KR19990076768A - 글루콘산의 제조 방법 및 이에 의해 제조된 글루콘산 - Google Patents

글루콘산의 제조 방법 및 이에 의해 제조된 글루콘산 Download PDF

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Abstract

본 발명은 25 % (w/w) ds. 이상의 글루코오스 농도로 글루코오스를 글루콘산으로 완전히 전환케하는 글루코오스 옥시다아제 및 이와 동일물 또는 상이한 공급물의 카탈라아제를 포함하는 효소 시스템에 관한 것이다. 일반적으로 발효 공정과 관련된 불순물들이 본질적으로 배제되어 얻어진 상기 글루콘산은 이후, 분무 과립화됨으로써 저-제진 (low-dust)건조 생성물로 생성된다.

Description

글루콘산의 제조 방법 및 이에 의해 제조된 글루콘산
글루코오스의 산화 생성물, 글루콘산은 낙농 산업에 있어 금속 청정 조작; 알카리 용기 세정 조작; 야금 산업에 있어서 알카리 녹제거 조작; 및 섬유 산업에 있어서 철 침전 예방 조작과 같은 다양한 응용에 광범위하게 사용되어 왔다. 더우기, 글루콘산의 소듐염은 시멘트 혼합물 내의 첨가제로서 사용된다.
글루코오스로 부터의 글루콘산 제조는, 미생물 발효, 전기화학적 시스템, 화학적 시스템 및 효소 시스템 (이 중, 효소 시스템은 이들의 공급 미생물로 부터 별개로 사용됨)과 같은 광범위하게 분류될 수 있는 방법들을 사용하여 달성될 수 있다. 미생물 발효는 상기 방법들 중 가장 널리 사용되어 왔음에도 불구하고 이는, 발효 미생물을 사용하기 위해 요구되는 공정 조건들과 관련된 것들을 포함하는 많은 결점을 가지고 있어, 이것이 이를 산업상 이용하는 데 제한을 주어 왔다.
글루콘산으로의 글루코오스 효소 전환은 글루코오스-함유 물질을 글루코오스 옥시다아제 및 카탈라아제 활성을 갖는 효소 제조물과 반응시키는 것을 포함한다. 상기 반응은 과산화수소와 같은 유리 산소 공급물의 존재하에 수행될 수 있다. 일반적으로, 글루코오스를 함유하는 물질은 수성 용액의 형태로 존재한다.
글루코오스 옥시다아제가 효소 전환 동안 가장 효과적인 수준, 25에서 작용하게 하기 위해서는 이 반응 매질의 pH가 의도하는 반응을 촉진시킬 정도로 조절되어야 한다. 글루코오스의 글루코오스 옥시다아제 전환에 있어, (글루콘)산은 계속해서 생성된다. 따라서, 효소 전환을 거치는 동안 반응 매질의 pH를 계속해서 조절해 주는 것이 필요하다. 일반적으로, pH가 약 4.2 - 약 7 (바람직하게는 약 5 - 약 6) 로 유지될 경우, 상기 전환은 만족스럽게 진행된다. pH를 조절하는 통상적인 방법으로는 소듐 하이드록사이드와 같은 알카리를 연속적으로 부가해주는 것을 포함한다. 알카리는 글루콘산을 상응하는 글루코네이트, 예를 들면 소듐 글루코네이트로 중화시킨다. 글루코오스 옥시다아제/카탈라아제 효소 시스템을 사용하여 글루코오스로 부터 글루콘산을 제조하기 위한 효소 방법의 예들은, 예를 들어, 미국 특허 제 2,651,592 호 및 루마니아 특허 제 92,739 호에 기재되어 있다.
상기 효소 방법은 특정 목적을 위해 유용하게 사용되는 반면에 몇몇의 결점을 가지고 있다.
효소 방법과 관련된 제 1의 결점은 상기 반응 방법이 일반적으로 글루콘산과 함께 생물자원 (biomass)을 포함하는 기타 불순물들을 모두 함유하는 조 반응 액체배지 (broth)를 초래한다는 것이다. 차후, 상기 반응 액체배지는, 고순도의 최종 생성물로 제공되도록, 생물자원 분리 (여과), 탄소처리 (탈색), 증발 (농축) 및 결정화 (정제)를 포함한 다-단계 공정에 의해 정제되어야 한다.
