CN107523558B - 一种d-泛解酸内酯水解酶的包埋固化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种D‑泛解酸内酯水解酶包埋固化方法，其方法是将以尖镰孢霉菌发酵生产的D‑泛解酸内酯水解酶发酵液先用陶瓷膜微滤，所得菌丝体浓缩液升温至45～55℃，加入改性淀粉醚，搅拌至分散均匀，静置，之后依次加入硅藻土和羧甲基纤维素钠，搅拌均匀至无气泡后，降温至2～5℃，制粒，减压干燥得到D‑泛解酸内酯水解酶菌丝包埋固化物。本发明采用材料易得，质量可控，形成固化酶效果可靠，酶活力回收率达64%以上，方法简便，可多次回收利用，生产成本小，本发明废水量少，减轻环保处理强度,适合工业化生产。

Description

一种D-泛解酸内酯水解酶的包埋固化方法
技术领域
本发明属于生物提取领域，特别是涉及一种D-泛解酸内酯水解酶的包埋固化方法。
背景技术
泛酸钙，也称VB5，化学名称N-(2，4-二羟基-3，3-二甲基丁酰基)-β-氨基丙酸钙)。泛酸钙可以分为DL-型(混旋体)、D-型(右旋体)、L-型(左旋体)三种型式，其中，只有D-型(右旋体)具有生物活性。D-泛酸钙进入人体释放出钙元素和泛酸，而泛酸是辅酶A前体物质，进而转化为辅酶A而产生生理作用，参与碳水化合物、脂肪和蛋白质的代谢作用，是人体和动物维持正常生理机能不可缺少的微量物质。主要用于医药、食品及饲料添加剂。
根据D-泛酸钙具有手性特征，现行制备D-泛酸钙的技术，主要有两种。第一种是化学合成法，即将β-氨基丙酸钙和DL-泛解酸内酯直接进行合成反应，再根据泛酸钙混旋体溶解度比D-泛酸钙和L-泛酸钙大的特性，采用晶种诱导法结晶，将D-泛酸钙和L-泛酸钙分别析出，所得L-泛酸钙经碱催化消旋，反复拆分转化为D-泛酸钙。第二种是微生物酶法，即采用尖镰孢霉菌(fusarium oxysporum)等微生物生物发酵产生D-泛解酸内酯水解酶(存在菌丝体中)，将这种酶作催化剂加入到DL-泛解酸内酯液中，选择性地对不对称水解DL-泛解酸内酯中的D-泛解酸内酯进行拆分，将DL-泛解酸内酯拆分成D-泛解酸和L-泛解酸内酯，分离后的D-泛解酸，经内酯化处理，得到D-泛解酸内酯，再与β-氨基丙酸钙反应，合成D-泛酸钙。
上述微生物酶法以其所具有的生产成本低、毒性小、污染少等特点，成为现今VB5工业化生产的主要发展方向。
微生物酶法制备D-泛酸钙的生产过程中，对于DL-泛解酸内酯的拆分，如采用直接投加含D-泛解酸内酯水解酶的菌丝体进行酶水解反应，因菌丝体裂解产生杂质多，酶催化的反应生成质量差，物纯化困难，菌丝体酶不能重复使用；或者将生物发酵液中的D-泛解酸内酯水解酶提取纯化(萃取方式)，然后再与β-氨基丙酸钙反应，该方法在萃取过程易乳化，加入化学物质易造成酶活性降低，影响D-泛解酸内酯水解酶解反应收率和质量。
生物酶的固定化技术是用物理的或化学的方法使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在水不溶性凝胶或半透膜的微囊中。酶固定化后一般稳定性增加，易从反应系统中分离，且易于控制，能反复多次使用。便于运输和贮存，有利于自动化生产。因此，研究将尖镰孢霉菌(fusarum oxysporm)菌丝体直接固化，以保留酶活性的技术成为趋势。
