CN110964770A - 连续制备3-去乙酰-7-氨基头孢烷酸的方法 - Google Patents

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刘子嘉
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Abstract

本发明涉及连续制备3‑去乙酰‑7‑氨基头孢烷酸(D‑7‑ACA)的方法，尤其涉及利用去乙酰酯酶催化7‑氨基头孢烷酸(7‑ACA)制备D‑7‑ACA的方法。该方法包括使包含7‑氨基头孢烷酸以及碳酸氢铵和/或碳酸铵的水溶液连续通过填充有固定化去乙酰酯酶的反应器。本发明还涉及碳酸氢铵和/或碳酸铵在用于维持去乙酰酯酶催化7‑氨基头孢烷酸制备3‑去乙酰‑7‑氨基头孢烷酸过程中pH的稳定性的用途。

Description

连续制备3-去乙酰-7-氨基头孢烷酸的方法
技术领域
本发明涉及连续制备3-去乙酰-7-氨基头孢烷酸(D-7-ACA)的方法，尤其涉及利用去乙酰酯酶催化7-氨基头孢烷酸(7-ACA)制备D-7-ACA的方法。
背景技术
3-去乙酰-7-氨基头孢烷酸(3-deacetyl-7-aminocephalosporanic acid)简称D-7-ACA，分子式为C8H10N2O3S，是一种头孢菌素类抗生素的新型中间体，D-7-ACA在头孢菌素类抗生素产品头孢呋辛、头孢西丁、头孢帕肟酯等产品的应用中，具有产品收率高，质量好，生产成本低等优点。目前，D-7-ACA的生产已受到了广泛关注。
D-7-ACA的生产方法主要是采用去乙酰酯酶对7-ACA进行催化，脱除3-位的乙酰基得到D-7-ACA和乙酸。目前，在工业上应用的酶催化中普遍采用纯水体系，由于催化制备过程中产生酸性物质乙酸，为了维持催化反应的顺利进行，需要不断加碱将pH调节到适宜范围。在从7-ACA催化制备D-7-ACA的过程中，产生乙酸的量比较大，加入碱的速度难以迅速调节体系的pH值，这样很容易使得酶的稳定性和催化效率下降。此外，为了使催化体积不因碱的加入而增加太多，经常采用较高浓度的碱溶液或强碱溶液控制反应体系的pH值，但这些较高浓度的碱溶液或者强碱溶液的加入容易因混合不匀导致底物或产物或催化剂的破坏。
也有采用磷酸盐缓冲液体系，但是通常浓度的缓冲液的缓冲容量往往不足以维持反应体系的pH值，而且加入缓冲液会影响产物的后续分离(缓冲液中的盐成分随D-7-ACA结晶，使得产物D-7-ACA的纯度下降)，导致产品质量下降和成本增加。
在通常使用的搅拌釜式的批次催化反应中，由于在搅拌釜中进行催化需要进行单独加料、放料，特别是固定化酶(粒径一般为100～300μm)需经过30μm左右的微孔筛板过滤截留，反应料液的排放时间较长，生产的辅助时间较长，影响生产效率。另外，由于搅拌过程的剪切和碰撞，容易导致固定化酶颗粒的破损。相比之下，连续催化的方法能够避免上述的问题。
因此，在工业上需要维持去乙酰酯酶催化7-ACA制备D-7-ACA的过程中的pH值并且能够实现连续生产的方法，从而简化操作并降低成本。
发明内容
为此，本发明提供了一种连续制备D-7-ACA的方法，通过本发明的方法，能够稳定反应体系的pH值并且能够实现连续催化制备D-7-ACA。
本发明人在研究中发现，通过在催化反应体系中加入碳酸氢铵和/或碳酸铵能够显著稳定催化体系的pH值，在此基础上，使得能够实现使用固定化酶进行连续生产。
与经常用到的缓冲液(例如磷酸盐、乙酸盐、硼酸盐、Tris-HCl和碳酸钠等)不同，碳酸氢铵和/或碳酸铵本身非常不稳定，通常并不用它配制缓冲液。但本发明人通过研究出人意料地发现在乙酰酯酶催化7-ACA制备D-7-ACA的催化体系中加入碳酸氢铵和/或碳酸铵能够显著稳定反应体系中的pH值。
另外，碳酸氢铵和/或碳酸铵很容易在催化产物的后续分离中除去(D-7-ACA通常采用盐酸调节pH至酸性来进行沉淀，在此过程中碳酸氢氨和/或碳酸铵会生成二氧化碳去除)，不会影响D-7-ACA的产品质量。就生产成本而言，碳酸氢铵和碳酸铵价格十分低廉。
具体实施方式
使用去乙酰酯酶以7-ACA为底物催化制备D-7-ACA的工艺是已知的，催化产物中包含乙酸，反应体系pH下降。反应过程简单示意如下：
Figure BDA0001817176540000031
作为用于本发明的催化剂去乙酰酯酶，本领域技术人员知道，能催化7-ACA生成D-7-ACA的去乙酰酯酶都可以用于本发明的方法中。作为详细介绍本发明的例子，列举了来自河北九派制药有限公司的固定化去乙酰酯酶。
