KR20060048066A - 질산염 이온 검출용 바이오센서 및 이를 이용한 측정 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 질산염 이온 검출용 바이오센서 및 이를 이용한 측정방법에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 질산염 환원효소(NaR)를 표면에 갖는 작동 전극과 기준 전극 및 상대 전극을 갖는 바이오센서 및 이를 이용하여 시료 중의 질산염 농도를 측정하는 방법에 관한 것이다. 또한, 질산염이 아닌 질소 화합물을 질산염으로 전환시킴으로써 총질소의 농도를 측정할 수 있게 하는 질산염 이온화 반응기에 관한 것이다.

본 발명에 의해 제조된 일회용 질산염 이온 검출용 바이오센서는 전기화학적 방법을 사용하여 질산염 이온의 정확한 농도를 현장에서 편리하게 측정할 수 있다. 또한 구조와 제작비용이 저렴하고 휴대가 가능하기 때문에 기존의 측정제품과 차별성이 있고 가격 경쟁력도 크다.

본 발명의 질산염 이온화 반응기는 질산염이 아닌 질소 화합물을 편리하게 질산염으로 전환시키는 장치로서 상기 질산염 이온화 반응기와 상기 질산염 이온 검출용 바이오센서와 결합하면 시료 내의 총질소를 편리하게 측정할 수 있다.

Description

질산염 이온 검출용 바이오센서 및 이를 이용한 측정 방법{Biosensor for detecting nitrate ion and measuring method using the same}

도 1 은 본 발명의 일실시예로서 바이오센서의 감지전극 제작에 사용한 일회용 전극 모형도이다.

도 2 는 본 발명의 스트립상의 전극을 제조하기 위한 통상의 스크린-프린팅 방법을 나타낸 순서도이다.

도 3은 본 발명의 바이오센서의 질산염환원효소의 촉매작용을 순환전압전류법으로 나타낸 그래프이다.

도 4는 본 발명의 바이오센서의 최적 PVA농도를 나타낸 그래프이다.

도 5 은 본 발명의 바이오센서의 질산염환원효소의 최적 고정화 양을 나타낸 그래프이다.

도 6는 본 발명의 바이오센서의 최적 pH를 나타낸 그래프이다.

도 7는 본 발명의 바이오센서의 최적 버퍼 (MOPS) 농도를 나타낸 그래프이다.

도 8은 본 발명의 바이오센서의 최적 전자전이매개체 (MV, methyl viologen) 농도를 나타낸 그래프이다.

도 9는 CV를 이용하여 산소제거제의 농도에 따른 전류의 변화를 측정한 결과 를 나타낸 그래프이다.

도 10은 본 발명의 바이오센서의 최적 산소제거제 (아황산염) 농도를 나타낸 그래프이다.

도 11은 본 발명에 바이오센서의 질산염농도에 따른 검정곡선 (calibration curve)을 나타낸 그래프이다.

도 12는 본 발명의 질산염 이온화 반응기의 일구현예의 사시도 및 하부 전극 구조의 평면도이다.

도 13은 본 발명의 질산염 이온화 반응기를 운영하기 위한 탈착식 전원공급장치 및 반응시간을 조절할 수 있는 타이머 일체형의 장치를 나타낸 모식도이다.

도 14는 질산염이 아닌 질소화합물의 질산염 이온화 정도를 반응시간에 따라 나타낸 그래프이다.

도 15는 질산염이 아닌 질소화합물의 질산염 이온화 정도를 가해준 전압에 따라 나타낸 그래프이다.

도 16은 전기화학적 접촉 촉매산화 반응에 의해 암모늄염 이온이 질산염 이온으로 산화되는 과정을 개념적으로 나타낸 개념도이다.

도 17은 전기화학적 접촉 촉매산화 반응에 의해 유기 질소 화합물이 암모니아로 전환되는 과정을 개념적으로 나타낸 개념도이다.

<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>

1 : 시료 주입구

2 : 상대 전극

3 : 작동 전극

4 : 기준 전극

5 : 절연층

6 : 리드선

7 : 리드 단자

본 발명은 질산염 이온 검출용 바이오센서 및 이를 이용한 측정방법에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 편리하게 휴대하면서 정확하게 시료 내의 질산염 이온의 농도를 측정할 수 있는 바이오센서 및 이를 이용한 질산염 이온 농도의 측정방법에 관한 것이다. 또한, 질산염이 아닌 질소 화합물을 질산염으로 전환시킴으로써 총질소의 농도를 측정할 수 있게 하는 질산염 이온화 반응기에 관한 것이다.

바이오센서(biosensor)는 생체 물질이 전자측정기기와 유기적으로 결합되어 임의 시료내의 화학적 정보를 쉽게 처리가능한 전기적인 신호로 바꾸어주는 센서를 말한다. 상기 바이오센서는 복잡한 화학적, 생물학적 처리를 할 필요가 없이 실시간으로 원하는 화학종의 정량적 정보를 선택적으로 얻을 수 있다는 장점 때문에 널리 개발되고 있으며, 주로 의학, 환경 분야에서 널리 사용되고 있다.

질산염(nitrate) 이온은 널리 알려진 수질오염 물질의 하나이다. 질산염 이온에 의한 광범위한 오염은 환경 및 인체건강에 대하여 심각한 위협이 되고 있다. 따라서 질산염 이온의 분석은 매우 중요하다. 장기간 높은 농도의 질산염을 섭취하면 소화계통의 암을 유발 할 수 있는 가능성이 매우 높다. 많은 나라에서는 식수 중의 질산염 최고 농도를 400 내지 800 μM 로 규정하고 있고, 미국 환경보호국 (EPA)에서는 700 μM 까지 규정하고 있다. 질산염 이온의 화학적 측정은 주로 크게 3가지 방법이 있는데, 직접측정법에서는 비색 분석(colorimetry), 이온-선택 전극(ion-selective electrode), 이온 크로마토그래피(ion chromatography)등이 있고; 간접측정법에서는 폴라로그래피(polarography) 등이 있고; 그리고 질산염을 아질산염, 암모니아, 또는 질소산화물 등으로 환원한 후 측정하는 방법이 있다 (Sah, R. N. Commun. Soil Sci. plant Anal. 1994, 25, 2841). 이런 방법들은 특이성이 떨어져서 많은 이온들이 방해작용을 한다. 따라서 측정하기 전에 전처리 과정이 필요함으로서 불편하고 시간이 많이 요구된다.