现有技术中，已经公开的尖镰孢霉菌(fusarum oxysporm)发酵产生的含酶菌丝包埋固化技术有卡拉胶包埋法、海藻酸钠包埋法、明胶包埋法、戊二醛交联法等。上述技术中，戊二醛交联酶回收率好，但交联法含酶菌丝包埋固化未成型，上柱操作比较麻烦，含酶菌丝包埋固化制作过程中，还需加入白蛋白、二硫苏糖醇、戊二醛等物质，原材料价格高，生产成本大，不适宜大生产应用。包埋法中以卡拉胶包埋方法最好，其酶活力回收率将近60％，但卡拉胶固化孔隙分布不均匀，易造成细胞酶脱落或封闭严重，影响酶再利用及酶水解效果。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种酶在固化物中分散均匀，固化物孔隙率高、成型性好、酶效率高，且固化酶易回收再利用、生产成本低的D-泛解酸内酯水解酶的包埋固化方法。
为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种D-泛解酸内酯水解酶的包埋固化方法，其特征在于其工艺步骤为：将以尖镰孢霉菌发酵生产的D-泛解酸内酯水解酶发酵液先用陶瓷膜微滤，所得菌丝体浓缩液中加入改性淀粉醚，升温至45～55℃，搅拌至分散均匀，静置，之后依次加入硅藻土和羧甲基纤维素钠，搅拌均匀至无气泡后，降温至2～5℃，制粒，减压干燥得到D-泛解酸内酯水解酶菌丝包埋固化物。
所述陶瓷膜的滤径为0.1～0.3um，陶瓷膜过滤过程中，进料温度控制25～30℃左右，透析比1:1.2～1.5，浓缩倍数2.2～2.6倍。
所述改性淀粉醚的用量为菌丝体浓缩液的8～12％，以质量体积百分比计。
所述静置时间为15～20分钟。
所述硅藻土的用量为菌丝体浓缩液的2～5％，以质量体积百分比计。
所述羧甲基纤维素钠的用量为菌丝体浓缩液的1～2％，以质量体积百分比计。
所述减压干燥温度控制在50～55℃。
本发明的技术优势体现在：
1本发明提供了一种尖镰孢霉菌(fusarum oxysporm)菌丝体(含D-泛解酸内酯水解酶)经膜过滤、变性淀粉固化的包埋固化方法，该方法中固化所需原材料易得，质量可控。
2本发明将尖镰孢霉菌发酵生产的D-泛解酸内酯水解酶发酵液发酵液，在低温下经陶瓷膜微滤，尖镰孢霉菌(fusarum oxysporm)菌丝体破碎、浓缩，形成菌丝膜浆液(含D-泛解酸内酯水解酶)，进行菌丝包埋固化过程中，酶分散均匀，有利于DL-泛解酸内酯水解反应。
3利用本发明方法制备的D-泛解酸内酯水解酶菌丝包埋固化物酶活力回收率达到64％以上，比卡拉胶包埋固化酶水平高出6个百分点。
4本发明操作流程简捷，可操作性强。
5本发明废水量少，减轻环保处理强度。
6本发明制成的D-泛解酸内酯水解酶的包埋固化物孔隙率高、成型性好、机械强度好，易从反应系统中分离，能反复多次使用。
具体实施方法
下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。
下述实施例中的D-泛解酸内酯水解酶发酵液，是通过以下发酵工艺流程得到：
冷冻管→斜面孢子→种子液→发酵液
采用二级发酵模式生产D-泛解酸内酯水解酶，其生产菌种为尖镰孢霉菌(fusarumoxysporm)，发酵液菌丝体(折干)含量10～12％(w/v)，酶活力≥1.29U/g菌丝干燥体。
20％(w/v)DL-泛解酸内酯溶液：称取DL-泛解酸内酯32kg，用50mmolCaCL2溶液，配制20％(w/v)DL-泛解酸内酯溶液160L，作D-泛解酸内酯水解酶底物，备用。
