KR20160004421A - 수산화기―풍부 환원된 그래핀 산화물을 이용한 전기화학적 면역센서 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 수산화기-풍부 환원된 그래핀 산화물을 이용한 전기화학적 면역센서에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 수산화기-풍부 환원된 그래핀 산화물(HRGO) 및 Poly(T.P.N.)에 의해 표면개질된 전극으로 면역센서를 구성하고 이를 샌드위치 ELISA 기법을 통한 전기화학적 면역분석에 적용함으로써, 매우 낮은 검출한계와 더불어 초미량의 표적 항원(예컨대, Mouse IgG specific antigen)을 고감도(Ultrasensitive)로 검출해낼 수 있는 전기화학적 면역센서, 그 제조방법, 및 이를 이용한 전기화학적 면역분석법(Electrochemical immunoassay)에 관한 것이다.

Description

수산화기―풍부 환원된 그래핀 산화물을 이용한 전기화학적 면역센서{ELECTROCHEMICAL IMMUNOSENSOR USING HYDROXYL GROUP―ENRICHED REDUCED GRAPHENE OXIDE}
본 발명은 수산화기-풍부 환원된 그래핀 산화물을 이용한 전기화학적 면역센서에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 수산화기-풍부 환원된 그래핀 산화물(HRGO) 및 Poly(T.P.N.)에 의해 표면개질된 전극으로 면역센서를 구성하고 이를 샌드위치 ELISA 기법을 통한 전기화학적 면역분석에 적용함으로써, 매우 낮은 검출한계와 더불어 초미량의 표적 항원(예컨대, Mouse IgG specific antigen)을 고감도(Ultrasensitive)로 검출해낼 수 있는 전기화학적 면역센서, 그 제조방법, 및 이를 이용한 전기화학적 면역분석법(Electrochemical immunoassay)에 관한 것이다.
면역센서(Immunosensor)란 항체가 특이적인 항원을 인식하여 항원/항체 복합체를 형성하는 성질을 이용한 바이오센서의 일종으로서, 원칙적으로 항체를 만들 수 있는 물질은 모두 면역센서의 측정대상이 된다. 이러한 면역센서는 항원/항체 복합체의 형성에 따라 발생하는 어떤 변화를 전기신호로 변환하여 표시하는 것을 기본으로 하고 있다. 면역센서는 측정방식의 차이에 따라 비표식 면역센서 및 표식 면역센서로 분류되며, 이러한 면역센서를 이용한 면역측정은 범용성이 매우 높아 초미량의 물질을 선택적으로 측정하는데 유용하게 사용되고 있다.
한편, 그래핀(Graphene)은 지금까지 알려진 물질 중에 가장 얇으면서도, 전기나 열을 가장 잘 전도할 수 있을 뿐 아니라 가장 강하면서도 유연한 물질이다. 이　같은 그래핀은 그 우수한 특성으로 인해 구조 재료로 사용되거나, Si 전자 소자를 대체할 수 있을 것으로 기대를 모으고 있다. 구체적으로, 그래핀은 플렉서블 디스플레이와 터치 패널 등 차세대 디스플레이 분야, 태양 전지 등의 에너지 산업분야, 스마트 윈도우,　RFID 등 다양한 전자 산업 분야에서 신소재로 활용도가 확대되고 있다.
또한, 그래핀 산화물(Graphene Oxide; GO) 및 이로부터 환원된 그래핀 산화물(Reduced Graphene Oxide; RGO)은 기존의 그래파이트보다 표면적이 크고, 전기전도도가 높으며, 강력한 기계적 강도를 지니고, 유연성까지 겸비한 물질이다.
아울러, 그래핀 산화물 및 환원된 그래핀 산화물은 그래파이트 대비 더욱 많은 균일하게 분포된 전기화학적 활성사이트를 가지는바, 그 다양한 용도가 탐구 대상이 되고 있다.
이러한 측면에서, 그래핀 또는 그래핀 산화물 등을 이용한 면역센서들이 일부 제안된 바 있다. 그러나 종래의 통상적인 그래핀 또는 그래핀 산화물은 전극에 잘 고정이 안 되어 균일하고 안정된 표면을 제공하기 어려우며, 특히 이를 면역센서로 적용할 경우 전기신호(Signal)가 전혀 나오지 않거나 표적 항원 검출을 위한 전기화학적 촉매 활성(Electrocatalytic activity) 떨어져 감도 및 선택성이 낮게 나타나는 문제가 있었다.
이에, 종래 그래핀 또는 그래핀 산화물 사용에 따른 문제점을 해소할 수 있는 특수한 형태의 그래핀계 재료를 면역센서에 접목하여 초미량의 표적 항원을 고감도(Ultrasensitive)로 검출해낼 수 있는 새로운 형태의 전기화학적 면역센서에 대한 개발이 요구되는 실정이다.
한국공개특허 제10-2014-0017439호
본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하고자 한 것으로, 우수한 전기화학적 촉매 활성을 바탕으로 검출한계를 크게 낮추어 초미량의 표적 항원을 초고감도로 검출해낼 수 있는 새로운 형태의 전기화학적 면역센서, 그 제조방법, 및 이를 이용한 전기화학적 면역분석법을 제공하는 것을 기술적 과제로 한다.