위에서 언급한 화학적 측정방법 외에 바이오센서 방법으로도 질산염이온을 측정할 수 있다. 바이오센서 방법은 효소의 특이성 및 민감성과 광학적, 전기화학적 및 열분석방법 등의 민감성이 결합되었기 때문에 의료 및 환경분야에서 특히 효과적이다. 바이오센서 방법은 화학적 방법에 비해 장치의 제작이 간단하고, 경제적이고, 사용이 편리하고, 시료의 전처리 과정이 필요 없어 분석시간을 크게 줄일 수 있는 장점이 있다. 질산염 환원효소(nitrate reductase, 이하 NaR로 약칭)를 사용한 바이오센서로 질산염 이온을 측정한 논문들이 발표되었지만, 그다지 활발하게 연구되고 있지는 않다.

미국특허 제5,776,715호는 질산염 이온을 광학적 방법으로 검출하는 바이오 센서를 개시하고 있다. 상기 바이오센서에 포함된 NaR에 의해 질산염이온이 환원되면 NADPH가 NADP⁺로 산화되면서 직접 또는 간접적으로 광발광제(photoluminescent)가 광자(photons)를 생성하게 되고 이를 광검출기(photodetector)로 검출한다. 그러나, 상기 광학적 방법은 적당한 발광제를 찾아야만 하고, 주위환경의 빛의 방해를 받으며, 발광시약의 양에 의존하기 때문에 작게 만들기에는 곤란하고, 광검출기에서 광신호를 다시 검출가능한 전기신호로 바꾸어야 하는 문제점이 있다.

NaR을 이용한 질산염 이온의 전류법적 측정이 1994년에 처음으로 발표되었으나 (S., Cosnier, Innocent, C. and Jouanneau, Y., Anal. Chem. 1994, 66, 3198), NaR이 환원반응을 매개하기 때문에 산소의 영향을 많이 받았으며, 지금까지의 논문에서는 산소의 방해를 줄이기 위해 알곤 (Argon)상에서 일반전극 (conventional electrodes)을 사용하여 실험실에서 측정하였다. 지금까지 발표된 질산염 이온 측정에 관한 바이오센서 방법 중에서는 실험실이 아닌 현장에서 바로 사용가능한 전류법 측정용 센서는 아직까지 보고된 바 없다. 질산염 이온의 전류법 현장 측정용 센서의 최대 난점은 어떻게 산소의 방해를 줄일 것인가 하는 것이다.

또한, 실제 현장에서 사용하는 경우에 있어서 가장 중요한 용도는 질산염만의 농도를 측정하기보다는 전체 질소 화합물의 양, 즉 총질소 양을 측정하는 것이다. 그러나, 전체 질소 화합물의 양을 측정하기 위한 종래 기술에 의한 장치는 장시간에 걸친 전처리와 복잡한 분석과정을 필요로 하는 실험실 규모의 장치이기 때문에 현장에서 즉시 모니터링할 수 없는 단점이 있었다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래 기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 질산염 환원효소를 고정화시킨 고정된 작동(working) 전극, 작동 전극 주위에 상대(counter) 전극 및 기준(reference) 전극이 스크린-프린팅(screen-printing) 기술로 배열된 3개 전극의 바이오센서에 산소제거제가 포함된 시료를 적용하는 경우, 현장에서 질산염 이온을 간편하게 전기화학적으로 검출할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다. 또한, 질산염이 아닌 질소화합물을 질산염으로 용이하게 전환시키는 질산염 이온화 반응기를 개발하고 이것을 상기 바이오센서와 적절히 결합함으로써 종래 기술이 갖는 상기 문제점을 해결할 수 있음을 확인하였다.

본 발명이 이루고자 하는 첫 번째 기술적 과제는 질산염 이온의 농도를 현장 모니터링 할 수 있는 질산염 이온 검출용 바이오센서를 제공하는 것이다.

본 발명이 이루고자 하는 두 번째 기술적 과제는 질산염이 아닌 질소화합물을 간편하게 질산염으로 전환시킬 수 있는 질산염 이온화 반응기를 제공하는 것이다.

본 발명이 이루고자 하는 세 번째 기술적 과제는 총질소의 농도를 현장 모니터링 할 수 있도록 간편하게 측정할 수 있는 총질소 농도 측정 시스템을 제공하는 것이다.

본 발명이 이루고자 하는 네 번째 기술적 과제는 상기 질산염 이온 검출용 바이오센서를 이용하여 질산염 이온 농도를 측정하는 측정 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기 첫 번째 기술적 과제를 이루기 위하여, 작동(working) 전극과, 이와 일정간격 이격된 상대(counter) 전극 및 기준(reference) 전극이 배열된 바이오 센서에 있어서, 상기 작동 전극이 질산염 환원효소(nitrate reductase)가 고정된 탄소 전극으로서 시료에 포함된 질산염 이온이 상기 질산염 환원효소에 의해 환원반응되는 정도를 전기화학적으로 측정하는 것을 특징으로 하는 질산염 이온 검출용 바이오센서를 제공한다.

본 발명은 상기 두 번째 기술적 과제를 이루기 위하여, 반응조와; 상기 반응조에 잠기는 적어도 하나 이상의 산화 티타늄(TiO₂) 전극과; 상기 반응조에 잠기는 적어도 둘 이상의 백금(Pt) 전극과; 상기 반응조에 반응물을 투입할 수 있는 투입구와; 상기 반응조로부터 반응물을 배출할 수 있는 배출구를 갖는 질산염 이온화 반응기를 제공한다.

본 발명은 상기 세 번째 기술적 과제를 이루기 위하여, 상기 질산염 이온 검출용 바이오센서와 상기 질산염 이온화 반응기를 포함하는 총질소 농도 측정 시스템을 제공한다.

본 발명은 상기 네 번째 기술적 과제를 이루기 위하여, 상기 바이오센서의 시료주입구에 시료를 투입하는 단계; 상기 바이오센서의 작동전극에 전압을 인가하는 단계; 및 상기 인가 단계에서 작동 전극과 상대전극 사이에 흐르는 전류세기를 측정하는 단계를 포함하는 질산염 이온 농도 측정 방법을 제공한다.

이하에서 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

[질산염 이온 검출용 바이오센서]

일반적으로, 전기화학적 센서 스트립을 포함하는 바이오센서는 크게 2부분으로 분류된다. 하나는 감지전극 부분이고, 다른 하나는 휴대용 측정장치이다. 본 발명에서, 바이오센서는 좁게는 상기 감지전극 부분을 의미하나, 크게는 상기 감지전극이 장착된 휴대용 측정장치를 포함한다. 상기 휴대용 측정장치는 상기 스트립상의 감지전극부분이 삽입되며 감지전극에 흐르는 전류를 측정하기 위한 일정 전위 장치(potentiostat) 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 스트립상의 기판 위에 작동(working) 전극과, 이와 일정간격 이격된 상대(counter) 전극 및 기준(reference) 전극이 스크린-프린팅(screen-printing) 기술로 배열되고 상기 작동 전극 위에 시료주입구가 구비된 바이오센서에 있어서, 상기 작동 전극은 질산염 환원효소(Nitrate reductase)가 중합체 포획법(polymer entrapment)으로 고정된 탄소(carbon) 전극으로서 시료에 포함된 질산염 이온이 상기 질산염 환원효소에 의해 환원반응되는 정도를 전기화학적으로 측정하는 것을 특징으로 하는 질산염 이온 검출용 바이오센서를 제공한다.