游离细胞(菌丝体)：取D-泛解酸内酯水解酶发酵液100L，在离心机上进行分离，离心转速1200～1600rpm，得到湿菌丝体15.4kg(水份26.2％，酶活力1.31U/g菌丝干燥体)，用作固化酶水解对照物，备用。
评价生物的固定化酶技术指标，主要包括酶活力和酶活力回收率，其中，酶活力指酶催化一定化学反应的能力。酶活力单位U，表示在特定条件下，1分钟内转化1微摩尔底物所需的酶量为一个活力单位(U)。酶活力回收率指固定化酶与游离细胞(菌丝体)在相同反应条件下，酶解反应效果对比度。
Figure GDA0002681692970000041
以上公式中，固定化酶包埋与对照(菌丝体)相同量湿菌丝体，以对照(菌丝体)酶水解反应产物浓度为参比。
实施例1
1)D-泛解酸内酯水解酶的包埋固化方法
取D-泛解酸内酯水解酶发酵液100L(菌丝折干重11.4kg)，进陶瓷膜微滤膜(孔径0.1μm)过滤，进料温度25℃左右，透析比1:1.2，浓缩倍数2.2倍，得到菌丝体浓缩液100L(菌丝折干重10.6kg)。
将以上菌丝体浓缩液，加到反应器中，搅拌下，将该液升温至45℃，加入8％(W/V)改性淀粉醚8kg,搅拌至分散均匀，再静置15分钟，依次加入2％(W/V)硅藻土2kg，1％(W/V)羧甲基纤维素钠1kg，搅拌均匀至无气泡后，降温至2℃，得到D-泛解酸内酯水解酶菌丝包埋固化物(含折干菌丝10.6kg)。
将以上D-泛解酸内酯水解酶菌丝包埋固化物，通过摇摆颗粒机制粒(筛网12目)，在温度50℃下，减压干燥,得到D-泛解酸内酯水解酶菌丝包埋固化物成品22.7kg(含折干菌丝10.6kg)。
2)用游离细胞(菌丝体)作酶水解实验，将以上D-泛解酸内酯水解酶菌丝包埋固化物(相同菌丝折干重量)进行平行试验，分别检测D-泛解酸浓度，计算以上固化物酶回收率。
取20％(w/v)DL-泛解酸内酯溶液20L,加入带搅拌保温装置的反应器中，控制搅拌转速150rpm，温度30℃，按酶解浓度0.3U/g，加入1.24kg湿菌丝体(水份26.2％，折干菌丝体量0.915kg，酶活力1.31U/g菌丝干燥体)，在30℃反应5h，反应过程中，滴加2.0mol/LNaOH控制pH7.0～7.5，取样、离心，取上清液用HPLC测定D-泛解酸生成量。
与以上实验同步，取20％(w/v)DL-泛解酸内酯溶液20L,加入带搅拌保温装置的反应器中，控制搅拌转速150rpm，温度30℃，按折干菌丝体量0.915kg，加入以上D-泛解酸内酯水解酶菌丝包埋固化物成品1.14kg，在30℃反应5h，反应过程中，滴加2.0mol/LNaOH控制pH7.0～7.5，取样、离心，取上清液用HPLC测定D-泛解酸生成量。经计算固化物酶活力回收率65.6％。
实施例2
1)D-泛解酸内酯水解酶的包埋固化方法
取D-泛解酸内酯水解酶发酵液100L(菌丝折干重11.4kg，酶活力1.31U/g菌丝干燥体)，进陶瓷膜微滤膜(孔径0.1μm)过滤，进料温度27℃左右，透析比1:1.3，浓缩倍数2.4倍，得到菌丝体浓缩液96L(菌丝折干重10.4kg)。
将以上菌丝体浓缩液，加到反应器中，搅拌下，将该液升温至45℃，加入9％(W/V)改性淀粉醚8.6kg,搅拌至分散均匀，再间隔15分钟，依次加入3％(W/V)硅藻土2.9kg、1.2％(W/V)羧甲基纤维素钠1.2kg，搅拌均匀至无气泡后，降温至2℃，得到菌丝固化物(含折干菌丝10.4kg)。