상기한 기술적 과제를 달성하고자, 본 발명은 전극; 상기 전극 표면 상에 형성된 수산화기-풍부 환원된 그래핀 산화물(HRGO); 및 상기 수산화기-풍부 환원된 그래핀 산화물(HRGO) 상에 코팅 및 결합된 트라이메톡시실레인-폴리에틸렌글라이콜-엔석신이미딜에스터 폴리머(Poly(TMSMA-r-PEGMA-r-NAS))를 포함하는 전기화학적 면역센서를 제공한다.
또한, 상기 전극은 ITO(Indium Tin Oxide) 전극인 것을 특징으로 하는 전기화학적 면역센서를 제공한다.
아울러, 상기 전극 표면은 PEI(Polyethyleneimine)에 의해 전처리된 것을 특징으로 하는 전기화학적 면역센서를 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 측면으로, (a) 피라나 용액(Piranha solution)으로 세척한 ITO 전극을 다시 물로 세척하여 전극 표면에 (-) 전하를 형성하는 단계; (b) 상기 (-) 전하가 형성된 전극을 (+) 전하를 띄는 PEI 수용액에 딥핑(Dipping)한 후, 물로 세척하는 단계; (c) 상기 세척된 전극을 수산화기-풍부 환원된 그래핀 산화물(HRGO) 수용액에 딥핑한 후 물로 세척하여, 전극 표면에 수산화기-풍부 환원된 그래핀 산화물(HRGO)을 형성하는 단계; 및 (d) 상기 수산화기-풍부 환원된 그래핀 산화물(HRGO)이 형성된 전극 표면에 트라이메톡시실레인-폴리에틸렌글라이콜-엔석신이미딜에스터 폴리머(Poly(TMSMA-r-PEGMA-r-NAS))를 코팅한 후, 어닐링(Annealing)하는 단계;를 포함하는 전기화학적 면역센서의 제조방법을 제공한다.
아울러, 상기 (d) 단계에서, 상기 어닐링은 100℃에서 5분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 전기화학적 면역센서의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면으로, 상기 전기화학적 면역센서를 사용하여 샌드위치 ELISA 방법으로 표적 항원을 검출하는 전기화학적 면역분석법(Electrochemical immunoassay)을 제공한다.
구체적으로, (s1) 1차 항체(Primary antibody)를 상기 전기화학적 면역센서에 노출시켜 고정시킨 후, 고정되지 않은 것을 PBST로 닦아주고, 다시 물로 세척하는 단계; (s2) 표적 항원을 상기 1차 항체가 고정된 전기화학적 면역센서에 노출시켜 고정시킨 후, 고정되지 않은 것을 PBST로 닦아주고, 다시 물로 세척하는 단계; (s3) 2차 항체(Secondary antibody)를 상기 표적 항원이 고정된 전기화학적 면역센서에 노출시켜 고정시킨 후, 고정되지 않은 것을 PBST로 닦아주고, 다시 물로 세척하는 단계; 및 (s4) 전해질을 준비된 전기화학적 면역센서의 전극에 노출시켜 화학적 촉매반응을 일으킨 후, 전기화학을 통해 생성된 물질의 양을 순환전압전류법을 이용해 검출해내는 단계;를 포함하는 전기화학적 면역분석법을 제공한다.
아울러, 상기 2차 항체는 HRP(Horseradish peroxidase)로 표지된 것임을 특징으로 하는 전기화학적 면역분석법을 제공한다.
더불어, 상기 (s4) 단계는 전해질로서 과산화수소 및 하이드로퀴논 용액을 상기 준비된 전기화학적 면역센서의 전극에 노출시켜 화학적 촉매반응을 일으킨 후, 생성된 벤조퀴논의 양을 순환전압전류법을 이용해 검출해내는 것임을 특징으로 하는 전기화학적 면역분석법을 제공한다.
또한, 상기 1차 항체는 Anti-Mouse IgG이고, 상기 표적 항원은 Mouse IgG specific antigen이며, 상기 2차 항체는 HRP로 표지된 Anti-Mouse IgG(Anti-Mouse IgG-HRP)인 것을 특징으로 하는 전기화학적 면역분석법을 제공한다.
아울러, 상기 (s4) 단계에서, 상기 준비된 전기화학적 면역센서의 전극을 작업전극으로, 백금전극을 상대전극으로, Ag/AgCl 전극을 기준전극으로 사용하는 것을 특징으로 하는 전기화학적 면역분석법을 제공한다.
본 발명에 따른 전기화학적 면역센서는 HRGO의 수산화기가 Poly(T.P.N.)의 실레인기와 결합되고 상기 Poly(T.P.N.)은 1차 항체를 공유결합적으로 고정화시키는바, 샌드위치 ELISA 등 면역분석법을 수행하기에 매우 적합한 구조를 지니고 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 전기화학적 면역센서를 이용하여 샌드위치 ELISA 방법으로 면역분석을 수행하면, 항원의 검출한계(Limit of detection; LOD)가 100 ag/mL에 이를 정도로 매우 낮아 초미량의 표적 항원을 초고감도로 검출해낼 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 전기화학적 면역센서는 Mouse IgG specific antigen에 특이적인 선택성을 나타낸다.