본 발명에서 사용된 전기화학적 방법의 질산염 이온 측정용 바이오센서에는 질산염 환원효소 (nitrate reductase) (Sigma, USA) 를 사용할 수 있다. 이 효소는 질산염 이온을 아질산염 이온으로 환원시키는 반응을 촉진하는데, 활성이 상대적으 로 좋다. 사용되는 효소는 분석하고자 하는 시료에 따라 다양하다. 예를 들어 질산염환원효소, 아질산염환원(산화)효소, 암모늄산화(환원)효소 등을 사용할 수 있다.

도 1 은 본 발명의 일실시예로서 바이오센서의 감지전극 제작에 사용한 일회용 전극 모형도이다. 1은 시료주입구, 2는 상대 전극, 3은 작동 전극, 4는 기준 전극, 5는 절연층, 6은 리드선, 7은 리드단자이다. 스트립상의 절연성 기판 위에 일회용 SPCE (screen-printed carbon paste electrode) 전극을 스크린-프린팅(screen-printing) 기술로 형성하여 작동 전극(3)의 주위를 상대 전극(2) 및 기준 전극(4)이 둘러싸도록 배열하고 이들 전극(2, 3, 4)을 리드선(6)을 통해 기판 말단의 리드단자(7)에 연결하며, 상기 전극들(2, 3, 4) 위에 원형의 시료주입구(1)를 형성하여 바이오센서를 제조하였다. 이러한 스트립타입 센서는 측정장비에 삽입되어 전기계측신호를 변환하여 시료 내의 물질농도를 측정할 수 있다.

본 발명의 바이오센서에 있어서, 상기 작동 전극은 효소가 고정되어 환원반응에 의한 전류를 감지하는 역할을 하며, 재질은 탄소 전극으로서 탄소 페이스트(carbon paste) 전극 또는 변형된 탄소 페이스트(modified carbon paste) 전극이 바람직하다. 탄소 페이스트는 가격이 저렴하여 1회용으로 사용할 수 있고, 대량생산이 가능하며, 여기에 고정된 효소가 상대적으로 안정하기 때문이다.

본 발명의 바이오센서에 있어서, 상기 상대 전극은 작동 전극과 짝지어서 전류가 흐르게 하는 역할을 하며, 재질은 작동전극과 유사한 전극을 사용할 수 있다. 또한, 상기 기준전극은 전류가 흐르지 않고 작동전극과 상대전극사이에 일정한 작동전압이 유지되도록 하는 기능을 하며, 재질은 주로 Ag/AgCl 이 많이 사용된다.

탄소 페이스트(carbon paste)와 은 페이스트(silver paste)는 Asahi사 (일본) 제품을 사용하였다. 기준전극을 만들기 위해 은 페이스트(Ag paste)층을 염화철 (FeCl₃) 포화용액으로 산화시킨 다음, 증류수로 세척 후 공기 중에서 건조 시켰다.

본 발명의 바이오센서에 있어서, 상기 질산염 환원효소의 고정화를 위한 중합체는 PVA (polyvinyl alcohol), PAA (polyacrylamide), PEG (polyethylene glycol), 아가로오스(agarose), 전분 겔(starch gels), 나일론(nylon), 실라스틱 겔(Silastic gels), 폴리피롤(polypyrrole) 등이 될 수 있으나, 바람직하게는 1 내지 5 중량%의 PVA를 혼합한 것이 바람직하다. PVA는 -OH기를 많이 가지고 있어서 수용성이고, 또한 친환경적이기 때문이다.

본 발명의 바이오센서에 있어서, 고정된 질산염 환원효소(NaR)의 양은 6.25 내지 25 mU인 것이 바람직하다. NaR양이 작으면 센서의 신호가 작아서 측정한계가 그만큼 높아지고, NaR양이 많으면 신호는 크게 더 증가하지 않기 때문에 경제적이지 않다. 바람직하게는 6.25 내지 25 mU의 질산염환원효소를 PVA와 균일하게 섞은 후, 1 내지 10mL씩 전극의 작동전극에 고정할 수 있다.

본 발명의 바이오센서에 있어서, 기판의 재료로는 유연성과 강도를 갖는 것이 바람직하다. 바람직하게는 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리스티렌(polystyrene), 폴리에틸렌(polyethylene)등의 고분자화합물을 사용할 수 있고, 특히 폴리에틸렌이 바람직하다.

기판 위의 전극 스트립은 도 2에서와 같은 통상의 스크린-프린팅 방법에 따라 전극 모양이 뚫려있는 마스크를 기판 위에 놓고, 전극소재인 페이스트(잉크)를 전극생성부위별로 단계별로 뿌린 후 스퀴즈로 문지른 다음 마스크를 제거하면 스트립이 형성된다. 마스크 두께는 0.1 내지 0.25mm정도가 적절하다. 인쇄회로기판(PCB) 응용기술로 매우 적은 양으로 정량분석이 가능한 전기화학적 바이오센서 스트립의 제조기술에 관하여 미국특허 제5,437,999호를 참조할 수 있다.

본 발명의 바이오센서에 있어서, 상기 시료의 pH는 5.5 내지 8.0인 것이 바람직하다. 본 발명의 실시예에서 최대의 신호는 pH 6.5에서 나타났지만, 5.5 내지 8.0으로 선택하였다. 그 이유는 산소 제거제의 효과를 같이 고려하였기 때문이다.

본 발명의 바이오센서에 있어서, 상기 시료는 MOPS (3-(N-morpholino)propanesulfonic acid), MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid), 포스페이트(phosphate) 등의 버퍼(buffer)를 사용할 수 있으나, 바람직하게는 상기 시료는 0.05 내지 0.2 M 농도의 MOPS 버퍼를 사용한 것으로 특징으로 한다. MOPS를 선택한 이유는 pH범위가 적절한 생리적 버퍼이고, 상당히 높은 작동전압 (-700 내지 -900 mV vs. Ag/AgCl)에서도 안정적이기 때문이다. 버퍼농도가 너무 높으면 고정된 효소가 불안정하고, 농도가 너무 낮으면 감응시간이 상대적으로 길게 된다.

