CN102827912A - 两酶一步法制备医药中间体d-7-aca的工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种两酶一步法制备医药中间体D-7-ACA的工艺，以头孢菌素C钠盐浓缩液为底物，采用固定化CPC酰化酶和固定化去乙酰基酯酶，将这两种酶载体按一定的比例混合使头孢菌素C提取液直接转化为D-7-ACA。本发明简化了工艺路线，提高了头孢菌素C发酵组分的利用率，缩短了生产周期，避免了三酶两步法中液氧的使用，提高了生产安全性，且整个过程均采用酶法生产工艺，具有条件温和、设备简单、无污染、收率高、副产物少、成本低等优点，有利于我国绿色制药工业的发展，是一条可持续的工艺路线。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种医药中间体的酶法制备新工艺，尤其涉及一种两酶一步法制备D-7-ACA的工艺。
背景技术
D-7-ACA（3-去乙酰基-7-氨基头孢烷酸）作为头孢菌素类抗生素的新型中间体，与7-ACA（7-氨基头孢烷酸）和7-ADCA（7-氨基-3-去乙酰氧基头孢烷酸）相比，3位上为羟基，反应活性较高，有利于合成新型的头孢类产品，在合成部分头孢品种时，简化了生产工艺路线，并具有修饰简单，容易纯化，产品质量好，同时降低生产成本等优点，D-7-ACA的研制将为我国发展第三代、第四代和即将来临的第五代头孢的合成提供了一种新的选择；D-7-ACA在头孢菌素类抗生素产品头孢呋辛、头孢西丁、头孢泊肟酯等产品中的应用，具有收率高，质量优等特点。
目前制备D-7-ACA的方法主要有化学法、化学生物酶法和生物酶法三种，一般均以头孢菌素C为原料，工艺路线长，并且都要经历头孢菌素C钠盐（或锌盐）、7-ACA、D-7-ACA三次结晶过程，由于结晶过程产品损失多，导致该方法收率低。此外，化学法采用的裂解，需要高温、高压和低冷，而反应物料中使用的有机溶剂如二氯甲烷、苯胺、氯硅烷等均为有毒有害的强污染物，还使用大量强酸强碱，使得D-7-ACA的生产要承担较重的能耗成本与治污成本。化学生物酶法中先采用酶法制备得到7-ACA，然后再用化学法裂解或酶法裂解得到D-7-ACA，由于酶法裂解7-ACA在结晶时面临结晶产品发粘、难以离心和干燥的问题，需要添加溶媒辅助结晶，并且需使用大量的分离设备，导致能耗和人工成本增加。
目前关于采用头孢菌素C酶法制备D-7-ACA的报道均是采用三酶两步酶法，即固定化D-氨基酸氧化酶、固定化GL-7-ACA酰化酶及固定化去乙酰基酯酶。现有的生物酶法采用两步酶裂解过程，操作繁琐，生产周期长，并且D-氨基酸氧化酶的氧化裂解过程需要大量的纯氧和动力消耗，增加了人工和运行成本。而有关采用两酶一步酶法制备D-7-ACA的文献未见报道。
发明内容
为了克服现有技术的不足，解决现有技术制备D-7-ACA中化学法超低温下碱水解导致的产品质量差，并且能耗高、污染重的问题；三酶两步酶法生产周期长，制备过程中使用液氧导致生产安全性不高，难于操作等问题，本发明提供了一种两酶一步法制备医药中间体D-7-ACA的工艺，以头孢菌素C钠盐浓缩液为底物，采用固定化CPC酰化酶和固定化去乙酰基酯酶，将这两种酶载体按一定的比例混合使头孢菌素C提取液直接转化为D-7-ACA。本发明降低了生产成本，提高了产品质量，为D-7-ACA的制备提供了更加可靠的技术支持。
本发明采用LKZ118酶载体树脂固定CPC酰化酶，代替现有技术中的D-氨基酸氧化酶和GL-7-ACA酰化酶，由于CPC酰化酶和去乙酰基酯酶的使用条件基本一样，所以将固定化CPC酰化酶与固定化去乙酰基酯酶按一定的比例混合使头孢菌素C浓缩液直接转化为D-7-ACA，其原理如下：
本发明采用头孢菌素C钠盐浓缩液为底物，直接采用固定化CPC酰化酶和固定化去乙酰基酯酶组合一步酶法催化制备D-7-ACA，将头孢菌素C钠盐浓缩液稀释至一定浓度，调节pH值后加入装有固定化CPC酰化酶和固定化去乙酰基酯酶的酶裂解罐中，在一定温度下由一定浓度的氨水通过酶裂解罐自动调节裂解液pH，控制裂解液的pH值一定时间至反应结束；将裂解液转移至结晶罐中，降温至一定温度，滴加一定浓度的盐酸调节pH值，控温养晶，过滤，甲醇洗涤，真空干燥即得成品。
本发明以头孢菌素C钠盐浓缩液为底物，采用固定化CPC酰化酶和固定化去乙酰基酯酶组合一步酶法催化制备D-7-ACA，具体步骤包括：