도 1은 본 발명의 전기화학적 면역센서를 구성하는 수산화기-풍부 환원된 그래핀 산화물(HRGO)의 합성과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명에 따른 HRGO 및 Poly(T.P.N.)로 개질된 전기화학적 면역분석용 전극의 제조과정, 샌드위치 ELISA 프로토콜에 의한 항원 검출 메카니즘, 및 효소작용에 의해 생성된 벤조퀴논(BQ)의 전기화학적 환원을 나타낸 모식도이다.
도 3의 (a)는 1 ug/mL Mouse IgG specific antigen에서 각각 다른 그래핀 상태에 따른 선택성 실험결과를 나타낸 CV(순환전압전류법, Cyclic Voltammetry) 데이터이다.
도 3의 (b)는 1 ug/mL의 각각 다른 단백질에 따른 선택성 실험결과를 나타낸 CV 데이터이다.
도 4 및 도 5는 최적화된 조건으로 개질된 전극에서의 Mouse IgG specific antigen 농도에 따른 CV 데이터이다.
도 6은 최적화된 조건으로 개질된 전극에서 Mouse IgG specific antigen 농도에 따른 CV의 Cathodic responses 피크를 오차막대와 함께 나타낸 것이다. (Calibration plot)
도 7은 최적화된 조건으로 개질된 전극에서 Standard PSA 농도에 따른 CV의 Cathodic responses 피크를 회귀곡선 및 기울기와 함께 나타낸 것이다. (Calibration plot)
도 8은 사람 혈청에서의 Spiked PSA 실험결과를 2개의 표로 나타낸 도면이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
전기화학적 면역센서( Electrochemical immunosensor )
본 발명에 따른 전기화학적 면역센서는 전극; 상기 전극 표면 상에 형성된 수산화기-풍부 환원된 그래핀 산화물(HRGO); 및 상기 수산화기-풍부 환원된 그래핀 산화물(HRGO) 상에 코팅 및 결합된 트라이메톡시실레인-폴리에틸렌글라이콜-엔석신이미딜에스터 폴리머(Poly(TMSMA-r-PEGMA-r-NAS); Poly(T.P.N.)으로도 약칭함)를 포함하는 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 전극(기판)으로는 유리, 수정, 글래스웨이퍼, 실리콘웨이퍼, 탄소기판, 탄소펠트, 사파이어, 질화실리콘, 화합물 반도체, GaAs 기판, GaInP 기판, 탄화실리콘, 티타늄 코팅기판, 세라믹, 금속합금, 플라스틱, SAM(Self-assembled monolayer)막, 양극산화기판, 섬유강화 투명 플라스틱, 단결정 실리콘, 폴리크리스탈린 실리콘, 마이크로 크리스탈린 실리콘, 박막 실리콘, CdTe 기판, 양자점 태양전지, GaP 기판, SiGe 기판, Si 기판, Ge 기판, InGaAsN 기판, Cu 기판, Al 기판, Au 기판, Ag 기판, Pt 기판, 용융 실리카 기판, ITO 기판, 활성 탄소 기판 등을 사용할 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 일 구체예에서, 상기 전극은 ITO(Indium Tin Oxide) 전극일 수 있다.
또한, 상기 전극은 수산화기-풍부 환원된 그래핀 산화물(HRGO)을 형성하기 전에 PEI(Polyethyleneimine)(하기 화학식 참조)로 그 표면을 전처리하는 것이 바람직하다. 이처럼 전극 표면이 사전에 PEI로 개질되면 (+) 전하를 띠는 PEI 표면과 (-) 전하를 띠는 HRGO 표면이 정전기적 인력으로 상호작용하여 HRGO를 전극에 보다 효율적으로 형성 및 고정(Deposition)시킬 수 있다.
Figure pat00001

본 발명의 전기화학적 면역센서에 사용되는 수산화기-풍부 환원된 그래핀 산화물(HRGO; Hydroxyl group-enriched Reduced Graphene Oxide 또는 Hydrophilic Reduced Graphene Oxide의 약자)(하기 화학식 참조)은 종래 보고된 그래핀 산화물(GO)보다 더욱 많은 수의 수산화기를 함유하는 새로운 형태의 그래핀계 친수성 물질이다. 또한 HRGO는 그래핀 특유의 유리한 특성 감소 없이 다양한 화학적 상호작용을 수행할 수 있으며, 종래 보고된 통상의 환원된 그래핀 산화물(RGO)보다 수용액에 더욱 잘 용해될 수 있는 장점이 있다. 아울러 HRGO는 정전기적 결합, 수소 결합 및 Silanization 등과 같은 다양한 결합에 대해 더욱 높은 가능성을 제공하며, 전기화학적 성능을 구현하기 위한 안정된 플랫폼으로 기능할 수 있는 소재이다.
Figure pat00002
구체적으로, 상기 HRGO는 전기화학적 촉매 활성(Electrocatalytic activity)이 우수하며 그 풍부한 수산화기 상에 이후 코팅될 Poly(T.P.N.)의 실레인기가 Silanization을 통해 효과적으로 결합될 수 있는바, 전기화학적 면역센서의 박막 재료로 매우 적합하게 사용될 수 있다.