본 발명의 바이오센서에 있어서, 질산염이온의 환원반응의 전자전이를 매개하기 위해 상기 시료에 페노티아진(phenothiazine)류, 트리페닐메탄(triphenylmethane)류, 술폰프탈레인(sulfonphthaleine)류 등의 전자전이매개체를 더 추가할 수 있으나, 바람직하게는 상기 시료에 전자전이매개체로 1.0 내지 3.0 mM 농도의 MV (methyl viologen)를 더 추가한 것을 특징으로 한다. MV는 위에서 언급한 전자전이매개체들과 비교할 때, 전기화학적인 가역성이 제일 좋기 때문에 선택하였다. MV농도가 너무 낮으면 신호가 상대적으로 너무 낮고, MV농도가 너무 높으면 고정된 효소가 불안정하게 된다.

본 발명의 바이오센서에 있어서, 상기 질산염 환원효소는 환원효소로서 종래 혈당측정을 위한 글루코오스 산화효소(glucose oxidase)와 달리 산소의 영향을 많이 받기 때문에 환원효소에 대한 산소의 방해를 줄이기 위해 상기 시료에 아황산염 (SO₃ ^2-), 메타바이설파이트(metabisulfite : S₂O₅ ^2-), 바이설파이트(bisulfite : HSO₃ ^-) 등과 같은 산소제거제를 더 추가할 수 있으나, 바람직하게는 상기 시료에 산소제거제로서 0.5 내지 4 mM 농도의 아황산염을 사용하는 것이 바람직하다. 위에서 언급한 산소제거제들 중에서 아황산염의 효과가 가장 우수하다. 산소제거제의 농도가 너무 낮으면 산소제거효과가 불충분하고, 농도가 너무 높으면 더 높은 농도에서는 불필요하고, 또한 고정화된 효소층이 불안정하게 된다.

[질산염 이온화 반응기]

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 상기 본 발명에 따른 바이오센서를 이용하기 위해 시료를 전처리하는 질산염 이온화 반응기를 제공한다.

즉, 본 발명의 바이오센서를 이용하여 시료 중에 포함된 총질소를 측정하기 위해서는 질산염이 아닌 질소화합물, 예를 들면 아미노산, 아민, 이민, 아미드, 암모늄염 이온, 아질산염 이온 등을 산화시켜 질산염으로 전환시키는 전처리가 필요 한데, 상기 질산염 이온화 반응기는 이러한 요구를 만족시키기 위한 것으로서 질산염이 아닌 질소화합물을 질산염으로 전환시켜 준다.

상기 질산염 이온화 반응기는 반응조와; 상기 반응조에 잠기는 적어도 하나 이상의 산화 티타늄(TiO₂) 전극과; 상기 반응조에 잠기는 적어도 둘 이상의 백금(Pt) 전극과; 상기 반응조에 반응물을 투입할 수 있는 투입구와; 상기 반응조로부터 반응물을 배출할 수 있는 배출구를 포함한다.

질산염이 아닌 질소화합물을 질산염으로 전환시키기 위해서는 산화제와 상기 전환 반응에 촉매작용을 하는 촉매가 필요하다. 상기 질산염 이온화 반응기의 전극으로 상기 촉매작용을 할 수 있는 물질을 사용하면, 전극을 통해 시료를 통과하는 전자의 흐름이 산화제의 역할을 수행하므로 이와 같은 요구를 만족시킬 수 있다. 그런데, 시료 중에는 유기 질소 화합물도 포함되어 있을 수 있고, 무기 질소 화합물도 포함되어 있을 수 있다. 상기 촉매작용을 할 수 있는 물질은 시료가 유기 질소 화합물인지, 또는 무기 질소 화합물인지에 따라 달라질 수 있다.

무기 질소 화합물을 전처리하기 위해서는 캐소드 전극으로는 백금 재질이 바람직하고, 애노드 전극으로는 산화 티타늄 전극이 바람직하다. 이 때, 질산염이 아닌 질소화합물을 질산염으로 전환시키는 반응의 개념도를 도 16에 나타내었다. 여기서 산화 티타늄은 산화를 위한 촉매 역할을 하며 본 산화 반응은 알칼리 분위기에서 더욱 활성화된다.

유기 질소 화합물을 전처리하기 위해서는 캐소드 전극과 애노드 전극이 모두 백금 재질인 것이 바람직하다. 이 때, 질산염이 아닌 질소화합물을 질산염으로 전환시키는 반응의 개념도를 도 17에 나타내었다. 상기 전극을 이루는 백금은 유기 질소 화합물이 산화되는 반응에 촉매 작용을 한다. 유기 질소 화합물은 상기 산화 반응에 의해 탄소 골격이 분해되고 질소는 암모늄 이온과 같은 중간체를 거쳐 질산염으로 전환된다.

따라서, 유기 질소 화합물과 무기 질소 화합물을 모두 포함하는 시료를 적절하게 질산염으로 전환시키기 위해서는 적어도 하나의 산화 티타늄 전극과 적어도 둘 이상의 백금 전극을 포함할 것이 요구된다.

상기 질산염 이온화 반응기의 전극은 가로 방향으로 대향하는 2개의 백금 전극과; 세로 방향으로 대향하는 백금 전극 및 산화 티타늄 전극;을 포함하는 것이 바람직하다. 또, 상기 전극은 반응 표면적을 넓히기 위하여 돌출부를 갖는 것이 바람직하다. 상기 전극의 돌출부는 외부 회로의 단락을 방지하기 위하여 다른 전극의 돌출부와 접촉하지 않는 것이 바람직하고, 상호간에 접촉하지 않으면서 반응 면적을 넓히기 위해 이격되면서 돌출부가 서로 엇갈리면서 겹치는 형태일 수 있다. 이러한 형태의 예시적인 입면도를 도 12의 (b)에 나타내었다.

상기 질산염 이온화 반응기의 전극에 전부 동시에 전원을 공급하여도 되고, 예를 들면, 일정한 시간 간격으로 순차적으로 한 쌍의 전극씩 돌아가며 전원을 공급할 수도 있다.

상기 반응조의 재질은 반응물과 화학적 반응을 일으키지 않는 내화학성을 갖춘 것이면 무엇이든 가능하고 특별히 한정되지는 않는다. 또한, 상기 반응조의 형 태 및 구조 역시 당 업계에 알려진 형태 및 구조를 이용할 수 있으며 특별히 한정되는 것은 아니다. 상기 반응조가 반응물을 수용할 수 있는 용량은 특별히 한정되지 않고, 필요한 시료의 양에 따라 변화시킬 수 있지만 0.1 ㎕ 내지 10 mL인 것이 바람직하다.

상기 질산염 이온화 반응기는 반응물을 희석할 수 있는 희석조를 더 포함할 수 있으며 상기 희석조는 상기 반응조와 투입구를 통해 연결될 수 있다. 상기 희석조는 질산염 이온화 반응이 종료한 반응물의 농도를 희석시키기 위해 이용되며 상기 반응조의 상부에 설치하는 것이 바람직하다. 상기 희석조에는 반응물과 같은 액체를 정량할 수 있는 눈금을 표시하는 것이 바람직하다. 희석조의 재질, 형태 및 구조 등은 특별히 한정되지 않으며 당 업계에 잘 알려진 재질, 형태 및 구조일 수 있다. 다만, 시료와 화학적 반응을 하지 않는 내화학성의 재질인 것이 바람직하다.

