CN110726707A - 基于N-Ti3C2QDs与邻苯二胺氧化物的复合纳米探针及其比率荧光检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于基于N‑Ti3C2QDs与邻苯二胺氧化物的复合纳米探针,并公开了该探针用于H2O2和黄嘌呤的比率荧光检测方法,该探针是由N‑Ti3C2QDs与DAP通过π‑π共轭和氢键结合形成的用于H2O2或黄嘌呤的比率荧光检测的复合纳米探针。本发明首次应用MXene二维材料合成的量子点建立基于光诱导电子转移效应(PET)的H2O2的双发射反向比率荧光传感平台。并且,基于黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶的特异性催化下产生H2O2的作用,实现了黄嘌呤的比率荧光检测。本发明中的检测方法具有免标记、高灵敏度、高准确性、低成本检测的优点,具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于分析检测技术领域,具体涉及基于N-Ti3C2QDs与邻苯二胺氧化物的复合纳米探针及其比率荧光检测方法,尤其是用于H2O2或黄嘌呤的比率荧光检测方法。
背景技术
在生命过程中,过氧化氢(H2O2)通过有氧呼吸产生,并作为信号通路的信使。过度生成的H2O2的积累导致氧化应激和相应的病理变化,这与帕金森病和阿尔茨海默病密切相关。因此,H2O2可以作为一种潜在的诊断标志物。然而,由于H2O2浓度较低,其在这些神经元功能障碍中的确切作用及其与其他疾病的关系尚未阐明。
另外,作为氧化酶的一般产物,H2O2可以作为一个通用的信号分子来探测特定氧化酶或其底物的表达,在生物分析中被广泛应用。黄嘌呤是嘌呤核苷酸和脱氧核苷酸代谢的中间产物,在黄嘌呤氧化酶(XOD)的催化下产生H2O2。血浆中黄嘌呤水平可用于痛风、黄嘌呤尿、高尿酸血症等多种疾病的诊断。
由于具有高灵敏度、多用途适应性和安全性,荧光是现代传感器中最常见的信号输出方式之一。然而,大多数荧光传感器都是根据单一波长的发射数据进行检测,容易受到激发源的波动、检测探针数量的不准确以及微环境的干扰。这些不稳定因素会导致很高的系统误差,导致不准确和不可复制的结果。
综上所述,实现快速准确、灵敏检测H2O2和黄嘌呤是现在研究的热点之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种由N掺杂的Ti3C2QDs(N-Ti3C2QDs)与邻苯二胺的氧化物2,3-二氨基吩嗪(2,3-diaminophenazine,DAP)构建的N-Ti3C2QDs@DAP复合纳米探针,并提供了其用于H2O2和黄嘌呤的检测方法。本发明首次应用MXene二维材料合成的量子点建立基于光诱导电子转移效应(PET)的H2O2的双发射反向比率荧光传感平台。并且,基于黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶的特异性催化下产生H2O2的作用,实现了黄嘌呤的比率荧光检测。该方法基于荧光检测,但与已有的荧光检测的传感系统相比,具有更高灵敏度和更高准确性的特点。此外,N-Ti3C2QDs的应用使得该传感平台具有免标记、低成本的特点。本发明综合利用了N-Ti3C2QDs高荧光产率、高稳定性的优势和DAP引起的PET致荧光猝灭,合成了N-Ti3C2QDs@DAP复合纳米探针,成功构建了可以实现H2O2及黄嘌呤的传感平台。能够克服现有检测方法灵敏度低,检测耗时,成本过高以及步骤繁琐的缺点。
上述目的是通过以下技术方案实现的:
一种基于N-Ti3C2QDs与邻苯二胺氧化物的复合纳米探针,该探针N-Ti3C2QDs@DAP是由N-Ti3C2QDs与DAP通过π-π共轭和氢键结合形成的用于H2O2或黄嘌呤的比率荧光检测的复合纳米探针。