在本发明中，还出人意料地发现，通过在反应体系中使用碳酸氢铵和/或碳酸铵，在连续制备过程中不需要额外加入酸和/或碱来调节催化体系的pH值，就可以使得催化体系的pH保持在适宜范围内，从而确保了制备的连续进行。
在本发明的上下文中，术语“反应体系”或“催化体系”具有本领域通常的含义，包括在催化进行过程中参与反应的底物、酶以及所得到的产物和副产物，还包括溶剂以及其中加入的各种助剂；实践中，可以理解为进行催化反应的容器中除了反应器设备之外的内容物。
在本发明的上下文中，术语“约”表示±10％(优选±5％)的误差范围均被涵盖在所述数值的范围内，例如，9-11以内(优选9.5-10.5以内)的数值都被涵盖在“约10”的表述的范围内。
优选地，本发明的连续催化反应包括：将7-ACA以及碳酸氢铵和/或碳酸铵溶于水溶液中，用稀盐酸或氨水调节溶液pH7～9，例如8-9，例如8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9，特别是8.5。优选地，碳酸氢铵和/或碳酸铵在水溶液中的浓度为10mmol/L～2mol/L，例如10mmol/L～500mmol/L，50mmol/L～400mmol/L，80mmol/L～300mmol/L，100mmol/L～300mmol/L，100mmol/L～280mmol/L。在本发明中，本领域技术人员应当理解，7-ACA以及碳酸氢铵和/或碳酸铵溶于水溶液中的顺序没有特别的限制，可以先将碳酸氢铵和/或碳酸铵溶于水溶液，然后再加入7-ACA；也可以先将7-ACA溶于水溶液，然后再加入碳酸氢铵和/或碳酸铵；还可以将7-ACA以及碳酸氢铵和/或碳酸铵分别溶于水溶液，然后将二者的水溶液混合在一起，同时，保持pH在上述范围内。pH值保持在上述范围内，可以通过将7-ACA以及碳酸氢铵和/或碳酸铵溶于水溶液之后进行调节，也可以在混合过程中调节，还可以通过估算调节二者混合前的pH，使得二者混合后的pH处于上述范围内。
优选地，本发明的连续催化反应包括：将包含7-ACA以及碳酸氢铵和/或碳酸铵的水溶液连续通过填充有固定化去乙酰酯酶的反应器例如填充床反应器，催化体系温度保持在10℃-37℃，例如，10℃，12℃，15℃，20℃，25℃，30℃。温度越高酶活越高，但酶的催化稳定性降低，且底物7-ACA容易降解。催化过程中无需加入碱液来调节反应器内的pH值，通过定时从反应器出口取样，进行HPLC检测反应剩余的7-ACA，控制流速使得底物转化率达到所需的水平，例如98％的转化率，95％的转化率。上述连续通过可以通过本领域现有技术来实现，例如通过泵(例如计量泵)来泵送。
将经过填充床反应器催化后得到反应清液，通过常规方法结晶获得D-7-ACA晶体；例如，缓慢加入20％硫酸调节其pH值至pH4，在5℃搅拌3h，析出D-7-ACA晶体，过滤后用丙酮洗涤晶体，干燥得到D-7-ACA产品。
实施例
以下通过实施例对本发明的方法进行详细的阐述。
测定或计算方法：
7-ACA的转化率的计算方法为：
7-ACA转化率＝(反应零时刻7-ACA浓度-反应结束时7-ACA浓度)/反应零时刻7-ACA浓度
7-ACA浓度或D-7-ACA浓度的检测方法：
反应过程中，取20μL反应液加入180μL的终止液(50mmol/L的NaOH溶液与20％的冰醋酸溶液按1:2的体积比混合而成)，再取20μL的上述液体加至180μL的超纯水中，即将反应液稀释了100倍，取40μL进行液相色谱上样，根据7-ACA和D-7-ACA出峰的积分峰面积，根据标准曲线得出7-ACA和D-7-ACA的浓度。
液相色谱分析条件为：色谱柱为Phenomenex Luna C-18(4.6×150mm)，以15％甲醇-7.5％乙腈-1％乙酸为流动相，流速为0.8mL/min、检测波长为254nm。
实施例1：填充床反应器的催化1
在Ф8×110mm的填充柱反应器中装填入3.6g固定化去乙酰酯酶(来自河北九派制药有限公司)，用输液泵通过硅胶管输送7-ACA溶液(7-ACA溶解于300mM的碳酸氢铵水溶液中，7-ACA浓度25mg/ml，用氨水调节溶液pH8.5)，流速0.1ml/min，反应温度25℃。反应器出口收集催化反应液，并定时取样进行分析。出口pH值为约7.1。用HPLC检测反应剩余的7-ACA，初始反应时，进入填充床反应器的7-ACA溶液的转化率超过98％。连续运行15天后底物7-ACA的转化率降为94％。此时固定化酶的D-7-ACA产量为20.4g/g固定化酶。
实施例2：填充床反应器的催化2