将以上D-泛解酸内酯水解酶菌丝包埋固化物，通过摇摆颗粒机制粒(筛网12目)，在温度50℃下，减压干燥,得到D-泛解酸内酯水解酶菌丝包埋固化物成品24.1kg(含折干菌丝10.4kg)。
2)用游离细胞(菌丝体)作酶水解实验，将以上D-泛解酸内酯水解酶菌丝包埋固化物(相同菌丝折干重量)进行平行试验，检测D-泛解酸浓度，计算以上固化物酶回收率。
取20％(w/v)DL-泛解酸内酯溶液20L,加入带搅拌保温装置的反应器中，控制搅拌转速150rpm，温度30℃，按酶解浓度0.3U/g，加入1.24kg菌丝体(水份26.2％，折干菌丝体量0.915kg，酶活力1.31U/g菌丝干燥体)，在30℃反应5h，反应过程中，滴加2.0mol/LNaOH控制pH7.0～7.5，取样、离心，取上清液用HPLC测定D-泛解酸生成量。
与以上实验同步，取20％(w/v)DL-泛解酸内酯溶液20L,加入带搅拌保温装置的反应器中，控制搅拌转速150rpm，温度30℃，按折干菌丝体量0.915kg，加入以上D-泛解酸内酯水解酶菌丝包埋固化物成品1.24kg，在30℃反应5h，反应过程中，滴加2.0mol/LNaOH控制pH7.0～7.5，取样、离心，取上清液用HPLC测定D-泛解酸生成量。经计算固化物酶活力回收率64.9％。
实施例3
1)D-泛解酸内酯水解酶的包埋固化方法
取D-泛解酸内酯水解酶发酵液100L(菌丝折干重11.40kg，酶活力1.31U/g菌丝干燥体)，进陶瓷膜微滤膜(孔径0.1μm)过滤，进料温度28℃左右，透析比1:1.4，浓缩倍数2.3倍，得到菌丝体浓缩液104L(菌丝折干重10.40kg，酶活力1.37U/g菌丝干燥体)。
将以上菌丝体浓缩液，加到反应器中，搅拌下，将该液升温至45℃，加入10％(W/V)改性淀粉醚10.4kg,搅拌至分散均匀，再间隔15分钟，依次加入4％(W/V)硅藻土4.2kg、1.4％(W/V)羧甲基纤维素钠1.46kg，搅拌均匀至无气泡后，降温至2℃，得到菌丝固化物(含折干菌丝10.4kg)。
将以上D-泛解酸内酯水解酶菌丝包埋固化物，通过摇摆颗粒机制粒(筛网12目)，在温度50℃下，减压干燥,得到D-泛解酸内酯水解酶菌丝包埋固化物成品27.7kg(含折干菌丝10.4kg)。
2)用游离细胞(菌丝体)作酶水解实验，将以上D-泛解酸内酯水解酶菌丝包埋固化物(相同菌丝折干重量)进行平行试验，检测D-泛解酸浓度，计算以上固化物酶回收率。
取20％(w/v)DL-泛解酸内酯溶液20L,加入带搅拌保温装置的反应器中，控制搅拌转速150rpm，温度30℃，按酶解浓度0.3U/g，加入1.24kg菌丝体(水份26.2％，折干菌丝体量0.915kg，酶活力1.31U/g菌丝干燥体)，在30℃反应5h，反应过程中，滴加2.0mol/LNaOH控制pH7.0～7.5，取样、离心，取上清液用HPLC测定D-泛解酸生成量。
与以上实验同步，取20％(w/v)DL-泛解酸内酯溶液20L,加入带搅拌保温装置的反应器中，控制搅拌转速150rpm，温度30℃，按折干菌丝体量0.915kg，加入以上D-泛解酸内酯水解酶菌丝包埋固化物成品1.22kg，在30℃反应5h，反应过程中，滴加2.0mol/LNaOH控制pH7.0～7.5，取样、离心，取上清液用HPLC测定D-泛解酸生成量。经计算固化物酶活力回收率64.8％。
实施例4