本发明所述N-Ti3C2QDs是以Ti3C2MXene为原料,N,N-二甲基甲酰胺为溶剂,合成的量子点,DAP是邻苯二胺在H2O2和辣根过氧化物酶的作用下形成的氧化产物。
上述N-Ti3C2QDs是通过以下方法制备的:
将Ti3C2MXene溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中,两者重量体积比(mg/ml)为1:1,N2保护下超声除氧20-30min,NH3·H2O调节pH至9.0,再于N2保护下迅速转移至反应釜115-125℃下反应5-6h,冷却至室温后用微孔滤膜过滤制得。所述的微孔滤膜优选孔径为0.22μm。
本发明所述的基于N-Ti3C2QDs与邻苯二胺氧化物的用于H2O2的比率荧光检测的复合纳米探针是通过以下方法制备的:
(1)将H2O2溶液与40mM邻苯二胺,8U/mL辣根过氧化物酶在PB缓冲液中混合,其中,H2O2溶液、40mM邻苯二胺、8U/mL辣根过氧化物酶和PB缓冲液的体积比为1:19:1:5,36-38℃下避光孵育50-55min,形成DAP,所述H2O2溶液为H2O2经PB缓冲液稀释的H2O2溶液,浓度范围是2μM-50μM;
(2)将N-Ti3C2QDs加入按照步骤(1)方法合成的DAP中,混合形成N-Ti3C2QDs@DAP探针;其中,N-Ti3C2QDs与DAP的体积比为4:26。
本发明所述的基于N-Ti3C2QDs与邻苯二胺氧化物的用于黄嘌呤的比率荧光检测的复合纳米探针是通过以下方法制备的:
(1)将黄嘌呤溶液与40mM邻苯二胺,8U/mL辣根过氧化物酶,100μg/mL黄嘌呤氧化酶在PB缓冲液中混合,其中,黄嘌呤溶液、40mM邻苯二胺、8U/mL辣根过氧化物酶、100μg/mL黄嘌呤氧化酶和PB缓冲液的体积比为15:19:1:1:20,36-38℃下避光孵育50-55min,形成DAP,所述黄嘌呤溶液为黄嘌呤经PB缓冲液稀释的黄嘌呤溶液,浓度范围是1μM-50μM;
(2)将N-Ti3C2QDs加入按照步骤(1)合成的DAP中,混合形成N-Ti3C2QDs@DAP探针;其中N-Ti3C2QDs与DAP的体积比为4:56。
上述PB缓冲液的浓度为10mM,pH=7.4,所述PB缓冲液可以为Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液。
一种基于N-Ti3C2QDs与邻苯二胺氧化物的复合纳米探针用于H2O2的比率荧光检测方法,该检测方法包括如下步骤:
a)将浓度范围在2μM-50μM的多个不同浓度的H2O2溶液与邻苯二胺,辣根过氧化物酶在缓冲液中混合并孵育制得DAP;该步骤中的H2O2溶液为H2O2经PB缓冲液稀释的H2O2溶液,所述的孵育为在36-38℃下孵育50-55min;优选孵育为在37℃下孵育50min。
b)将N-Ti3C2QDs与步骤a)得到的DAP混合形成N-Ti3C2QDs@DAP探针混合溶液。
c)测定步骤b)得到的N-Ti3C2QDs@DAP探针混合溶液在369nm激发波长下,448nm和560nm处的荧光值;利用测得的I560与I448的值,获得H2O2浓度与荧光强度比率的线性关系;
d)将待测样品根据步骤c)所得到的线性关系与待测样品获得的荧光强度比率,得到待测样品中H2O2的浓度。
上述方法中步骤c)具体为:将N-Ti3C2QDs@DAP探针混合溶液在激发波长为369nm,测定448nm和560nm处的荧光值;扫描速度为1200nm/min,光电倍增管电压为600V,激发狭缝和发射狭缝宽度分别为5nm,10nm,利用测得的I560与I448的比值,获得H2O2浓度与荧光强度比率的线性关系。
