PIL-HRP-Nafion/GCE、PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE的峰电流，峰位差及式电位的比较
根据法拉第定律Q＝nFAΓ*，Q：反应消耗的电量；Γ*：表面覆盖量；n：电子转移数，这里取1；F为法拉第常数96493；A：电极面积[111]。计算得到PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE电极HRP的表面覆盖度为1.12×10-11mol/cm2，远高出HRP的理论表面单层覆盖率约8.5×10-12mol/cm2，这说明PIL-rGO材料适合固定HRP制备修饰电极。
如图7所示为扫面速率对固定化HRP的直接电化学行为的影响。扫描范围由100mV/s 增加至800mV/s时，氧化还原峰电流与扫面速率呈正相关关系，即峰值电流随扫速的增加而增大。此外，在扫描速率范围内，氧化还原峰值电流与扫面速率存在良好的线性关系，线性方程为Pic：y＝0.0063x+0.2011，R2＝0.999；Pia：y＝-0.0060x-0.1436，R2＝0.998，可以得出电极反应为表面控制过程。
计算nΔEp＝38mV，满足nΔEp＜200mV，所以HRP在电极上的反应为完全准可逆过程。应用Laviron理论计算得到ks为8.68s-1，说明制备的电极能促进HRP与电极之间的电子转移。
由于pH对酶活性有很大的影响，所以电解质溶液的pH对生物传感器性能至关重要。通过调节磷酸二氢钠与磷酸氢二钠混合的比例调整PBS缓冲溶液的pH值分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，测得不同pH值条件下电极PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE的循环伏安曲线图如图 8A所示，均有一对明确的氧化还原峰，pH值的增加引起阴阳极峰值电位的负移，证明有质子参与到HRP(FeⅢ/FeⅡ)氧化还原反应中。图8B显示在电解质溶液pH范围在5.0～8.0内， pH与PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE电极式电位存在良好的线性关系，斜率为-57.7mV/pH，与可逆质子耦合单电子转移过程的预期理论值-57.6mV/pH相近，表明HRP电极反应为典型的单质子化过程。图8C中，响应电流在pH为7时得到最大值，结果表明HRP在中性pH溶液中具有较高的活性。
如图9所示，在pH＝7的0.1M PBS溶液连续扫描50个循环伏安曲线来检测修饰电极PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE的稳定性。结果表明连续扫描后，电极PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE氧化还原峰位置未发生明显偏移，氧化还原峰电流变化在2％内，因此，该电极具有良好的稳定性。
图10为电极PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE在含有不同浓度H2O2的电解质溶液中的循环伏安曲线图。从图中可知，在pH为7的0.1M PBS溶液电极PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE存在一对可逆的氧化还原峰。随着H2O2的加入，氧化峰电流明显减小，还原峰电流明显增加，证明材料PIL-rGO固定化HRP对H2O2均发生电催化还原，反应原理可以表述为：在H2O2存在时， H2O2与HRP(Fe2+)反应，生成HRP(Fe3+)，由于HRP与电极之间发生直接电子转移，HRP (Fe3+)在电极上继续被还原。
对PIL-HRP-Nafion/GCE、PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE电极催化H2O2的定量检测进行了对比考察。结果如图1所示，加入H2O2后，修饰电极的响应电流瞬间增大， PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE电极电流增大明显大于PIL-HRP-Nafion/GCE电极，表明底物在修饰电极PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE的复合膜中快速扩散，具有较高的灵敏度。这是由于 PIL-rGO复合材料结合了rGO高导电性和大比表面积以及PIL生物相容性为HRP的固定提供合适的微环境；结合图11B可进一步得出：与PIL-HRP-Nafion/GCE电极相比， PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE电极具有更好的电催化性能。
图11B中显示浓度在19.29μM～1100μM范围内，PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE电极具有良好的线性关系，线性方程为：y＝0.0140x+0.6104，R2＝0.991。计算得到电极检测H2O2灵敏度为0.2μA·μM-1·cm-2，检出限为6.43μM。
常见的干扰物质对修饰电极PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE检测H2O2的影响如图12所示。可以看出，在加入H2O2时，响应电流明显增大，即使加入高于H2O2浓度的干扰物质，干扰物质对响应电流未观察到明显变化。因此，PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE电极具有良好的选择性，抗干扰性。
对电极PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE对H2O2催化储存稳定性进行了考察。结果如图13，将 PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE电极在4℃条件下保存10天，在相同条件下测定电极对H2O2电催化信号。电极响应电流仍可达到第一天响应电流的93.99％，表明该电极具有良好的重现性。
表2 PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE电极在人造血浆实际样品中检测H2O2
表2中应用标准添加法测定模拟人造血浆样品中H2O2的浓度，以探究所制备的生物传感器PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE应用实际样品检测中的可行性。实验结果为：检测H2O2回收率在96％至110％之间。所得结果表明，开发的生物传感器适用于分析实际样品中的H2O2。
基于电极PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE对H2O2表现出良好的电催化性能，进一步考察了该电极对不同底物电催化性能。