본 발명의 전기화학적 면역센서에 사용되는 HRGO 및 이를 얻기 위한 그래핀 산화물(GO)은 한국공개특허 제10-2014-0044045호에 기재되어 있는 방법을 이용하여 합성될 수 있다. 예를 들어, 한국공개특허 제10-2014-0044045호에 기재되어 있는 Hummer's method를 이용하여 Hummers, W.; Offeman, R. J. Am. Chem. Soc. 1958, 80, 1339., Cote, L. J.; Kim, F.; Huang, J. J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 1043-1049., Xu, Y.; Wu, Q.; Sun, Y.; Bai, H.; Shi, G. ACS Nano 2010, 4, 7358-7362에 기재된 방법에 따라 합성할 수 있다.
다른 예로, 상기 HRGO는 그래핀 산화물(GO) 용액에 적절량의(예컨대, GO 대비 0.5 ~ 10 중량배의) K2S2O8 또는 (NH4)2S2O8 산화제를 가한 뒤, 50 ~ 100℃ 하에서 1 ~ 12시간 동안(예컨대, 60℃ 하에서 12시간 동안) 가열하여 수산화기를 도입하는 단계; 및 상기 수산화기가 도입된 그래핀 산화물(HGO)에 pH가 8 ~ 11이 되도록 N2H4, NaOH 또는 NaBH4 환원제를 가한 뒤, 60 ~ 100℃로 2 ~ 6시간 동안 가열하여 환원시키는 단계;를 통해 합성될 수 있다.
본 발명의 전기화학적 면역센서에서 상기 HRGO 상에 코팅 및 결합되는 Poly(T.P.N.)은 N-acryloxysuccinimide-activated 양쪽 친매성(Amphiphilic) 폴리머로서, 하기 화학식으로 표시되는 것이다.
Figure pat00003
전술한 바와 같이, 상기 Poly(T.P.N.)의 실레인기는 HRGO의 수산화기와 Silanization을 통해 결합된다. 또한 상기 Poly(T.P.N.)는
Figure pat00004
부분을 통해 1차 항체를 공유결합적으로 고정화시키는바, 샌드위치 ELISA 방법 등의 면역분석에 매우 적합한 전기화학적 면역센서를 구현할 수 있게 한다.
전기화학적 면역센서의 제조방법
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기한 바와 같은 본 발명 전기화학적 면역센서의 제조방법이 제공된다.
구체적으로, 본 발명에 따른 전기화학적 면역센서의 제조방법은,
(a) 피라나 용액(Piranha solution)으로 세척한 ITO 전극을 다시 물로 세척하여 전극 표면에 (-) 전하를 형성하는 단계;
(b) 상기 (-) 전하가 형성된 전극을 (+) 전하를 띄는 PEI 수용액에 딥핑(Dipping)한 후, 물로 세척하는 단계;
(c) 상기 세척된 전극을 수산화기-풍부 환원된 그래핀 산화물(HRGO) 수용액에 딥핑한 후 물로 세척하여, 전극 표면에 수산화기-풍부 환원된 그래핀 산화물(HRGO)을 형성하는 단계; 및
(d) 상기 수산화기-풍부 환원된 그래핀 산화물(HRGO)이 형성된 전극 표면에 트라이메톡시실레인-폴리에틸렌글라이콜-엔석신이미딜에스터 폴리머(Poly(TMSMA-r-PEGMA-r-NAS))를 코팅한 후, 어닐링(Annealing)하는 단계;를 포함한다.
상기 (a) 단계는 전극을 1차 및 2차 세척하여 전극 표면에 (-) 전하를 형성함으로써, 이후 (+) 전하의 PEI가 정전기적 상호작용을 통해 효과적으로 전극 표면에 고정될 수 있도록 하는 단계이다.
여기서, 상기 1차 세척은 세척 용액으로 에탄올, 아세톤 및 피라나 용액(Piranha solution)을 순차 적용하거나, 에탄올/아세톤 혼합 용액 및 피라나 용액을 순차 적용하여 연속적으로 수행될 수 있다. 상기 피라나 용액은 약 70%의 황산과 30%의 과산화수소의 혼합 용액으로, 이를 통해 ITO의 불순물을 완벽하게 제거함으로써 면역분석의 정확성을 제고할 수 있다.
상기 (b) 단계는 (-) 전하가 형성된 전극을 (+) 전하를 띄는 PEI로 표면개질함으로써, 이후 HRGO와 PEI 간의 정전기적 상호작용을 통해 HRGO가 전극 표면에 효과적으로 형성될 수 있도록 준비하는 단계이다.
또한, 본 단계에서는 ITO 전극을 PEI 용액에 딥핑(Dipping)한 후 물(예컨대, 증류수)로 세척하는 과정을 거치는바, 이는 ITO 전극의 표면에 전하를 부여하여 추후 ITO 전극 상에 HRGO를 형성시킬 때 보다 강한 고정을 유도할 수 있다는 점에서 유리하게 작용할 수 있다.
상기 (c) 단계는 상기 PEI로 개질된 전극 표면에 HRGO를 형성(Deposition)함으로써, 전기화학적 촉매 활성(Electrocatalytic activity)이 우수한 HRGO가 수식된 ITO 전극 표면을 준비하는 단계이다.
본 단계에서, 상기 HRGO의 형성은 딥코팅, 스핀코팅, 스크린코팅, 옵셋인쇄, 잉크젯 프린팅, 스프레이법, 패드프린팅, 나이프코팅, 키스코팅, 그라비아코팅, 붓질, 초음파 미쇄분무코팅, 스프레이-미스트 분무코팅 등의 방법으로 수행할 수 있다. 바람직하게는, 전극을 0.25 ~ 1.0 mg/mL 정도의 HRGO 용액에 약 1 ~ 2시간 동안 딥핑(Dipping)하여 HRGO를 전극에 코팅할 수 있다.