一种基于N-Ti3C2QDs与邻苯二胺氧化物的复合纳米探针用于黄嘌呤的比率荧光检测方法,该检测方法包括如下步骤:
a)将浓度范围在1μM-50μM的多个不同浓度的黄嘌呤溶液与邻苯二胺,黄嘌呤氧化酶,辣根过氧化物酶在缓冲液中混合并孵育制得DAP,所述的孵育为在36-38℃下孵育50-55min;优选孵育为在37℃下孵育50min。
b)将N-Ti3C2QDs与步骤a)得到的DAP混合形成N-Ti3C2QDs@DAP探针混合溶液。
c)测定步骤b)得到的N-Ti3C2QDs@DAP探针混合溶液在369nm激发波长下,448nm和560nm处的荧光值;利用测得的I560与I448的值,获得黄嘌呤浓度与荧光强度比率的线性关系;
d)将待测样品根据步骤c)所得到的线性关系与待测样品获得的荧光强度比率,得到待测样品中黄嘌呤的浓度。
上述方法中步骤c)具体为:将N-Ti3C2QDs@DAP探针混合溶液在激发波长为369nm,测定448nm和560nm处的荧光值;扫描速度为1200nm/min,光电倍增管电压为600V,激发狭缝和发射狭缝宽度分别为5nm,10nm,利用测得的I560与I448的比值,获得黄嘌呤浓度与荧光强度比率的线性关系。
本发明的有益效果:
1)本发明首次将N-Ti3C2QDs与DAP组成纳米复合探针,也是首次发现DAP可以通过PET猝灭N-Ti3C2QDs,同时这也是N-Ti3C2QDs首次应用于H2O2和黄嘌呤分析领域。
2)本发明采用N-Ti3C2QDs@DAP作为荧光探针,参与H2O2和黄嘌呤的检测。这种荧光探针与常用的有机荧光分子相比,具有单一激发双发射的优点。同时,N-Ti3C2QDs具有N元素掺杂的特点,大大提高了量子点的荧光量子产率。
3)本发明首次将N-Ti3C2QDs用于构建基于光诱导电子转移(PET)的H2O2和黄嘌呤传感平台,与已有的荧光检测的传感系统相比,具有更高灵敏度和更高准确性的特点。本分析方法不需要复杂的温度控制,只需要简单的加样就能在均相溶液中检测H2O2和黄嘌呤。可以用于人血清中H2O2和黄嘌呤的定量检测,具有良好的回收率。
4)与现有技术相比,本发明具有免标记、高灵敏度、高准确性、低成本检测的优势,具有良好的应用前景。
附图说明
图1A、B分别是N-Ti3C2QDs的TEM及尺寸分布图,图1C、D分别是N-Ti3C2QDs的AFM和高度分布图;
图2A是N-Ti3C2QDs的XRD光谱图,图2B是N-Ti3C2QDs的XPS光谱图;
图3是本发明实施例1进行不同浓度H2O2检测的荧光光谱图,其内插图是荧光比值和H2O2浓度的线性拟合结果。
图4是本发明实施例2所述比例荧光探针在不同浓度黄嘌呤存在下的荧光光谱,其内插图是黄嘌呤检测的线性拟合结果。
图5是实施例3中所述的本方法检测H2O2的选择性结果图,图中,DA,AA,Phe,Glu,Lys,L-Cys,Tyr,GSH,GSSG分别是多巴胺、抗坏血酸、苯丙氨酸、葡萄糖、赖氨酸、L-半胱氨酸、酪氨酸、谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽,从图中可以看出本方法对目标物H2O2具有良好的选择性。
图6是实施例3中所述的本方法检测黄嘌呤的选择性结果图,图中,Adenosine,DA,AA,UA,Cytidine,guanosine,Urea,Glu分别是腺苷,多巴胺,抗坏血酸,尿酸,胞嘧啶核苷,鸟嘌呤核苷,脲,葡萄糖,从图中可以看出本方法对目标物黄嘌呤具有良好的选择性。
图7中AB分别是实施例4中人血清中H2O2和黄嘌呤的检测结果(n=3)。
图8是实施例5所述的N-Ti3C2QDs和N-Ti3C2QDs+DAP的荧光寿命谱图。
具体实施方式
以下通过具体实施例说明本发明,但本发明并不仅仅限定于这些实施例。