（1）将底物头孢菌素C钠盐浓缩液稀释至28000～32000u/mL，用质量分数为5%的氨水调节pH值至6.5～7.5，加入到装有固定化CPC酰化酶和固定化去乙酰基酯酶的酶裂解罐中，在18～25℃下，由质量分数为3%～8%的氨水通过酶裂解罐调节裂解液的pH值为8.0～8.5，反应结束，得到最终裂解液；
（2）将步骤（1）所得的最终裂解液转移至结晶罐中，降温至0～10℃，滴加质量分数为10%～20%的盐酸溶液调节pH值为3.0～5.0，控温养晶，过滤，甲醇洗涤，真空干燥即得产品。
其中，步骤（1）中所述头孢菌素C钠盐稀释液总单位与固定化CPC酰化酶酶活总单位的比值为4000～5000，优选为4200～4500；所述头孢菌素C钠盐稀释液总单位与固定化去乙酰基酯酶酶活总单位的比值为4000～5000，优选4200～4500，这样可以提高两种固化酶的利用率，以此降低生产成本。
步骤（1）中所述头孢菌素C钠盐浓缩液稀释至28000～32000u/mL，优选为29000～30000u/mL。若浓度过大，相同的转化率需要较长的反应时间，造成产物降解，降低了收率，并且会造成产物色级过高；而浓度过小，则裂解批次增加，运行成本升高。
为了防止PH值过低，造成酶衰减过快，步骤（1）中所述头孢菌素C钠盐浓缩液稀释后用质量分数为5%的氨水调节pH值至6.5～7.5，优选为7.0。
步骤（1）中所述裂解过程中的温度为18～25℃，优选20～22℃，温度过高，酶失去活性，温度过低，酶活性降低，起不到催化作用，此温度范围是固定化CPC酰化酶与固定化去乙酰基酯酶最适宜的温度，与最适宜的pH值范围相配合，可以使得这两种酶的活性达到最大，将头孢菌素C钠盐浓缩液尽可能多地转化为D-7-ACA。
步骤（1）中所述裂解过程中氨水的质量分数为3%～8%，优选为4.5%～5.5%，以中和裂解中产生的α-胺基己二酸和乙酸。
步骤（1）中所述裂解过程中pH值为8.0～8.5，优选为8.2～8.3，pH值过高或过低，酶都会失去活性，此pH值范围是固定化CPC酰化酶与固定化去乙酰基酯酶最适宜的pH值范围，与最适宜的温度范围相配合，可以使得这两种酶的活性达到最大，将头孢菌素C钠盐浓缩液尽可能多地转化为D-7-ACA。
步骤（2）中所述养晶过程中的温度为0～5℃，养晶时间为1～1.5小时。
步骤（2）中所述盐酸溶液的质量分数优选为14%～16%。
步骤（2）中所述结晶过程中pH值优选为3.5～4.0。
相对于现有技术中的三酶两步酶法，本发明的两酶一步酶法采用固定化CPC酰化酶，代替现有技术中的D-氨基酸氧化酶和GL-7-ACA酰化酶，直接采用固定化CPC酰化酶和固定化去乙酰基酯酶组合一步法制备医药中间体D-7-ACA，该工艺简化了工艺路线，提高了头孢菌素C发酵组分的利用率，缩短了生产周期，避免了三酶两步酶法中液氧的使用，提高了生产安全性，且整个过程均采用酶法生产工艺，具有条件温和、设备简单、无污染、收率高、副产物少、成本低等优点，有利于我国绿色制药工业的发展，是一条可持续的工艺路线。
附图说明
图1为实施例2制备的D-7-ACA的高效液相色谱图。
具体实施方式
本发明中所用的LKZ118载体树脂和CPC酰化酶由山东鲁抗立科药物化学有限公司购得，其余原料均为市售产品。
固定化CPC酰化酶活力测定：
（1）酶固定化：称取100g的LKZ118载体树脂200mL浓度为1moL/L pH为8.0的磷酸缓冲溶液，加入30000u的CPC酰化酶，在25℃的环境中震荡48小时，清洗，抽干，得样品备用；
（2）酶活力测定：精确称取固定化CPC酰化酶（W,精确至0.0001g）置于反应器中，加入过量预热至25℃的头孢菌素C钠盐溶液，开启搅拌，控制反应温度25℃，头孢菌素C钠盐在固定化CPC酰化酶作用下，水解反应生成D-CPC或D-7-ACA和α-胺基己二酸，反应中用NaOH滴定液（C）调节pH值为8.30，控制反应pH值为8.30，记录10分钟（T）消耗的NaOH溶液的体积（V），根据NaOH的消耗量计算固定化CPC酰化酶的活力；
（3）酶活力计算：
式中：V—所用NaOH溶液的体积（mL）；
C—所用NaOH溶液的摩尔浓度（mol/L）；
W—固定化CPC酰化酶的质量（g）；
T—酶活力测定所用的时间（min）。
固定化去乙酰基酯酶活力测定：