경험적으로 생활하수, 오수, 산업폐수의 원수에는 질산염 이온의 농도가 총질소의 40 내지 80%를 차지하기 때문에 질산염 이온 바이오센서로 질산염 이온의 농도를 측정함으로서 희석배수를 용이하게 결정할 수 있다. 또한 처리공정을 통해 처리한 방류수의 질산염 이온의 농도는 총질소의 90% 이상인 경우가 대부분이다. 그러나 공장에서 처리장으로 이동하는 과정의 폐수 속에 존재하는 유기질소와 질산염 이온의 농도비는 공장의 폐수처리 및 관리자를 통해 정보화가 가능하다. 따라서 질산염 이온화 반응 후 희석배율은 경험적으로 결정하거나 사전 정보를 이용해 결정하거나 여러 가지 농도로 희석하여 모두 적용하는 방법을 취해야 할 것이다.

상기 배출구는 중력을 이용하여 반응물을 배출할 수 있도록 상기 반응조의 하부에 설치되는 것이 바람직하다.

본 발명의 질산염 이온화 반응기는 외부의 전원공급장치에 연결되어 사용될 수도 있고, 자체적인 전원공급장치를 포함할 수도 있다. 자체적인 전원공급장치를 더 포함하는 경우는 작동 시간에 따라 전원을 공급하거나 중지시킬 수 있는 타이머 장치를 더 포함할 수 있다.

[총질소 농도 측정 시스템]

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 시료 중의 총질소의 농도를 간편하게 측정할 수 있는 총질소 농도 측정 시스템을 제공한다.

즉, 본 발명의 질산염 이온화 반응기와 본 발명의 질산염 이온 검출용 바이오센서를 일체형으로 결합하여 상기 목적을 달성할 수 있다. 상기 질산염 이온화 반응기와 상기 질산염 이온 검출용 바이오센서의 결합 관계는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 상기 질산염 이온화 반응기의 반응조의 배출구가 상기 질산염 이온 검출용 바이오센서의 시료 주입구와 연결되도록 하는 것일 수 있으며 특별히 한정되는 것은 아니다.

[질산염 이온 농도 측정 방법]

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 바이오센서의 시료주입구에 시료를 투입하는 단계; 상기 바이오센서의 작동전극에 전압을 인가하는 단계; 및 상기 인가단계에서 작동전극과 상대전극 사이에 흐르는 전류세기를 측정하는 단계를 포함하는 질산염 이온 농도 측정 방법을 제공한다.

본 발명의 측정방법에 있어서, 2 단계에서 작동전극에 -700 내지 -900mV (vs. Ag/AgCl)의 작동전압을 걸어주었으며, 3 단계에서 전류세기는 순환 전압측정법(cyclic voltammetry)(Kissinger et al., J. Chem. Ed. 60 (9), 702-706 참조)으로 측정되었다.

또한, 본 발명의 질산염 이온 농도 측정 방법에 있어서, 상기 1 단계에서 상기 바이오센서의 시료주입구에 투입하기 전에 상기 시료를 질산염 이온화 반응기에 투입하는 단계; 상기 질산염 이온화 반응기에 전원을 인가하여 시료 내의 질산염이 아닌 질소 화합물을 질산염으로 전환하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이렇게 할 경우 원래의 시료 내에 존재하는 모든 질소 화합물의 농도를 측정할 수 있다.

상기와 같이 시료를 질산염 이온화 반응기에 투입하여 질산염이 아닌 질소 화합물을 질산염으로 전환할 때 산성 또는 알칼리성 물질을 투입하여 시료를 산성 또는 알칼리성 용액으로 만들면 질산염으로의 전환이 더욱 신속히 일어난다. 다만, 산성 물질은 전극의 부식을 야기할 수 있기 때문에 알칼리성 물질이 바람직하고, 수산화나트륨이 특히 바람직하다. 바람직한 수산화나트륨의 농도는 0.1 내지 2.0 노르말 농도이다. 상기 수산화나트륨의 농도가 0.1 노르말보다 낮으면 질산염으로의 전환을 촉진하는 효과가 미미하고 상기 수산화나트륨의 농도가 2.0 노르말보다 높으면 바이오센서에 적용할 때 중화시키는 단계가 추가되어야 하는 단점이 있다.

상기 질산염 이온화 반응을 시키는 시간은 5 분 내지 30 분이 바람직하다. 반응시간이 5 분보다 짧으면 반응이 충분히 일어나지 않아 추후의 측정 결과에 오차가 발생할 우려가 있고, 반응시간이 30 분보다 길면 반응이 이미 충분하므로 비경제적이다.

상기 질산염 이온화 반응을 위해 걸어주는 전원의 전압은 5 내지 30 V인 것이 바람직하다. 상기 전압이 5 V 보다 낮은 경우는 전압이 낮아 반응이 잘 일어나지 않을 수 있고, 상기 전압이 30 V 보다 높은 경우는 전압에 따른 효과가 포화되어 비경제적이고 전극손상 및 과열의 우려가 있기 때문에 바람직하지 않다. 상기 전압은 반응조의 크기에 비례하여 적절히 선택할 수 있다.

본 발명의 질산염 이온 농도 측정 방법에 있어서, 상기 시료의 pH는 5.5 내지 8.0인 것이 바람직하다. 그 이유는 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명의 질산염 이온 농도 측정 방법에 있어서, 상기 시료는 MOPS (3-(N-morpholino)propanesulfonic acid), MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid), 포스페이트(phosphate) 등의 버퍼(buffer)를 사용할 수 있으나, 바람직하게는 상기 시료는 0.05 내지 0.2 M 농도의 MOPS 버퍼를 사용한 것으로 특징으로 한다. MOPS를 선택한 이유는 앞서 설명한 바와 같다. 버퍼농도가 너무 높으면 고정된 효소가 불안정하고, 농도가 너무 낮으면 감응시간이 상대적으로 길게 된다.

본 발명의 질산염 이온 농도 측정 방법에 있어서, 질산염이온의 환원반응의 전자전이를 매개하기 위해 상기 시료에 페노티아진(phenothiazine)류, 트리페닐메탄(triphenylmethane)류, 술폰프탈레인(sulfonphthaleine)류 등의 전자전이매개체를 더 추가할 수 있으나, 바람직하게는 상기 시료에 전자전이매개체로 1.0 내지 3.0 mM 농도의 MV (methyl viologen)를 더 추가한 것을 특징으로 한다. MV농도가 너무 낮으면 신호가 상대적으로 너무 낮고, MV농도가 너무 높으면 고정된 효소가 불안정하게 된다.