药品和试剂:实验中使用的辣根过氧化物酶,多巴胺,腺苷,鸟嘌呤核苷,胞嘧啶核苷,硫酸奎宁,硝酸银和四水合氯化亚铁购买自阿拉丁试剂。N,N-二甲基甲酰胺,氨水,磷酸二氢钠,磷酸氢二钠,抗坏血酸,氯化钾,氯化钙,七水合硫酸锌,碘化钾,溴化钾,五水合硫酸铜,谷胱甘肽,氧化型谷胱甘肽,葡萄糖和尿酸购买自国药集团化学试剂有限公司。过氧化氢(30%)和碳酸钠购买自上海凌峰化学试剂有限公司。邻苯二胺和黄嘌呤购买自麦克林。黄嘌呤氧化酶购买自上海源叶生物科技有限公司。苯丙氨酸,牛血清白蛋白和酪氨酸购买自中国惠兴生化试剂有限公司。Ti3C2Mxene二维材料购买自吉林11科技公司。六水和氯化镁购买自生工生物工程(上海)股份有限公司。L-半胱氨酸和二点五水合氯化镉购买自广东光华化学厂有限公司。荧光光谱实验由HITACHI F-4700荧光分光光度计获得(日本)。
实施例1
一种基于N-Ti3C2QDs与邻苯二胺氧化物的复合纳米探针用于H2O2的比率荧光检测方法,包括如下步骤:
(1)N-Ti3C2QDs的合成:将15mg Ti3C2MXene溶解于15mL DMF中,N2保护下超声除氧30min,NH3·H2O调节pH至9.0,接着,N2保护下迅速转移至反应釜120℃下反应6h,冷却至室温后用0.22μm微孔滤膜过滤。
N-Ti3C2QDs的表征见图1和图2。
图1A、B分别是N-Ti3C2QDs的TEM及尺寸分布图,经ImageJ计算分析,N-Ti3C2QDs分布均匀,平均粒径为3.4±0.5nm;图1A内插图为HRTEM图,进一步揭示了N-Ti3C2QDs的晶体特征。图1C,D分别为通过AFM测量进一步对N-Ti3C2QDs的形貌和厚度的表征,N-Ti3C2QDs的尺寸分布在0.5~1.3nm的厚度范围内。
图2A是N-Ti3C2QDs的XRD光谱图,25.5°处的峰归属于N-Ti3C2QDs表面TiO2的形成,表明了N-Ti3C2QDs的形成。图2B是N-Ti3C2QDs的XPS光谱图,284.8、400.1、532.3和457.1eV处的峰分别属于C 1s、N 1s、O 1s和Ti 2p元素,进一步表明了N-Ti3C2QDs的合成。
(2)N-Ti3C2QDs@DAP探针的制备:将体积为10μL浓度分别为2μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM的H2O2溶液与190μL浓度为40mM的邻苯二胺、10μL浓度为8U/mL的辣根过氧化物酶和50μL的PB缓冲溶液在37℃条件下混合避光孵育50min。接着加入40μL步骤1)制备的N-Ti3C2QDs并混合形成复合纳米探针。所述PB缓冲溶液为10mM Na2HPO4/NaH2PO4,pH=7.4。
(3)检测H2O2的线性:将N-Ti3C2QDs@DAP探针混合溶液在激发波长为369nm,测定448nm和560nm处的荧光值;扫描速度为1200nm/min,光电倍增管电压为600V,激发狭缝和发射狭缝宽度分别为5nm,10nm,利用测得的I560与I448的比值,获得H2O2浓度与荧光强度比率的线性关系(y=0.1022x+1.4782,R2=0.9949)。结果见图3,图3是本方法进行不同浓度H2O2检测的荧光光谱图,图3的内插图是荧光比值和H2O2浓度的线性拟合结果。
(4)H2O2浓度检测:将体积为10μL的待测H2O2溶液与190μL浓度为40mM的邻苯二胺、10μL浓度为8U/mL的辣根过氧化物酶和50μL缓冲溶液在37℃条件下混合避光孵育50min。接着加入40μL步骤1)制备的N-Ti3C2QDs并混合形成复合纳米探针。将I560/I448的荧光读数代入线性方程(y=0.1022x+1.4782),计算待测H2O2浓度。