상기 (d) 단계는 상기 HRGO가 형성된 전극 표면을 Poly(T.P.N.)로 코팅 및 재차 개질함으로써, HRGO에 Poly(T.P.N.)을 고정시키고 이후 1차 항체가 결합될 수 있는 연결 부분을 준비하여 본 발명에 따른 전기화학적 면역센서를 최종적으로 완성하는 단계이다.
본 단계에서, 상기 Poly(T.P.N.)의 코팅은 전술한 HRGO에서의 코팅 방법들을 사용하여 수행할 수 있으며, 바람직하게는 HRGO로 개질된 전극에 1.5% 정도의 Poly(T.P.N.) 용액을 드롭 코팅하여 수행할 수 있다.
또한, 상기 Poly(T.P.N.)을 코팅한 후 시트르산 버퍼 등을 이용해 세정하는 과정을 거칠 수 있다.
특히, 본 단계에서는 상기 Poly(T.P.N.)의 코팅 및 세정 후 100℃ 정도의 온도에서 약 5분 동안 어닐링(Annealing)하는 과정을 거치는바, 이를 통해 Poly(T.P.N.)의 실레인기가 HRGO의 수산화기와 더욱 잘 결합할 수 있게 된다.
전기화학적 면역분석법( Electrochemical immunoassay )
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기한 바와 같은 본 발명의 전기화학적 면역센서를 사용하여 샌드위치 ELISA(Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, Direct ELISA라고도 함) 방법으로 표적 항원을 검출하는 전기화학적 면역분석법(Electrochemical immunoassay)이 제공된다.
본 발명에 따른 면역분석법은 HRGO 및 Poly(T.P.N.)으로 표면개질된 전극에 표적 항원 및 이에 특이적인 항체(1차 항체 및 2차 항체)를 고정시켜 전기화학적으로 항원을 검출하는 방법으로서, 발색되는 정도를 분광광도계를 이용해 항원-항체 반응을 측정하는 종래의 통상적인 샌드위치 ELISA 방법과 차별화된다.
구체적으로, 본 발명에 따른 전기화학적 면역분석법은,
(s1) 1차 항체(Primary antibody)를 본 발명의 전기화학적 면역센서에 노출시켜 고정시킨 후, 고정되지 않은 것을 PBST로 닦아주고, 다시 물로 세척하는 단계;
(s2) 표적 항원을 상기 1차 항체가 고정된 전기화학적 면역센서에 노출시켜 고정시킨 후, 고정되지 않은 것을 PBST로 닦아주고, 다시 물로 세척하는 단계;
(s3) 2차 항체(Secondary antibody)를 상기 표적 항원이 고정된 전기화학적 면역센서에 노출시켜 고정시킨 후, 고정되지 않은 것을 PBST로 닦아주고, 다시 물로 세척하는 단계; 및
(s4) 전해질을 준비된 전기화학적 면역센서의 전극에 노출시켜 화학적 촉매반응을 일으킨 후, 전기화학을 통해 생성된 물질의 양을 순환전압전류법을 이용해 검출해내는 단계;를 포함한다.
상기 (s1) 단계는 1차 항체를 전기화학적 면역센서에 노출시켜 이를 전극에 코팅된 Poly(T.P.N.)에 고정시키는 단계이다.
본 발명에 있어서, 상기 1차 항체는 검출대상인 표적 항원의 종류에 따라 달라질 것이며, 구체적으로 상기 1차 항체는 Anti-Mouse IgG일 수 있다.
상기 (s2) 단계는 임의의 농도의 표적 항원을 상기 1차 항체가 고정된 전기화학적 면역센서에 노출시켜 표적 항원을 상기 1차 항체에 고정시키는 단계이다.
이때, 노출되는 표적 항원 시료는 검출이 필요한 해당 항원을 포함하는 임의의 샘플일 수 있으며, 예를 들어 사람의 혈청 샘플일 수 있다.
본 발명의 전기화학적 면역분석법은 Mouse IgG specific antigen에 특이적인 선택성을 보이나, Mouse IgG specific antigen 이외의 다른 검출 타겟에의 적용 가능성을 완전히 배제하는 것은 아니다.
상기 (s3) 단계는 효소가 결합된 2차 항체를 상기 표적 항원이 고정된 전기화학적 면역센서에 노출시켜 이를 표적 항원에 고정시키는 단계이다.
본 발명에 있어서, 상기 2차 항체는 검출대상인 표적 항원의 종류에 따라 달라질 것이며, 구체적으로 상기 2차 항체는 HRP(Horseradish peroxidase)로 표지된 Anti-Mouse IgG(Anti-Mouse IgG-HRP)일 수 있다.
상기 (s4) 단계는 전해질을 상기 1차 항체-표적 항원-2차 항체가 순차 고정된 전기화학적 면역센서에 노출시켜 효소에 의한 화학적 촉매반응을 일으킨 후, 전기화학을 통해 생성된 물질의 양을 순환전압전류법 등을 이용해 검출하여 최종적으로 전기화학적 면역분석의 결과를 획득하는 단계이다.