（1）酶活力测定：精确称取市售产品固定化去乙酰基酯酶（W,精确至0.0001g）加入过量预热至25℃的头孢菌素C钠盐溶液，开启搅拌，控制反应温度25℃，头孢菌素C钠盐在固定化去乙酰基酯酶作用下，水解反应生成D-CPC或D-7-ACA和乙酸，用NaOH滴定液（C）调pH值为8.00，控制反应pH值为8.00，记录10分钟（T）消耗的NaOH溶液的体积（V），根据NaOH的消耗量计算固定化去乙酰基酯酶的活力；
（2）酶活力计算：
式中：V—所用NaOH溶液的体积（mL）；
C—所用NaOH溶液的摩尔浓度（mol/L）；
W—固定化去乙酰基酯酶的质量（g）；
T—酶活力测定所用的时间（min）。
本发明所用的固定化CPC酰化酶和固定化去乙酰基酯酶的酶活均由上述方法测得。
实施例1
两酶一步法制备医药中间体D-7-ACA的工艺，具体步骤包括：
（1）据高效液相色谱法测定的头孢菌素C钠盐浓缩液效价，将头孢菌素C钠盐浓缩液稀释至28000u/mL，用质量分数为5%的氨水调节pH值至6.5后，将500mL上述稀释液加入到装有40.23g固定化CPC酰化酶（酶活为87u/g）和8.75g固定化去乙酰基酯酶（酶活为400u/g）的酶裂解罐中，在20℃下由质量分数为5.5%的氨水通过酶裂解罐调节裂解液pH值为8.2，反应结束，得到最终裂解液；
（2）将步骤（1）所得的最终裂解液转移至结晶罐中，降温至3℃，滴加质量分数为12%的盐酸溶液调节pH值至3.5，0℃下养晶1小时，过滤，甲醇洗涤，真空干燥即得成品。结晶收率为90.10%，D-7-ACA总收率为41.10%，纯度为98.65%，质量含量99.37%。
实施例2
两酶一步法制备医药中间体D-7-ACA的工艺，具体步骤包括：
（1）据高效液相色谱法测定的头孢菌素C钠盐浓缩液效价，将头孢菌素C钠盐浓缩液稀释至30000u/mL，用质量分数为5%的氨水调节pH值至7.0后，将500mL上述稀释液加入装有41.05g固定化CPC酰化酶（酶活为87 u/g）和8.93g固定化去乙酰基酯酶（酶活为400 u/g）的酶裂解罐中，在18℃下由质量分数为8%的氨水通过酶裂解罐调节裂解液pH为8.0，反应结束，得到最终裂解液；
（2）将步骤（1）所得的最终裂解液转移至结晶罐中，降温至0℃，滴加质量分数为20%的盐酸溶液调节pH值至3.0，5℃下养晶1.5小时，过滤，甲醇洗涤，真空干燥即得成品。结晶收率为91.06%，D-7-ACA总收率为41.51%，纯度为99.13%，质量含量99.82%。
实施例3
两酶一步法制备医药中间体D-7-ACA的工艺，具体步骤包括：
（1）据高效液相色谱法测定的头孢菌素C钠盐浓缩液效价，将头孢菌素C钠盐浓缩液稀释至32000u/mL，用质量分数为5%的氨水调节pH值至7.5后，将500mL上述稀释液加入装有40.87g固定化CPC酰化酶（酶活为87 u/g）和8.89g固定化去乙酰基酯酶（酶活为400 u/g）的酶裂解罐中，在25℃下由质量分数为4.5%的氨水通过酶裂解罐调节裂解液pH为8.5，反应结束，得到最终裂解液；
（2）将步骤（1）所得的最终裂解液转移至结晶罐中，降温至10℃，滴加质量分数为10%的盐酸溶液调节pH值至5.0，3℃下养晶1.2小时，过滤，甲醇洗涤，真空干燥即得成品。结晶收率为92.01%，D-7-ACA总收率为42.41%，纯度为99.25%，质量含量99.72%。
实施例4
两酶一步法制备医药中间体D-7-ACA的工艺，具体步骤包括：
（1）据高效液相色谱法测定的头孢菌素C钠盐浓缩液效价，将头孢菌素C钠盐浓缩液稀释至29000u/mL，用质量分数为5%的氨水调节pH值至7.2后，将500mL上述稀释液加入装有38.5g固定化CPC酰化酶（酶活为87 u/g）和8.38g固定化去乙酰基酯酶（酶活为400 u/g）的酶裂解罐中，在22℃下由质量分数为3%的氨水通过酶裂解罐调节裂解液pH为8.3，反应结束，得到最终裂解液；
（2）将步骤（1）所得的最终裂解液转移至结晶罐中，降温至5℃，滴加质量分数为16%的盐酸溶液调节pH值至5.0，2℃下养晶1.3小时，过滤，甲醇洗涤，真空干燥即得成品。结晶收率为91.03%，D-7-ACA总收率为42.01%，纯度为98.90%，质量含量99.53%。
实施例5
两酶一步法制备医药中间体D-7-ACA的工艺，具体步骤包括：