众所周知，亚硝酸钠(NaNO2)是一种有毒物质，广泛存在于污水和防腐食品中，亚硝酸盐的检测在生物化学和环境化学领域具有重要意义。因此，本实施方案中应用 PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE电极对NaNO2进行检测。
如图14电极PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE在不同浓度的NaNO2条件下的循环伏安曲线图。 NaNO2浓度由0mM增加至1000mM时，氧化峰电流逐渐减小，在-0.765V出现还原峰，还原峰电流与NaNO2浓度呈正相关关系，表明PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE对NaNO2发生电催化作用。
图15为PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE电极在连续添加NaNO2的pH＝7的缓冲溶液中的电流-时间响应图。当加入NaNO2后，响应电流呈上升趋势。在5.16～1300mM浓度范围内，NaNO2与响应电流呈良好的线性关系，线性回归方程为：y＝0.0523x+3.619，R2＝0.993，其中x和y分别代表NaNO2的浓度(mM)和还原峰电流。由校准曲线得斜率可知该电极检测 NaNO2得灵敏度为通过计算可得修饰电极得灵敏度为0.75μA·mM-1·cm-2，通过计算可知修饰电极得检出限为1.72mM。
为证明该修饰电极检测NaNO2得实际应用性，应用循环伏安法测定火腿肠中NaNO2的含量，并用加标回收率的方法检测回收率，如表3所示，该方法检测NaNO2回收率在107％～ 110％之间，具有在实际样品中检测NaNO2的潜能。
表3 PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE电极在火腿肠实际样品中检测NaNO2
本实施方案中，首先成功合成了PIL-rGO纳米复合材料。通过Zeta电位和TEM技术对合成材料的表面电荷性质和结构形貌进行了表征。进而应用紫外、红外光谱对酶HRP固载前后结构是否发生变化进行表征。成功制备修饰电极PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE，对其直接电化学行为，电化学动力学、稳定性进行了考察。在此基础上，进一步考察了修饰电极的对H2O2， NaNO2的分析检测性能。上述结果证明：电极PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE具有良好的抗干扰性及重现性，对H2O2、NaNO2具有良好的电催化性能，表现出较宽的线性范围，高灵敏度，低检出限，并且PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE电极对实际样品中检测H2O2，NaNO2具有良好的分析检测性能。
本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的发明后，将容易想到本发明的其它实施方案。本申请旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本发明的一般性原理并包括本发明未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本发明的真正范围和精神由权利要求指出。
应当理解的是，本发明并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本发明的范围仅由所附的权利要求来限制。
Claims (6)
1.一种聚合离子液体-还原氧化石墨烯复合材料的制备方法，其特征在于，包括：
步骤1：制备氧化石墨烯固体粉末GO；
步骤2：将氧化石墨烯固体粉末通过超声均匀分散在去离子水中，调整溶液为碱性条件，连续搅拌条件下，向其中逐滴缓慢加入PIL溶液，继续搅拌，再加入水合肼回流反应，反应结束后，低速离心除去未参与反应的氧化石墨烯固体粉末，将所得溶液滤膜过滤并水洗，冷冻干燥，即得到黑色粉末聚合离子液体-还原氧化石墨烯复合材料PIL-rGO。
2.根据权利要求1所述的一种聚合离子液体-还原氧化石墨烯复合材料的制备方法，其特征在于，所述氧化石墨烯固体粉末GO的制备方法为：移取33.8mL的H2SO4溶液至三口圆底烧瓶中，继续加入1.0026g高纯石墨和0.8038g硝酸钠使其充分混合，向其中缓慢加入4.5063g高锰酸钾固体，该过程圆底烧瓶置于冰水浴中；之后控制温度保持在35℃，反应0.5h；反应结束后，生成灰褐色粘稠物，反应产物在室温条件下放置一周后，用热水将其稀释至560mL，滴加3％的过氧化氢至反应溶液为亮黄色，趁热离心，反应产物依次用0.01M的NaOH，去离子水洗涤至中性，然后用钡盐检测无白色沉淀生成，再用乙醇洗涤三次，真空干燥备用。
3.根据权利要求1所述的一种聚合离子液体-还原氧化石墨烯复合材料的制备方法，其特征在于，所述步骤2制备PIL-rGO的方法为：称取0.1g氧化石墨烯固体粉末移至盛有去离子水的圆底烧瓶中，超声至GO均匀分散在水中，用NH3·H2O调整pH值为12。连续搅拌条件下，逐滴缓慢加入7.5mg/mL的PIL溶液，继续搅拌5min，加入5mL的水合肼，100℃条件下回流反应24h。反应结束后，低速离心除去未参与反应的氧化石墨烯固体粉末。将所得溶液滤膜过滤并水洗三次，冷冻干燥，即得到黑色粉末PIL-rGO。
4.根据权利1-3所述复合材料在辣根过氧化物酶修饰电极上的应用，其特征在于，HRP酶固载在所述复合材料上构建电极PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE。
5.根据权利要求4所述的复合材料在辣根过氧化物酶修饰电极上的应用，其特征在于，所述构建电极PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE包括如下步骤：
1)电极预处理，得到GCE电极
2)配置PIL-rGO-HRP-Nafion混合溶液：准确称取0.3mg的PIL-rGO复合材料分散在盛有1mL去离子水的离心管中，超声10min，漩涡5min至PIL-rGO均匀分散，加入等体积的9mg/mL的HRP的PBS溶液，继续超声漩涡至溶液均匀混合后，向混合液中加入同样体积的质量百分含量为1％的Nafion溶液，漩涡至混合液均匀分散，得到PIL-rGO-HRP-Nafion混合溶液；其中PBS溶液的浓度为0.1M，pH＝7；
3)移取7μL的PIL-rGO-HRP-Nafion混合液垂直滴涂于GCE电极，4℃条件下隔夜干燥成膜，制备得到电极PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE。
6.根据权利要求4所述的复合材料在辣根过氧化物酶修饰电极上的应用，其特征在于，电极PIL-rGO-HRP-Nafion/GCE应用在H2O2、NaNO2电催化及分析检测方面。
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