본 단계에서, 상기 전해질은 2차 항체에 결합된 효소(예컨대, HRP)에 대한 일종의 기질로서 작용하며, 예를 들어 상기 전해질로는 과산화수소(H2O2) 및 하이드로퀴논(HQ) 용액을 사용할 수 있다. 이 경우 전해질을 이용한 효소반응을 통해 생성된 벤조퀴논(BQ)의 전기화학적 환원 결과를 토대로 표적 항원을 정량해 낼 수 있다.
한편, 본 단계에서는 산화-환원 전류를 측정하기 위해 전극 시스템을 이용할 수 있다. 여기서, 전극은 단일 전극 또는 2개 이상의 전극을 이용할 수 있으며, 예를 들어 3 전극 시스템인 경우에는 작업전극, 상대전극 및 기준전극의 시스템을 이용할 수 있다. 상기 작업전극으로는 금, 은, 구리, 백금탄소, ITO 또는 알루미늄 전극 등을 사용할 수 있고, 상기 상대전극으로는 금, 은, 구리, 백금, 알루미늄 또는 백금 와이어 등을 사용할 수 있으며, 상기 기준전극으로는 염화은(AgCl) 전극, 칼로멜 전극 또는 황산수은(I) 전극 등을 사용할 수 있다.
일 구체예에서, 본 단계는 상기 준비된 전기화학적 면역센서의 전극(ITO 전극)을 작업전극으로, 백금전극을 상대전극으로, Ag/AgCl 전극을 기준전극으로 사용하여 수행될 수 있다.
이하, 실시예 및 실험예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐 어떠한 의미로든 본 발명의 범위가 이들 예로 한정되는 것은 아니다.
제조예 : 수산화기 -풍부 환원된 그래핀 산화물( HRGO )의 합성 (도 1)
Modified hummer's method를 통해 그래파이트(Graphite)를 그래핀 산화물(Graphene Oxide; GO)로 만들어 주었다.
1 mg/mL의 그래핀 산화물(GO) 용액에 50 mg/mL의 K2S2O8 용액을 그래핀 산화물과 K2S2O8의 질량비가 1:5가 되도록 가하였다. 이후, 상기 혼합물을 가열하기 전에 Schlenk 방법으로 전체 환경을 질소로 바꿔준 다음, 음파처리장치에 넣어서 60℃에서 12시간 동안 가열함으로써 그래핀 산화물 표면에 수산화기를 도입하여 퍼옥소디설페이트에 의해 산화된 그래핀 산화물(Peroxodisulfate oxidized graphene oxide; PGO)을 제조하였다. 반응이 종결된 후, 2주일 동안 투석하여 반응에 사용되고 남은 K2S2O8을 제거하였다.
0.2 mg/mL의 상기 PGO 100 mL에 암모니아수 100 uL를 가하여, pH를 10 ~ 11로 조정하였다. 이후, 여기에 하이드라진 55 uL를 가하고 오일욕조에서 85℃로 4시간 동안 가열한 뒤, 반응 혼합물을 상온에서 식힌 후 원심분리하여 반응 중에 응집된 입자들을 가라앉히고 상층액을 취하여, 수산화기-풍부 환원된 그래핀 산화물(HRGO)을 제조하였다.
실시예 : HRGO / Poly (T.P.N.)으로 개질된 전극의 제조, 및 샌드위치 ELISA 프로토콜을 이용한 면역분석 (도 2)
에탄올/아세톤 그리고 피라나 용액(Piranha solution)을 통해 세척된 Indium Tin Oxide(ITO) 전극을 다시 물로 세척해 주어 (-) 전하를 띄게 만들었다.
준비된 ITO 전극을 (+) 전하를 띄는 PEI 1% 수용액에 1시간 동안 담가둔 후 물로 세척하였다.
세척된 ITO 전극을 상기 합성한 HRGO 0.1 mg/mL 수용액에 2시간 동안 담근 후 물로 세척하여, HRGO가 수식된 ITO 전극 표면을 준비하였다.
HRGO가 수식된 전극 표면에 1.5% Poly(T.P.N.)을 1시간 동안 코팅 후 시트르산 버퍼(pH 3.3)를 이용해 씻어준 다음 100℃에서 5분 동안 어닐링 해주어, 전기화학적 면역분석(Electrochemical immunoassay)을 위한 전극을 제조하였다.
상기 제조된 전극을 이용하여 샌드위치 ELISA 방법을 통해 항체 및 항원을 표면에 고정시켜 전기화학적 면역분석을 수행하였다.
먼저, 1차 항체(Primary antibody)에 해당하는 100 ug/mL Anti-Mouse IgG(용매 0.1 M PBS + 0.05% tween 20)를 150 uL 노출시켜 고정시킨 후, 고정되지 않은 것은 0.1 M PBST로 닦아주고, 다시 물로 세척하였다.
농도별(100 ag/mL ~ 10 ug/mL)로 항원에 해당하는 Mouse IgG specific antigen을 150 uL 노출시켜 고정시킨 후, 고정되지 않은 것은 0.1 M PBST로 닦아주고, 다시 물로 세척하였다.
이어서, 2차 항체(Secondary antibody)에 해당하는 20 ug/mL Anti-Mouse IgG-HRP(용매 0.1 M PBS + 0.05% tween 20)를 150 uL 노출시켜 고정시킨 후, 고정되지 않은 것은 0.1 M PBST로 닦아주고, 다시 물로 세척하였다.