（1）据高效液相色谱法测定的头孢菌素C钠盐浓缩液效价，将头孢菌素C钠盐浓缩液稀释至31000u/mL，用质量分数为5%的氨水调节pH值至6.8后，将500mL上述稀释液加入装有35.63g固定化CPC酰化酶（酶活为87 u/g）和7.75g固定化去乙酰基酯酶（酶活为400 u/g）的酶裂解罐中，在23℃下由质量分数为7%的氨水通过酶裂解罐调节裂解液pH为8.1，反应结束，得到最终裂解液；
（2）将步骤（1）所得的最终裂解液转移至结晶罐中，降温至7℃，滴加质量分数为14%的盐酸溶液调节pH值至4.0，4℃下养晶1.2小时，过滤，甲醇洗涤，真空干燥即得成品。结晶收率为91.73%，D-7-ACA总收率为42.31%，纯度为99.09%，质量含量98.97%。
从实施例1-5可以看出，利用两酶一步法制备D-7-ACA，简化了工艺路线，提高了头孢菌素C发酵组分的利用率，缩短了生产周期，避免了三酶两步酶法中液氧的使用，提高了生产安全性；整个过程均采用酶法生产工艺，具有条件温和、设备简单、无污染、副产物少、成本低等优点，且所得产品收率高、纯度高。
根据本发明所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，上述优选具体实施方式仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
Claims (10)
1.两酶一步法制备医药中间体D-7-ACA的工艺，其特征在于：以头孢菌素C钠盐浓缩液为底物，采用固定化CPC酰化酶和固定化去乙酰基酯酶组合一步酶法催化制备D-7-ACA，具体步骤包括：
（1）将底物头孢菌素C钠盐浓缩液稀释至28000～32000u/mL，用质量分数为5%的氨水调节pH值至6.5～7.5，加入到装有固定化CPC酰化酶和固定化去乙酰基酯酶的酶裂解罐中，在18～25℃下，由质量分数为3%～8%的氨水通过酶裂解罐调节裂解液的pH值为8.0～8.5，反应结束，得到最终裂解液；
所述头孢菌素C钠盐稀释液总单位与固定化CPC酰化酶酶活总单位的比值为4000～5000，所述头孢菌素C钠盐稀释液总单位与固定化去乙酰基酯酶酶活总单位的比值为4000～5000；
（2）将步骤（1）所得的最终裂解液转移至结晶罐中，降温至0～10℃，滴加质量分数为10%～20%的盐酸溶液调节pH值为3.0～5.0，控温养晶，过滤，甲醇洗涤，真空干燥即得产品。
2.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于：步骤（1）中所述头孢菌素C钠盐稀释液总单位与固定化CPC酰化酶酶活总单位的比值为4200～4500，所述头孢菌素C钠盐稀释液总单位与固定化去乙酰基酯酶酶活总单位的比值为4200～4500。
3.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于：步骤（1）中所述头孢菌素C钠盐浓缩液稀释的浓度为29000～30000u/mL。
4.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于：步骤（1）中所述头孢菌素C钠盐浓缩液稀释后的pH值为7.0。
5.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于：步骤（1）中所述裂解过程中的温度为20～22℃。
6.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于：步骤（1）中所述裂解过程中的氨水的质量分数为4.5%～5.5%。
7.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于：步骤（1）中所述裂解过程中pH值为8.2～8.3。
8. 根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于：步骤（2）中所述养晶过程中的温度为0～5℃，养晶时间为1-1.5小时。
9.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于：步骤（2）中所述盐酸溶液的质量分数为14%～16%。
10.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于：步骤（2）中所述结晶过程中pH值为3.5～4.0。
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