1)D-泛解酸内酯水解酶的包埋固化方法
取D-泛解酸内酯水解酶发酵液100L(菌丝折干重11.4kg，酶活力1.31U/g菌丝干燥体)，进陶瓷膜微滤膜(孔径0.1μm)过滤，进料温度29℃左右，透析比1:1.4，浓缩倍数2.5倍，得到菌丝体浓缩液96L(菌丝折干重10.3kg，酶活力1.39U/g菌丝干燥体)。
将以上菌丝体浓缩液，加到反应器中，搅拌下，将该液升温至45℃，加入11％(W/V)改性淀粉醚10.6kg,搅拌至分散均匀，再间隔15分钟，依次加入5％(W/V)硅藻土5kg、1.6％(W/V)羧甲基纤维素钠1.5kg，搅拌均匀至无气泡后，降温至2℃，得到菌丝固化物(含折干菌丝10.3kg)。
将以上D-泛解酸内酯水解酶菌丝包埋固化物，通过摇摆颗粒机制粒(筛网12目)，在温度50℃下，减压干燥,得到D-泛解酸内酯水解酶菌丝包埋固化物成品28.8kg(含折干菌丝10.3kg)。
2)用游离细胞(菌丝体)作酶水解实验，将以上D-泛解酸内酯水解酶菌丝包埋固化物(相同菌丝折干重量)进行平行试验，检测D-泛解酸浓度，计算以上固化物酶回收率。
取20％(w/v)DL-泛解酸内酯溶液20L,加入带搅拌保温装置的反应器中，控制搅拌转速150rpm，温度30℃，按酶解浓度0.3U/g，加入1.24kg菌丝体(水份26.2％，折干菌丝体量0.915kg，酶活力1.31U/g菌丝干燥体)，在30℃反应5h，反应过程中，滴加2.0mol/LNaOH控制pH7.0～7.5，取样、离心，取上清液用HPLC测定D-泛解酸生成量。
与以上实验同步，取20％(w/v)DL-泛解酸内酯溶液20L,加入带搅拌保温装置的反应器中，控制搅拌转速150rpm，温度30℃，按折干菌丝体量0.915kg，加入以上D-泛解酸内酯水解酶菌丝包埋固化物成品1.28kg，在30℃反应5h，反应过程中，滴加2.0mol/LNaOH控制pH7.0～7.5，取样、离心，取上清液用HPLC测定D-泛解酸生成量。经计算固化物酶活力回收率64.1％。
实施例5
1)D-泛解酸内酯水解酶的包埋固化方法
取D-泛解酸内酯水解酶发酵液100L(菌丝折干重11.4kg，酶活力1.31U/g菌丝干燥体)，进陶瓷膜微滤膜(孔径0.1μm)过滤，进料温度30℃左右，透析比1:1.5，浓缩倍数2.6倍，得到菌丝体浓缩液96L(菌丝折干重10.7kg，酶活力1.24U/g菌丝干燥体)。
将以上菌丝体浓缩液，加到反应器中，搅拌下，将该液升温至45℃，加入12％(W/V)改性淀粉醚11.5kg,搅拌至分散均匀，再间隔15分钟，依次加入4％(W/V)硅藻土4kg、2.0％(W/V)羧甲基纤维素钠1.9kg，搅拌均匀至无气泡后，降温至2℃，得到菌丝固化物(含折干菌丝10.7kg)。
将以上D-泛解酸内酯水解酶菌丝包埋固化物，通过摇摆颗粒机制粒(筛网12目)，在温度50℃下，减压干燥,得到D-D-泛解酸内酯水解酶菌丝包埋固化物成品29.6kg(含折干菌丝10.7kg)。
2)用游离细胞(菌丝体)作酶水解实验，将以上D-泛解酸内酯水解酶菌丝包埋固化物(相同菌丝折干重量)进行平行试验，检测D-泛解酸浓度，计算以上固化物酶回收率。
取20％(w/v)DL-泛解酸内酯溶液20L,加入带搅拌保温装置的反应器中，控制搅拌转速150rpm，温度30℃，按酶解浓度0.3U/g，加入1.24kg菌丝体(水份26.2％，折干菌丝体量0.915kg，酶活力1.31U/g菌丝干燥体)，在30℃反应5h，反应过程中，滴加2.0mol/LNaOH控制pH7.0～7.5，取样、离心，取上清液用HPLC测定D-泛解酸生成量。