본 발명의 질산염 이온 농도 측정 방법에 있어서, 상기 질산염 환원효소는 환원효소로서 종래 혈당측정을 위한 글루코오스 산화효소(glucose oxidase)와 달리 산소의 영향을 많이 받기 때문에 환원효소에 대한 산소의 방해를 줄이기 위해 상기 시료에 아황산염 (SO₃ ^2-), 메타바이설파이트(metabisulfite : S₂O₅ ^2-), 바이설파이트(bisulfite : HSO₃ ^-) 등과 같은 산소제거제를 더 추가할 수 있으나, 바람직하게는 상기 시료에 산소제거제로서 0.5 내지 4 mM 농도의 아황산염을 사용하는 것이 바람직하다. 산소제거제의 농도가 너무 낮으면 산소제거효과가 불충분하고, 농도가 너무 높으면 더 높은 농도에서는 불필요하고, 또한 고정화된 효소층이 불안정하게 된다.

이하, 구체적인 실시예 및 비교예를 가지고 본 발명의 구성 및 효과를 보다 상세히 설명하지만, 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 명확하게 이해시키기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.

[실시예 1]

- 질산염환원효소의 전기화학적 특성

전기화학 실험은 3전극계에서 수행하였다. 작동전극은 glassy carbon disk 전극(3mm)이고, 보조전극은 나선(spiral) 형태의 Pt 선(wire)이고, 참조(reference) 전극은 Ag/AgCl(3 M KCl)를 사용하였다. cDAQ-1604 potentiostat(Elbio, Korea)를 순환 전압측정법(cyclic voltammogram : CV), 그리 고 전류-전압(I-V curve)을 기록하는 데 사용하였다. 전류-전압 (I-V curve)을 기록하는 실험에서는 작동 전위(working potential)를 -0.4 내지 1.0 mV(vs Ag/AgCl)를 걸어 주었다.

도 3은 본 발명의 바이오센서의 질산염환원효소를 이용한 기질(질산염이온) 농도별 순환 전압측정(cyclic voltammetry)의 결과로서 전압(potential)변화에 따른 전류(current)의 세기를 나타낸 그래프이다. 도 2에서 질산염환원효소와 전자매개체(methyl viologen)를 작동전극에 반응시키고, 기질의 농도가 증가할수록 환원전류는 증가하는 것을 볼 수 있다. 이것은 질산염환원효소가 질산염을 아질산염으로 환원하는 것을 의미하며, 동시에 MV가 매개체 역할을 수행하는 것을 알 수 있다. 기질의 농도가 50, 100 μM일 때, 동일한 경향을 나타내었다. 실험의 결과로 볼 때, 전기화학적으로 MV를 지속적으로 환원시켜주면 전기화학적방법을 통하여 질산염 이온의 환원전류를 얻을 수 있고, 미지의 기질의 농도를 측정 할 수 있다.

[실시예 2]

- 감지전극센서스트립의 제조 및 최적화

1회용 SPCE (screen-printed carbon paste electrode) 전극을 screen-printing기술로 휴대용 측정기기의 크기에 맞추어 너비 12.8 mm, 길이 65mm로 도 1에서 표시한 것처럼 폴리에틸렌 기판 (PE판) 위에 제작하였다. 산소제거제, 전자전이매개체, MOPS, 기질을 포함하는 용액 3 μL를 파이펫으로 효소가 고정된 1회용 전극 끝에 접촉시킨다. 용액이 빨려 들어간 후, -700 내지 -900mV (vs. Ag/AgCl)의 전압을 걸어준 다음 cDAQ-1604 potentiostat(Elbio, Korea)를 이용하여 데이터를 수집하였다.

본 발명에서 효소의 일회용 스트립타입의 센서를 제작하기 위해, 먼저, 전극부위에 효소를 고정을 용이하게 하기 위해, 안정성과 보존성이 우수한 PVA를 사용하였다. 농도를 1%(wt), 2.5%, 5%, 10%, 15%, 20%별로 실험하였다. 최적 PVA농도는 1 내지 5 wt%로 나타났다. 농도가 높으면 높을수록 잡음이 크게 나타났고, 1 wt% 보다 더 낮은 농도는 신호가 상대적으로 낮기 때문에 좋지 않았다. 도 4는 본 발명의 바이오센서의 PVA 농도별 전류변화량(△I)을 나타낸 그래프이다.

전극신호 발생에 필요한 효소의 최적 양을 알아보기 위해 효소농도를 6.25, 12.5, 25, 50 mU/3 μL으로 실험하였다. 도 5는 본 발명에 바이오센서의 질산염환원효소의 농도에 따른 전류변화량(△I)을 나타낸 그래프이다. 고정화된 효소 양의 증가에 따라 신호가 증가하지만, 농도별 증가하는 폭은 효소 농도가 크면 클수록 크게 둔화되었다. 바람직하게는 고정화된 최적 효소 양을 6.25 내지 25 mU/3 μL 로 설정하는 것이 바람직하다.

질산염 측정전극의 pH의존성을 알아보기 위해 MES 버퍼(buffer), MOPS 버퍼를 사용하여 실험하였다. 도 6은 본 발명의 바이오센서의 시료의 pH에 따른 전류량(Current)을 나타낸 그래프이다. pH 5.5 내지 6.0사이는 MES 버퍼로 실험하였고, 6.5 내지 8.0사이는 MOPS 버퍼를 사용하였다. pH 6.5, MES 버퍼에서 얻은 데이터를 pH 6.5, MOPS 버퍼에서 얻은 데이터와 비교하여 MES 버퍼에서 얻은 데이터를 정규화(normalize)하였다. 실험결과를 보면, 최적 pH를 6.5 내지 7.0으로 선정하는 것이 바람직하다.

버퍼 농도의 효과를 살펴보기 위해 MOPS 버퍼의 농도를 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 M로 pH 7.0에서 실험하였다. 도 7은 본 발명의 바이오센서의 MOPS 버퍼 농도에 따른 민감도(sensitivity)를 나타낸 그래프이다. 실험 결과를 보면, 모든 버퍼 농도에서 비슷한 신호를 나타냈다. 신호는 평균 민감도(mean sensitivity) 7.13을 기준으로 표준편자가 1.4%로 집중한 것으로 나타났다. 높은 버퍼농도에서는 고정화 효소의 안정성이 상대적으로 나쁘기 때문에 최적 버퍼농도를 0.05 내지 0.2 M로 선정하였다.