준비된 전극을 작업전극으로 이용하고 상대전극은 백금전극, 기준전극은 Ag/AgCl 전극을 사용하여 전기화학을 진행하였다.
전기화학시에 전해질은 1.5 mM 과산화수소(H2O2)와 2.0 mM 하이드로퀴논(HQ)을 0.1 M PBS 용매 하에 사용하였고, 전해질을 전극에 5분 동안 노출시켜 화학적 촉매반응을 일으킨 후에 전기화학을 통해 생성된 벤조퀴논(BQ)의 양을 순환전압전류법을 이용해 검출하였다.
상기와 같은 제조과정, 분석과정 및 효소작용에 의해 생성된 벤조퀴논(BQ)의 전기화학적 환원에 관한 모식도를 도 2에 나타내었다.
실험예 1: 선택성 테스트( Selectivity test ) (도 3)
CV(순환전압전류법, Cyclic Voltammetry)를 통해 각기 다른 그래핀 상태 및 각기 다른 단백질에 따른 선택성 실험을 실시하였다.
도 3의 (a)는 각각 다른 그래핀 상태에 1 ug/mL Mouse IgG specific antigen에 따른 벤조퀴논(BQ) 환원 전류를 나타낸 것이다.
(a)의 결과, 그래핀을 올리지 않은 경우 Signal이 전혀 나오지 않고, PGO를 올려서 실험을 한 경우 전기화학적 촉매 활성(Electrocatalytic activity)이 떨어짐을 확인할 수 있다.
도 3의 (b)는 각각 다른 단백질 1 ug/mL IgG에 따른 벤조퀴논(BQ) 환원 전류를 나타낸 것이다.
(b)의 결과, 헤모글로빈이나 트롬빈의 경우는 거의 신호가 나오지 않고, 어느 정도 비슷한 구조를 가지는 Rabbit IgG나 Rat IgG는 약간 더 큰 신호가 나오지만 Mouse IgG specific antigen에는 크게 못 미쳤다. 즉 본 발명의 전기화학적 면역센서는 항원인 Mouse IgG specific antigen에 특이적으로 반응함을 확인할 수 있다.
실험예 2: Mouse IgG specific antigen 농도에 따른 CVs (도 4 및 도 5)
상기 실시예에 따라 최적화된 조건으로 개질된 전극에서의 Mouse IgG specific antigen 농도에 따른 CV(Cyclic Voltammogram)를 도 4 및 도 5에 나타내었다.
도 4의 좌측 그래프는 Mouse IgG specific antigen Blank부터 10 fg/mL까지,
도 4의 우측 그래프는 Mouse IgG specific antigen 100 fg/mL부터 10 pg/mL까지,
도 5의 좌측 그래프는 Mouse IgG specific antigen 100 pg/mL부터 10 ng/mL까지,
도 5의 우측 그래프는 Mouse IgG specific antigen 100 ng/mL부터 10 ug/mL까지의 CV 결과이다.
즉, 본 발명에 따른 전기화학적 면역센서를 이용하여 샌드위치 ELISA 방법으로 면역분석을 수행할 경우, 100 ag/mL에 이르는 매우 낮은 농도의 표적 항원도 고감도로 검출해낼 수 있었다.
실험예 3: 서로 다른 Mouse IgG specific antigen 농도에서 면역센서 반응에 관한 Calibration plot (도 6)
HRGO/Poly(T.P.N.)으로 개질된 표면에서의 Calibration plot을 도 6에 나타내었다.
각각의 농도의 평균 전류에서 Mouse IgG specific antigen Blank 전류의 평균값 + 3 표준편차를 빼주었을 때 나오는 Calibration plot으로서, Blank는 7번 실험을 한 값이고, 각각의 농도는 서로 다른 3개의 전극에서 실험한 전류 값의 평균 및 표준편차이다.
그 결과, 100 ag/mL부터 1 ng/mL까지 한 개의 Linear response, 그리고 10 ng/mL부터 10 ug/mL까지 또 다른 Linear response를 보임을 확인할 수 있었으며, 100 ug/mL 이상에서는 포화됨을 확인하였다.
실험예 4: 서로 다른 PSA 농도에서 면역센서 반응에 관한 Calibration plot (도 7)
상기 실시예에 따라 최적화된 조건으로 개질된 전극에 있어, PSA(Prostate Specific Antigen) 표준 곡선을 100 fg/mL부터 100 pg/mL까지, 및 1 ng/mL부터 10 ng/mL까지의 두 개 구간으로 나누어 회귀곡선과 기울기를 도 7에 표시하였다.
실험예 5: 사람 혈청에서의 Spiked PSA 테스트 (도 8)
2개의 실제 샘플에 대해 진행한 사람 혈청에서의 Spiked PSA 실험결과를 도 8에 표로서 나타내었다. 이는 Real human serum에 2개의 농도(정상인 농도: 1 ng/mL, 환자 농도: 5 ng/mL)를 설정하여 나온 Spiked test 값이다.
Real human serum은 먼저 50배의 0.1 M PBST에 녹인 말 혈청(Horse serum)을 이용해서 10000배를 묽혀 사용하였으며, 각각 샘플에 대해서 나온 농도는 3회의 실험을 하여 평균값을 낸 후, 전술한 도 7의 표준 곡선에 대입하여 농도를 계산하였다.