与以上实验同步，取20％(w/v)DL-泛解酸内酯溶液20L,加入带搅拌保温装置的反应器中，控制搅拌转速150rpm，温度30℃，按折干菌丝体量0.915kg，加入以上D-D-泛解酸内酯水解酶菌丝包埋固化物成品1.26kg，在30℃反应5h，反应过程中，滴加2.0mol/LNaOH控制pH7.0～7.5，取样、离心，取上清液用HPLC测定D-泛解酸生成量。经计算固化物酶活力回收率64.4％。
对比案例1(卡拉胶包埋法)
1)D-泛解酸内酯水解酶的包埋固化方法
取D-泛解酸内酯水解酶发酵液100L(菌丝折干重11.4kg，酶活力1.31U/g菌丝干燥体),离心得到湿菌丝体23.2kg，加入到预先用生理盐水配制的2％卡拉胶溶液中，配制菌丝折干重10.0％(W/V)菌丝液(含D-泛解酸内酯水解酶)，在温度45℃下，迅速搅拌，搅拌混匀后，倒入平板盘中，在室温下硬化，得到卡拉胶包埋菌丝体(折干菌丝含量10％)，切块，备用。
2)用游离细胞(菌丝体)作酶水解实验，将以上D-泛解酸内酯水解酶菌丝包埋固化物(相同菌丝折干重量)进行平行试验，检测D-泛解酸浓度，计算以上固化物酶回收率。
取20％(w/v)DL-泛解酸内酯溶液20L,加入带搅拌保温装置的反应器中，控制搅拌转速150rpm，温度30℃，按酶解浓度0.3U/g，加入1.24kg菌丝体(水份26.2％，折干菌丝体量0.915kg，酶活力1.31U/g菌丝干燥体)，在30℃反应5h，反应过程中，滴加2.0mol/LNaOH控制pH7.0～7.5，取样、离心，取上清液用HPLC测定D-泛解酸生成量。
与以上实验同步，取20％(w/v)DL-泛解酸内酯溶液20L,加入带搅拌保温装置的反应器中，控制搅拌转速150rpm，温度30℃，按折干菌丝体量0.915kg，加入以上卡拉胶包埋菌丝体块(含D-泛解酸内酯水解酶)9.15kg，在30℃反应5h，反应过程中，滴加2.0mol/LNaOH控制pH7.0～7.5，取样、离心，取上清液用HPLC测定D-泛解酸生成量。经计算固化物酶活力回收率58.6％。
对比案例2(海藻酸钠包埋法)
1)D-泛解酸内酯水解酶的包埋固化方法
取D-泛解酸内酯水解酶发酵液100L(菌丝折干重11.4kg，酶活力1.31U/g菌丝干燥体),离心得到湿菌丝体23.2kg，加入到预先用生理盐水配制的2.5％海藻酸钠溶液中，配制菌丝折干重10.0％(W/V)菌丝液(含D-泛解酸内酯水解酶)，在温度48℃下，注入0.1mol/LCaCl2中,同时慢速搅拌成形,然后用0.01mol/L CaCl2溶液浸泡于4℃下硬化，得到海藻酸钠包埋菌丝体(含D-泛解酸内酯水解酶)，切块备用。
2)用游离细胞(菌丝体)作酶水解实验，将以上D-泛解酸内酯水解酶菌丝包埋固化物(相同菌丝折干重量)进行平行试验，检测D-泛解酸浓度，计算以上固化物酶回收率。
取20％(w/v)DL-泛解酸内酯溶液20L,加入带搅拌保温装置的反应器中，控制搅拌转速150rpm，温度30℃，按酶解浓度0.3U/g，加入1.24kg菌丝体(水份26.2％，折干菌丝体量0.915kg，酶活力1.31U/g菌丝干燥体)，在30℃反应5h，反应过程中，滴加2.0mol/LNaOH控制pH7.0～7.5，取样、离心，取上清液用HPLC测定D-泛解酸生成量。