实施例2
一种基于N-Ti3C2QDs与邻苯二胺氧化物的复合纳米探针用于黄嘌呤的比率荧光检测方法,包括如下步骤:
(1)N-Ti3C2QDs的合成:将15mg Ti3C2MXene溶解于15mL DMF中,N2保护下超声除氧30min,NH3·H2O调节pH至9.0,接着,N2保护下迅速转移至反应釜120℃下反应6h,冷却至室温后用0.22μm微孔滤膜过滤。
(2)N-Ti3C2QDs@DAP探针的制备:将体积为150μL浓度分别为1μM、10μM、25μM、40μM、50μM的黄嘌呤溶液与190μL浓度为40mM的邻苯二胺、10μL浓度为100μg/mL的黄嘌呤氧化酶、10μL浓度为8U/mL的辣根过氧化物酶和200μL的PB缓冲溶液在37℃条件下混合避光孵育50min。接着加入40μL步骤1)制备的N-Ti3C2QDs并混合形成复合纳米探针。所述PB缓冲溶液为10mM Na2HPO4/NaH2PO4,pH=7.4。
(3)检测黄嘌呤的线性:将N-Ti3C2QDs@DAP探针混合溶液在激发波长为369nm,测定448nm和560nm处的荧光值;扫描速度为1200nm/min,光电倍增管电压为600V,激发狭缝和发射狭缝宽度分别为5nm,10nm,利用测得的I560与I448的比值,获得黄嘌呤浓度与荧光强度比率的线性关系(y=0.066x+1.5021,R2=0.9972)。结果见图4,图4是比例荧光探针在不同浓度黄嘌呤存在下的荧光光谱,图4的内插图是黄嘌呤检测的线性拟合结果。
(4)黄嘌呤浓度检测:将体积为150μL的待测黄嘌呤溶液与190μL浓度为40mM的邻苯二胺、10μL浓度为100μg/mL的黄嘌呤氧化酶、10μL浓度为8U/mL的辣根过氧化物酶和200μL缓冲溶液在37℃条件下混合避光孵育50min。接着加入40μL步骤1)制备的N-Ti3C2QDs并混合形成复合纳米探针。将I560/I448的荧光读数代入线性方程(y=0.066x+1.5021,R2=0.9972)计算待测黄嘌呤浓度。
实施例3
本发明检测方法的选择性实验
1)检测H2O2的选择性:重复实施例1中的步骤2)和步骤3),将其中的H2O2更换为多巴胺、抗坏血酸、苯丙氨酸、葡萄糖、赖氨酸、L-半胱氨酸、酪氨酸、谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽,K+,Mg2+,Ca2+,Na+,Zn2+,Cd2+,Fe2+,Ag+,I-和Br-等干扰物,其它条件不变,检测荧光,得到本方法检测H2O2的选择性结果图(见图5)。
图5中,DA,AA,Phe,Glu,Lys,L-Cys,Tyr,GSH,GSSG分别是多巴胺、抗坏血酸、苯丙氨酸、葡萄糖、赖氨酸、L-半胱氨酸、酪氨酸、谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽,从图中可以看出本方法对目标物H2O2具有良好的选择性。
2)检测黄嘌呤的选择性:重复实施例2中的步骤2)和步骤3),将其中的黄嘌呤更换为腺苷,多巴胺,抗坏血酸,尿酸,胞嘧啶核苷,鸟嘌呤核苷,脲,葡萄糖,K+和Ca2+等干扰物,其它条件不变,检测荧光,得到本方法检测黄嘌呤的选择性结果图(见图6)。
图6中,Adenosine,DA,AA,UA,Cytidine,guanosine,Urea,Glu分别是腺苷,多巴胺,抗坏血酸,尿酸,胞嘧啶核苷,鸟嘌呤核苷,脲,葡萄糖,从图中可以看出本方法对目标物黄嘌呤具有良好的选择性。
实施例4
本发明检测方法的回收率实验