이렇게 계산된 농도를 도 8 표의 두 번째 열인 "표준곡선을 통해 계산된 농도"에 기재하였다. 세 번째 열의 "spiked 된 PSA protein에 의해 증가된 real sample 측정 농도"는 [Spiked sample의 농도 － Blank의 농도 (원래 real sample이 포함하고 있는 PSA 농도)]를 나타낸다.
세 번째 열의 값이 두 번째 열과 거의 차이가 없는 것은 Blank에서 나오는 농도 값이 굉장히 작기 때문이며, 마지막 열에는 recovery(%)를 기재하였다.
이를 통해, 본 발명에 따른 전기화학적 면역센서를 이용한 Real sample detection이 가능함을 예상할 수 있다.

Claims (12)

  1. 전극;
    상기 전극 표면 상에 형성된 수산화기-풍부 환원된 그래핀 산화물(HRGO); 및
    상기 수산화기-풍부 환원된 그래핀 산화물(HRGO) 상에 코팅 및 결합된 트라이메톡시실레인-폴리에틸렌글라이콜-엔석신이미딜에스터 폴리머(Poly(TMSMA-r-PEGMA-r-NAS))를 포함하는 전기화학적 면역센서.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 전극은 ITO(Indium Tin Oxide) 전극인 것을 특징으로 하는 전기화학적 면역센서.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 전극 표면은 PEI(Polyethyleneimine)에 의해 전처리된 것을 특징으로 하는 전기화학적 면역센서.
  4. (a) 피라나 용액(Piranha solution)으로 세척한 ITO 전극을 다시 물로 세척하여 전극 표면에 (-) 전하를 형성하는 단계;
    (b) 상기 (-) 전하가 형성된 전극을 (+) 전하를 띄는 PEI 수용액에 딥핑(Dipping)한 후, 물로 세척하는 단계;
    (c) 상기 세척된 전극을 수산화기-풍부 환원된 그래핀 산화물(HRGO) 수용액에 딥핑한 후 물로 세척하여, 전극 표면에 수산화기-풍부 환원된 그래핀 산화물(HRGO)을 형성하는 단계; 및
    (d) 상기 수산화기-풍부 환원된 그래핀 산화물(HRGO)이 형성된 전극 표면에 트라이메톡시실레인-폴리에틸렌글라이콜-엔석신이미딜에스터 폴리머(Poly(TMSMA-r-PEGMA-r-NAS))를 코팅한 후, 어닐링(Annealing)하는 단계;
    를 포함하는 전기화학적 면역센서의 제조방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 (d) 단계에서, 상기 어닐링은 100℃에서 5분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 전기화학적 면역센서의 제조방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 전기화학적 면역센서를 사용하여 표적 항원을 검출하는 전기화학적 면역분석법(Electrochemical immunoassay).
  7. 제6항에 있어서,
    상기 전기화학적 면역센서를 사용하여 샌드위치 ELISA 방법으로 표적 항원을 검출하는 것을 특징으로 하는 전기화학적 면역분석법.
  8. 제7항에 있어서,
    (s1) 1차 항체(Primary antibody)를 상기 전기화학적 면역센서에 노출시켜 고정시킨 후, 고정되지 않은 것을 PBST로 닦아주고, 다시 물로 세척하는 단계;
    (s2) 표적 항원을 상기 1차 항체가 고정된 전기화학적 면역센서에 노출시켜 고정시킨 후, 고정되지 않은 것을 PBST로 닦아주고, 다시 물로 세척하는 단계;
    (s3) 2차 항체(Secondary antibody)를 상기 표적 항원이 고정된 전기화학적 면역센서에 노출시켜 고정시킨 후, 고정되지 않은 것을 PBST로 닦아주고, 다시 물로 세척하는 단계; 및
    (s4) 전해질을 준비된 전기화학적 면역센서의 전극에 노출시켜 화학적 촉매반응을 일으킨 후, 전기화학을 통해 생성된 물질의 양을 순환전압전류법을 이용해 검출해내는 단계;
    를 포함하는 전기화학적 면역분석법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 2차 항체는 HRP(Horseradish peroxidase)로 표지된 것임을 특징으로 하는 전기화학적 면역분석법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 (s4) 단계는 전해질로서 과산화수소 및 하이드로퀴논 용액을 상기 준비된 전기화학적 면역센서의 전극에 노출시켜 화학적 촉매반응을 일으킨 후, 생성된 벤조퀴논의 양을 순환전압전류법을 이용해 검출해내는 것임을 특징으로 하는 전기화학적 면역분석법.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 1차 항체는 Anti-Mouse IgG이고, 상기 표적 항원은 Mouse IgG specific antigen이며, 상기 2차 항체는 HRP로 표지된 Anti-Mouse IgG(Anti-Mouse IgG-HRP)인 것을 특징으로 하는 전기화학적 면역분석법.
  12. 제8항에 있어서,
    상기 (s4) 단계에서, 상기 준비된 전기화학적 면역센서의 전극을 작업전극으로, 백금전극을 상대전극으로, Ag/AgCl 전극을 기준전극으로 사용하는 것을 특징으로 하는 전기화학적 면역분석법.
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