최적 MV (전자전이 매개체) 농도를 알아보기 위해 MV의 농도를 1 mM에서 5 mM까지 실험하였다. 도 8은 본 발명의 바이오센서의 전자전이매개체로서 MV 농도에 따른 겉보기 전류(Apparent current)를 나타낸 그래프이다. 실험결과를 보면, MV의 농도 증가에 따라 신호는 선성(linear)으로 증가하였다. 그리고 고정된 효소의 양과 기질의 양을 따져 볼 때, 최적 MV농도를 1.0 내지 3.0 mM이 적합하였다.

효소의 산소에 대한 반응을 제거하기 위해, 최적 산소 제거제로 밝혀진 아황산 농도를 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 10 mM에서 변화하면서 실험하였다. SO₃ ^2- 의 산소제거 반응은 다음과 같다: 2 SO₃ ^2- + O₂ → 2 SO₄ ^2-

도 10은 본 발명의 바이오센서의 산소제거제로서 아황산염 농도에 따른 전류량(current)을 나타낸 그래프이다. 산소 제거가 진행되는 동안에 버퍼속으로 용해되어 들어오는 산소를 동시에 고려해서 최적 산소 제거제 농도를 0.5 내지 4 mM이 적합하였다.

질산염 측정전극의 검정곡선을 얻기 위해 기질의 농도를 50, 100, 150, 200, 250, 300 mM사이에서 변화시키면서 중복실험을 하였다 (n = 30). 도 11은 본 발명에 바이오센서의 질산염농도에 따른 효소전극시스템(스트립형 센서)에서 발생한 전류량(△I)을 나타낸 그래프이다. 실험결과를 보면, 선성 방정식은 Y = 5.42X - 38.43 (r² = 0.996)이었다.

[실시예 3]

- 비질산염 이온성 질소의 질산염 이온화 반응의 최적화

도 12는 암모늄염 이온과 유기질소 화합물의 질산염 이온화 반응기로 전해질로서 0.1 내지 2.0 노르말의 수산화나트륨이 존재하는 조건에서 반응물질의 농도에 따라 5 내지 30 볼트의 직류 전원만으로 부수적인 산화제나 촉매 없이 5 내지 30분 동안의 반응으로 암모늄염 이온과 유기질소를 질산염 이온으로 산화할 수 있다. 바이오센서에 적용할 수 있는 양과 농도를 고려해서 반응기의 용량은 0.1 밀리리터로 조정하였으며 바이오센서의 감지능력의 범위에 적합하게 적당한 희석과 중화가 필요하여 버퍼용액으로 희석할 수 있게 20 밀리리터의 희석조로 구성하였다.

도 13은 본 발명의 질산염 이온화 반응기의 운영을 위하여 제작한 전원공급 장치의 측면도로서 공급되는 전압과 반응시간을 자유롭게 조절할 수 있도록 제작하였으며, 전류량은 반응물질의 농도에 따라 자동으로 조정되게 하였다. 전류량은 반응물질의 농도에 비례해서 증감할 수 있는 여유를 위해 최대 5 A로, 사용 가능한 최대전압은 30 V로 조정하였다.

도 14는 비질산염 이온 - 암모니아와 유기질소 (글루타민산 나트륨)를 본 발명의 질산염 이온화 반응기를 이용하여 질산염 이온화한 결과를 나타낸 그래프로 20 볼트의 전압에서 반응에 필요한 시간을 결정하기 위한 시험결과로 시험에 사용한 물질의 농도는 100 ppm으로 조정하였다. 그 결과, 도 14에서 보는 바와 같이 반응시간 10 분 이후에는 반응효율의 비약적인 증가는 보이지 않고 있다. 따라서 현장에서 시험할 때 준비, 반응, 측정 등의 시간을 고려하여 10분이 적합할 것으로 결정하였다. 시료의 수가 많을 경우에는 반응기의 수를 늘려서 처리할 수 있으므로 전체적인 처리시간에는 큰 증가가 없을 것으로 판단된다.

도 15는 비질산염 이온 - 유기질소 (글루타민산 나트륨)를 전기화학 촉매 산화방법을 이용하여 질산염 이온화한 결과를 나타낸 그래프로 시험에 사용한 물질의 농도는 100 ppm으로 조정하였으며 시험결과는 도 15에서 보는 바와 같이 10분 동안 충분한 산화반응이 이루어지는데 필요한 전압은 25 볼트 정도로 이는 자동차 밧데리 전압의 2배에 해당한다. 따라서, 처리한 물질의 농도와 자연수에 존재하는 유기질소의 양이 미량인 점을 감안하면 15 볼트로서 충분할 것으로 생각된다.

표 1에 본 발명의 질산염 이온화 반응기를 이용하여 암모니아성 질소, 유기질소, 하천수, 처리장 하수 등의 질산염 이온화 효율 및 본 발명의 질산염 측정용 바이오센서로 측정한 총질소 농도를 비교하여 정리하였다. 표 1에서 알 수 있는 바와 같이 암모니아성 질소의 질산염 이온화 효율은 97% 이상으로 매우 높았다. 그러나 자연 하천이나 하수처리장으로 유입되는 물, 처리 중인 하수 등의 질산염 이온 화효율은 전반적으로 85 내지 95% 정도로 비교적 처리효율이 높게 나타났다. 이것은 자연 하천이나 하수 등에는 유기성 질소의 함량보다 암모니아성, 아질산성, 질산성 질소 등이 상대적으로 높게 함유되어 있기 때문으로 생각된다. 또한 바이오센서로 측정한 총질소의 농도는 이온 크로마트그래피(IC)로 측정한 값과 매우 유사하게 나타났는데 이것은 시료의 질산염 이온화 반응과 바이오센서를 연계한 측정방법이 총질소를 측정을 위해 합리적으로 적용될 수 있다는 것을 보여주는 것이다.

시료	총질소(a)	질산염(b) (IC측정결과)	질산염(c) (바이오센서측정결과)	측정편차(c/b)	측정편차(c/a)
암모늄	49.0	47.8	0.4810	48.1/47.8 (1.006)	48.1/49 (98.2)
중랑하수처리장 원수	59.0	56.9	0.5772	58.0/56.9 (1.019)	58.0/59.0 (98.3)
중랑하수처리장 혐기소화조	940	945	9.45	945/945 (1.00)	945/940 (1.005)
중랑하수처리장 포기조	71.0	68.2	0.6633	66.3/68.2 (0.97)	66.3/71.0 (97.2)

상기 표 1에서 (a)는 하크(HACH)를 이용하여 측정한 총질소의 양이고, (b)는 이온 크로마토그래피(IC)를 이용하여 측정한 질산염의 양이고, (c)는 본 발명의 질산염 이온화 반응기를 이용하여 질산염으로 전환한 후 이를 100배 희석하여 본 발명의 바이오센서를 이용하여 측정한 질산염의 양이다.