1)H2O2的回收率实验:将体积为10μL浓度分别为10μM、20μM、30μM的H2O2与190μL浓度为40mM的邻苯二胺、10μL浓度为8U/mL的辣根过氧化物酶、10μL血清(缓冲溶液稀释100倍)和40μL缓冲溶液在37℃条件下混合避光孵育50min。接着加入40μL例1步骤1)制备的N-Ti3C2QDs并混合形成复合纳米探针。将I560/I448的荧光读数比值代入例1步骤2)得到的线性方程,得到H2O2的浓度,并获得本方法在实际样品检测中的回收率,结果见图7A、表1,结果表明回收率较好。
表1本方法检测H2O2的回收率
2)黄嘌呤的回收率实验:将体积为150μL浓度分别为10μM、20μM、30μM的黄嘌呤与190μL浓度为40mM的邻苯二胺、10μL浓度为8U/mL的辣根过氧化物酶、150μL血清(缓冲溶液稀释100倍)和50μL缓冲溶液在37℃条件下混合避光孵育50min。接着加入40μL例1步骤1)制备的N-Ti3C2QDs并混合形成复合纳米探针。将I560/I448的荧光读数比值代入例1步骤3)得到的线性方程,得到黄嘌呤的浓度,并获得本方法在实际样品检测中的回收率,结果见图7B、表2,结果表明回收率较好。
表2本方法检测黄嘌呤的回收率
实施例5
重复实施例1中的步骤1)-3),在步骤2)中,分别加入既有N-Ti3C2QDs又有H2O2的样品、只有N-Ti3C2QDs不含H2O2的样品。分别用稳态和瞬态荧光光谱仪(FM-4P-TCSPC,法国)记录这些样品在369nm激发下的荧光寿命。记录到的图谱见图8,根据图8所示,DAP存在时,N-Ti3C2QDs的荧光寿命明显缩短,是PET的有效印证。
实施例6
本发明与已报道的H2O2和黄嘌呤检测方法在分析性能上的比较,见表3、4,表中数据表明,与已有的荧光检测的传感系统相比,本发明所述检测方法具有更高的灵敏度和更高的准确性。
表3本方法与已报道的H2O2检测方法在分析性能上的比较
表4本方法与已报道的黄嘌呤检测方法在分析性能上的比较
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Claims (10)
1.一种基于N-Ti3C2 QDs与邻苯二胺氧化物的复合纳米探针,其特征在于该探针N-Ti3C2QDs@DAP是由N-Ti3C2 QDs与DAP通过π-π共轭和氢键结合形成的用于H2O2或黄嘌呤的比率荧光检测的复合纳米探针。
2.根据权利要求1所述的基于N-Ti3C2 QDs与邻苯二胺氧化物的复合纳米探针,其特征在于所述N-Ti3C2 QDs是以Ti3C2 MXene为原料,N,N-二甲基甲酰胺为溶剂,合成的量子点,DAP是邻苯二胺在H2O2和辣根过氧化物酶的作用下形成的氧化产物。
3.根据权利要求2所述的基于N-Ti3C2 QDs与邻苯二胺氧化物的复合纳米探针,其特征在于所述N-Ti3C2 QDs是通过以下方法制备的:
将Ti3C2 MXene溶解于N,N-二甲基甲酰胺中,两者重量体积比为1:1,N2保护下超声除氧20-30min,NH3·H2O调节pH至9.0,再于N2保护下转移至反应釜115-125℃下反应5-6h,冷却至室温后用微孔滤膜过滤制得。
4.根据权利要求2所述的基于N-Ti3C2 QDs与邻苯二胺氧化物的复合纳米探针,其特征在于所述用于H2O2的比率荧光检测的复合纳米探针是通过以下方法制备的:
(1)将H2O2溶液与40mM邻苯二胺,8U/mL辣根过氧化物酶在PB缓冲液中混合,其中,H2O2溶液、40mM邻苯二胺、8U/mL辣根过氧化物酶和PB缓冲液的体积比为1:19:1:5,36-38℃下避光孵育50-55min,形成DAP,所述H2O2溶液为H2O2经PB缓冲液稀释的H2O2溶液,浓度范围是2μM-50μM;
(2)将N-Ti3C2 QDs加入按照步骤(1)方法合成的DAP中,混合形成N-Ti3C2QDs@DAP探针;其中,N-Ti3C2 QDs与DAP的体积比为4:26。