在Ф5×100mm的填充柱反应器中装填入0.9g固定化去乙酰酯酶(来自河北九派制药有限公司)，用输液泵通过硅胶管输送7-ACA溶液(7-ACA溶解于200mM的碳酸氢铵水溶液中，7-ACA浓度为25mg/ml，用氨水调节溶液pH8.5)，流速0.05ml/min，反应温度25℃。反应器出口收集催化反应液，并定时取样进行分析。出口pH值为约6.6。用HPLC检测反应剩余的7-ACA，初始反应时，进入填充床反应器的头孢菌素C溶液的转化率超过99％。连续运行15天后底物7-ACA的转化率降为93％。此时固定化酶的D-7-ACA产量为22.6g/g固定化酶。
实施例3：搅拌釜与填充床反应器的联合催化
在带夹套控温的50ml搅拌釜反应器中加入30ml溶解于去离子水的37.5mg/ml底物7-ACA(用氨水调节pH值为8.3)，加入1.5g固定化乙酰酯酶(来自河北九派制药有限公司)，控制催化温度为20℃，用2M氨水自动控制催化pH8.3。用输液泵以0.3ml/min的流速对搅拌釜反应器连续进料(7-ACA浓度为37.5mg/ml，氨水调节pH值为8.3)。将2倍体积的转化率为90％左右的釜反应液与1倍体积的0.3M碳酸氢铵水溶液混合后，在填充柱反应器(Ф8×110mm的柱式反应器中装填入2.5g来自河北九派制药有限公司的工业用固定化乙酰酯酶)中25℃和0.3ml/min流速下接着进行催化，反应器出口收集催化反应液，并定时取样进行HPLC分析，转化率达到99％以上，反应器出口处pH值约7.9。连续运行10天后，搅拌釜中底物7-ACA的转化率稳定在90％左右，填充柱反应器催化后的底物7-ACA的转化率超过98％，此时固定化酶的D-7-ACA产量为31.2g/g固定化酶。
实施例4：催化产物的分离与纯化
在实施例3中所获得的催化反应液100ml，冷却至5℃，向反应液底部中缓慢加入20％的硫酸调节其pH为4，于5℃下搅拌3h，过滤，用丙酮淋洗。45℃真空干燥得到产物粉末，通过液相色谱测其纯度为97.1％，纯化过程的收率为85.5％。
对比例1
在Ф8×110mm的填充柱反应器中装填入3.6g固定化去乙酰酯酶(来自河北九派制药有限公司)，用输液泵通过硅胶管输送7-ACA溶液(7-ACA溶解于去离子水水中，用氨水调节pH8.3，7-ACA浓度为25mg/ml)，流速0.1ml/min，反应温度25℃。通过定时从反应器出口取样，达到稳定催化阶段时出口处的pH为约5.5。进行HPLC检测反应剩余的7-ACA，发现7-ACA的转化率仅为76％，即无法用水配制的底物进行填充床的连续催化。
对比例2
在Ф8×110mm的填充柱反应器中装填入3.6g固定化去乙酰酯酶(来自河北九派制药有限公司)，用输液泵通过硅胶管输送7-ACA溶液(7-ACA溶解于200mM的pH8.5磷酸钠溶液中，用氨水调节pH8.3，7-ACA浓度为25mg/ml)，流速0.1ml/min，反应温度25℃。通过定时从反应器出口取样，达到稳定催化阶段时出口处的pH为约6.1。进行HPLC检测反应剩余的7-ACA，发现7-ACA的转化率仅为86％，即用磷酸钠缓冲液配制的底物进行填充床的连续催化时，无法获得满意的底物转化率。
最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换；而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，均应涵盖在本发明的范围内。

Claims (6)

1.连续制备3-去乙酰-7-氨基头孢烷酸的方法，其特征在于，使包含7-氨基头孢烷酸以及碳酸氢铵和/或碳酸铵的水溶液连续通过填充有固定化去乙酰酯酶的反应器。
2.如权利要求1所述的方法，其中水溶液的pH为7-9，例如pH8-9，特别是pH8.5。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中反应器内的催化体系温度在10℃-37℃的范围内，例如10-25℃范围内。
4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其中，碳酸氢铵和/或碳酸铵在水溶液中的浓度为10mmol/L～2mol/L，例如10mmol/L～500mmol/L。
5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其中，所述反应器是填充床反应器。
6.碳酸氢铵和/或碳酸铵在用于维持去乙酰酯酶催化7-氨基头孢烷酸制备3-去乙酰-7-氨基头孢烷酸过程中pH的稳定性的用途。
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