상기 표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 질산염 이온화 반응기 및 질산염 이온 검출용 바이오센서의 정확도가 2 내지 3 % 이내의 오차를 보이고 있으므로 매우 우수함을 알 수 있다.

이상에서 살펴본 바와 같이 본 발명의 바람직한 실시예에 대해 상세히 기술되었지만, 본 발명이 속하는 기술분야에 있어서 통상의 지식을 가진 사람이라면, 첨부된 청구 범위에 정의된 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 본 발명을 여러 가지로 변형하여 실시할 수 있을 것이다. 따라서 본 발명의 앞으로의 실시예들의 변경은 본 발명의 기술을 벗어날 수 없을 것이다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 의해 제조된 일회용 질산염 이온 검출용 바이오센서는 전기화학적 방법을 사용하여 질산염 이온의 정확한 농도를 현장에서 편리하게 측정할 수 있다. 또한 구조와 제작비용이 저렴하고 휴대가 가능하기 때문에 기존의 측정제품과 차별성이 있고 가격 경쟁력도 크다.

본 발명의 질산염 이온화 반응기는 질산염이 아닌 질소 화합물을 편리하게 질산염으로 전환시키는 장치로서 상기 질산염 이온화 반응기와 상기 질산염 이온 검출용 바이오센서와 결합하면 시료 내의 총질소를 편리하게 측정할 수 있다.

Claims (24)

1. 작동(working) 전극과, 이와 일정간격 이격된 상대(counter) 전극 및 기준(reference) 전극이 배열된 바이오 센서에 있어서, 상기 작동 전극이 질산염 환원효소(nitrate reductase)가 고정된 탄소 전극으로서 시료에 포함된 질산염 이온이 상기 질산염 환원효소에 의해 환원반응되는 정도를 전기화학적으로 측정하는 것을 특징으로 하는 질산염 이온 검출용 바이오센서.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 작동 전극이 탄소 페이스트(carbon paste) 전극인 것을 특징으로 하는 질산염 이온 검출용 바이오센서.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 질산염 환원효소를 고정하기 위해 1 내지 5 중량% PVA(polyvinyl alcohol)를 혼합한 것을 특징으로 하는 질산염 이온 검출용 바이오센서.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 질산염 환원효소의 고정된 양이 6.25 내지 25 mU인 것을 특징으로 하는 질산염 이온 검출용 바이오센서.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 시료의 pH가 5.5 내지 8.0인 것을 특징으로 하는 질산염 이온 검출용 바이오센서.
6. 제 1 항에 있어서, 상기 시료가 0.05 내지 0.2 M 농도의 MOPS (3-(N-morpholino)propanesulfonic acid) 버퍼(buffer)를 사용한 것을 특징으로 하는 질산염 이온 검출용 바이오센서.
7. 제 1 항에 있어서, 상기 시료에 전자전이매개체로 1.0 내지 3.0 mM 농도의 MV(methyl viologen)를 더 추가한 것을 특징으로 하는 질산염 이온 검출용 바이오센서.
8. 제 1 항에 있어서, 상기 시료에 산소제거제로 0.5 내지 4 mM 농도의 아황산염을 사용한 것을 특징으로 하는 질산염 이온 검출용 바이오센서.
9. 반응조와; 상기 반응조에 잠기는 적어도 하나 이상의 산화 티타늄(TiO2) 전극과; 상기 반응조에 잠기는 적어도 둘 이상의 백금(Pt) 전극과; 상기 반응조에 반응물을 투입할 수 있는 투입구와; 상기 반응조로부터 반응물을 배출할 수 있는 배출구를 갖는 질산염 이온화 반응기.
10. 제 9 항에 있어서, 상기 전극이 돌출부를 갖는 것을 특징으로 하는 질산염 이온화 반응기.
11. 제 10 항에 있어서, 상기 돌출부가 서로 접촉하지 않으면서 서로 이격된 채 엇갈리면서 겹치는 형태인 것을 특징으로 하는 질산염 이온화 반응기.
12. 제 9 항에 있어서, 상기 전극이 가로 방향으로 대향하는 2개의 백금 전극과; 세로 방향으로 대향하는 백금 전극 및 산화 티타늄 전극;을 포함하는 것을 특징으로 하는 질산염 이온화 반응기.
13. 제 9 항에 있어서, 희석조를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 질산염 이온화 반응기.
14. 제 1 항의 질산염 이온 검출용 바이오센서와 제 9 항의 질산염 이온화 반응기를 포함하는 총질소 농도 측정 시스템.
15. 제 1 항 내지 제 8 항 중의 어느 한 항에 따른 바이오센서의 시료주입구에 시료를 투입하는 단계; 상기 바이오센서의 작동전극에 전압을 인가하는 단계; 및 상기 인가 단계에서 작동 전극과 상대전극 사이에 흐르는 전류세기를 측정하는 단계를 포함하는 질산염 이온 농도 측정 방법.
16. 제 15 항에 있어서, 상기 바이오센서의 시료주입구에 투입하기 전에 상기 시료를 질산염 이온화 반응기에 투입하는 단계; 상기 질산염 이온화 반응기에 전원을 인가하여 시료 내의 질산염이 아닌 질소 화합물을 질산염으로 전환하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 질산염 이온 농도 측정 방법.
17. 제 16 항에 있어서, 상기 질산염 이온화 반응기에 수산화나트륨의 농도가 0.1 내지 2.0 노르말 농도가 되도록 수산화나트륨을 더 투입하는 것을 특징으로 하는 질산염 이온 농도 측정 방법.
18. 제 16 항에 있어서, 한 쌍의 전극씩 순차적으로 돌아가며 전원을 공급하는 것을 특징으로 하는 질산염 이온 농도 측정 방법.
19. 제 16 항에 있어서, 5 분 내지 30 분 동안 반응시키는 것을 특징으로 하는 질산염 이온 농도 측정 방법.
20. 제 16 항에 있어서, 공급하는 전원의 전압이 5 내지 30 볼트인 것을 특징으로 하는 질산염 이온 농도 측정 방법.
21. 제 15 항에 있어서, 질산염 이온 농도의 측정시 상기 시료의 pH가 5.5 내지 8.0인 것을 특징으로 하는 질산염 이온 농도 측정 방법.
22. 제 15 항에 있어서, 상기 시료가 버퍼로서 0.05 내지 0.2 M 농도의 MOPS (3- (N-morpholino)propanesulfonic acid) 를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 질산염 이온 농도 측정 방법.
23. 제 15 항에 있어서, 상기 시료가 전자전이매개체로서 1.0 내지 3.0 mM 농도의 MV(methyl viologen)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 질산염 이온 농도 측정 방법.
24. 제 15 항에 있어서, 상기 시료가 산소제거제로서 0.5 내지 4 mM 농도의 아황산염을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 질산염 이온 농도 측정 방법.

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