5.根据权利要求2所述的基于N-Ti3C2 QDs与邻苯二胺氧化物的复合纳米探针,其特征在于所述用于黄嘌呤的比率荧光检测的复合纳米探针是通过以下方法制备的:
(1)将黄嘌呤溶液与40mM邻苯二胺,8U/mL辣根过氧化物酶,100μg/mL黄嘌呤氧化酶在PB缓冲液中混合后,其中,黄嘌呤溶液、40mM邻苯二胺、8U/mL辣根过氧化物酶、100μg/mL黄嘌呤氧化酶和PB缓冲液的体积比为15:19:1:1:20,36-38℃下避光孵育50-55min,形成DAP,所述黄嘌呤溶液为黄嘌呤经PB缓冲液稀释的黄嘌呤溶液,浓度范围是1μM-50μM;
(2)将N-Ti3C2 QDs加入按照步骤(1)合成的DAP中,混合形成N-Ti3C2 QDs@DAP探针;其中N-Ti3C2 QDs与DAP的体积比为4:56。
6.根据权利要求4或5所述的基于N-Ti3C2 QDs与邻苯二胺氧化物的复合纳米探针,其特征在于所述的PB缓冲液的浓度为10mM,pH=7.4。
7.一种权利要求4所述的基于N-Ti3C2 QDs与邻苯二胺氧化物的复合纳米探针用于H2O2的比率荧光检测方法,其特征在于检测方法包括如下步骤:
a)将浓度范围在2μM-50μM的多个不同浓度的H2O2溶液与邻苯二胺,辣根过氧化物酶在缓冲液中混合并孵育制得DAP,所述的孵育为在36-38℃下孵育50-55min;
b)将N-Ti3C2 QDs与步骤a)得到的DAP混合形成N-Ti3C2 QDs@DAP探针混合溶液;
c)测定步骤b)得到的N-Ti3C2 QDs@DAP探针混合溶液在369nm激发波长下,448nm和560nm处的荧光值;利用测得的I560与I448的值,获得H2O2浓度与荧光强度比率的线性关系;
d)将待测样品根据步骤c)所得到的线性关系与待测样品获得的荧光强度比率,得到待测样品中H2O2的浓度。
8.根据权利要求7所述的基于N-Ti3C2 QDs与邻苯二胺氧化物的复合纳米探针用于H2O2的比率荧光检测方法,其特征在于,步骤c)具体为:将N-Ti3C2 QDs@DAP探针混合溶液在激发波长为369nm,测定448nm和560nm处的荧光值;扫描速度为1200nm/min,光电倍增管电压为600V,激发狭缝和发射狭缝宽度分别为5nm,10nm,利用测得的I560与I448的比值,获得H2O2浓度与荧光强度比率的线性关系。
9.一种权利要求5所述的基于N-Ti3C2QDs与邻苯二胺氧化物的复合纳米探针用于黄嘌呤的比率荧光检测方法,其特征在于检测方法包括如下步骤:
a)将浓度范围在1μM-50μM的多个不同浓度的黄嘌呤溶液与邻苯二胺,黄嘌呤氧化酶,辣根过氧化物酶在缓冲液中混合并孵育制得DAP,所述的孵育为在36-38℃下孵育50-55min;
b)将N-Ti3C2 QDs与步骤a)得到的DAP混合形成N-Ti3C2 QDs@DAP探针混合溶液;
c)测定N-Ti3C2 QDs@DAP探针混合溶液在369nm激发波长下,448nm和560nm处的荧光值;利用测得的I560与I448的值,获得黄嘌呤浓度与荧光强度比率的线性关系;
d)将待测样品根据步骤c)所得到的线性关系与待测样品获得的荧光强度比率,得到待测样品中黄嘌呤的浓度。
10.根据权利要求9所述的基于N-Ti3C2 QDs与邻苯二胺氧化物的复合纳米探针用于黄嘌呤的比率荧光检测方法,其特征在于,步骤c)具体为:将样品在激发波长为369nm,测定448nm和560nm处的荧光值;扫描速度为1200nm/min,光电倍增管电压为600V,激发狭缝和发射狭缝宽度分别为5nm,10nm,利用测得的I560与I448的比值,获得黄嘌呤浓度与荧光强度比率的线性关系。
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