与以上实验同步，取20％(w/v)DL-泛解酸内酯溶液20L,加入带搅拌保温装置的反应器中，控制搅拌转速150rpm，温度30℃，按折干菌丝体量0.915kg，加入以上海藻酸钠包埋菌丝体块(含D-泛解酸内酯水解酶)9.15kg，在30℃反应5h，反应过程中，滴加2.0mol/LNaOH控制pH7.0～7.5，取样、离心，取上清液用HPLC测定D-泛解酸生成量。经计算固化物酶活力回收率50.4％。
对比案例3(明胶包埋法)
1)D-泛解酸内酯水解酶的包埋固化方法
取D-泛解酸内酯水解酶发酵液100L(菌丝折干重11.4kg，酶活力1.31U/g菌丝干燥体),离心得到湿菌丝体23.2kg，将其加入预先用生理盐水配制的7％明胶溶液中，配制菌丝折干重10.0％(W/V)菌丝液(含D-泛解酸内酯水解酶)，在温度48℃下，迅速搅拌，搅拌混匀后，加入1％戊二醛交联凝固,切块后浸泡于0.5％戊二醛中于4℃下硬化4h以上,滤出水洗后备用。
2)用游离细胞(菌丝体)作酶水解实验，将以上D-泛解酸内酯水解酶菌丝包埋固化物(相同菌丝折干重量)进行平行试验，检测D-泛解酸浓度，计算以上固化物酶回收率。
取20％(w/v)DL-泛解酸内酯溶液20L,加入带搅拌保温装置的反应器中，控制搅拌转速150rpm，温度30℃，按酶解浓度0.3U/g，加入1.24kg菌丝体(水份26.2％，折干菌丝体量0.915kg，酶活力1.31U/g菌丝干燥体)，在30℃反应5h，反应过程中，滴加2.0mol/LNaOH控制pH7.0～7.5，取样、离心，取上清液用HPLC测定D-泛解酸生成量。
与以上实验同步，取20％(w/v)DL-泛解酸内酯溶液20L,加入带搅拌保温装置的反应器中，控制搅拌转速150rpm，温度30℃，按折干菌丝体量0.915kg，加入以上明胶包埋菌丝体块(含D-泛解酸内酯水解酶)9.15kg，在30℃反应5h，反应过程中，滴加2.0mol/LNaOH控制pH7.0～7.5，取样、离心，取上清液用HPLC测定D-泛解酸生成量。经计算固化物酶活力回收率36.4％。

Claims (4)

1.一种D-泛解酸内酯水解酶的包埋固化方法，其特征在于其工艺步骤为：将以尖镰孢霉菌发酵生产的D-泛解酸内酯水解酶发酵液先用陶瓷膜微滤，控制进料温度25～30℃，所得菌丝体浓缩液中加入改性淀粉醚，升温至45～55℃，搅拌至分散均匀，静置，之后依次加入硅藻土和羧甲基纤维素钠，搅拌均匀至无气泡后，降温至2～5℃，制粒，减压干燥得到D-泛解酸内酯水解酶菌丝包埋固化物；
上述改性淀粉醚的用量为菌丝体浓缩液的8～12%，所述硅藻土的用量为菌丝体浓缩液的2～5%，所述羧甲基纤维素钠的用量为菌丝体浓缩液的1～2%，以质量体积百分比计。
2.按照权利要求1所述的D-泛解酸内酯水解酶的包埋固化方法，其特征在于所述陶瓷膜的滤径为0.1～0.3μm，陶瓷膜过滤过程中，透析比1:1.2～1.5，浓缩倍数2.2～2.6倍。
3.按照权利要求1所述的D-泛解酸内酯水解酶的包埋固化方法，其特征在于所述静置时间为15～20分钟。
4.按照权利要求1所述的D-泛解酸内酯水解酶的包埋固化方法，其特征在于所述减压干燥温度控制在50～55℃。
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