제 2의 결점은 재순환, 추가로 정제 및/또는 처리해야 하는 반응 액체배지 내 잔여 모액이 존재하여, 이로인한 상기 효소 전환 공정의 문제점 및 비용을 가중시킨다는 것이다.
효소 공정과 관련된 제 3의 결점은 상기 공정이 저(低) 전환 효율을 가진다는 것이다. 상기 특징은, 상기로 인해 생성된 글루콘산 용액 내 오염물로서 전환되지 않은 잔여 글루코오스가 남는 글루콘산으로의 글루코오스 불완전 전환이 일어난다는 것이다. 상기 최종 생성물로 부터 이러한 전환되지 않은 글루코오스를 감소 또는 제거하기 위해서는 고 비용의 다운스트림 (downstream), 분리, 회수 및 정제 단계를 사용하여야 한다.
불완전 전환과 연관된 문제점들을 완화하기 위해, 출발 물질의 글루코오스 농도를 30% (w/w) 용해된 고체 (ds.) 이하로 한정하는데 의지해 왔다. 불행히도, 출발 물질 내 상기의 낮은 글루코오스 농도는, 상당히 상기 방법의 효율성을 저하시켜 이들의 산업상 이용가능성에 부정적 영향을 끼치므로 만족스럽지 못하다.
이와는 다르게, 이들의 종료에 앞서 상기 방법을 중단하는 것에 의지해 왔었다. 예를 들면, 전술된 미국 특허의 공개된 방법에서, 상기 반응은 단지 50%가 글루코오스에서 글루콘산으로 전환된 후 중지되었다. 그럼에도 불구하고, 상기 반응 혼합물은 상기 잔류 전환되지 않은 글루코오스로 부터 상기 글루콘산을 분리 및 회수하기 위해 여전히 전기투석을 해야할 필요가 있으며, 상기 방법에 의해 생성된 글루콘산의 정제는 쉽지 않고 비용이 많이 들 뿐만 아니라, 특히 상기 글루코오스가 여전히 존재하게 된다.
효소 방법에 관련된 다른 결점은 과산화수소 (H202)를 사용한다는 것이다. 산으로서 H202가 존재할 경우, 상기 반응 용액 pH의 항구적인 모니터링, 게다가 전환 반응을 위해 수용할 수 있는 pH의 범위 (약 5 - 6) 내에 용액을 유지 시키기 위하여 (석회의 형태인 칼슘 카보네이트와 같은) 완충제의 사용을 필요로 한다. 더우기, 산소 공급물로서의 과산화수소를 사용하면 훨씬 더 많은 과산화수소 및 산인 다량의 부산물 조제물들이 생성되어, 훨씬 많은 카탈라아제 (과산화수소를 물 및 산소로 전환하기 위하여) 및 pH 중화제를 필요로 한다.
따라서, 상기로 알 수 있는 바는, 글루코오스로 부터 글루콘산을 생성시키기 위해 효소 반응을 제공할 필요가 있다는 것이며, 높은 전환률을 여전히 얻으면서도 30 % (w/w) ds.(dossolved solids; 용해된 고체) 의 상기 용해된 글루코오스 고체 농도 및 15 이상이 사용될 수 있고, 소듐 하이드록사이드와 같은 상기 감소된 양의 완충제를 사용할 수 있으며, 광대한 및/또는 고가의 다운스트림, 분리, 회수, 및/또는 정제 공정 및/ 또는 장치들을 사용할 필요 없이, 결정화 공정을 사용하지 않고도 분무-건조된 및 본질적으로 순수한 글루콘산 과립을 제조할 수 있다는 것이다.
본 발명은 글루콘산으로의 글루코오스 효소 전환 방법, 이에 의해 제조된 글루콘산, 특히, 과립형 글루콘산 생성물의 제조법 및 이에 의해 제조된 과립형 생성물에 관한 것이다.
본 발명의 제 1 목적은 글루코오스로 부터 글루콘산을 제조키 위한 방법을 제공하는 것으로서, 30 % (w/w) ds. 이상의 용해된 고체 농도 글루코오스가 사용되어 높을 전환률 (100%에 근접할 정도)을 얻을 수 있으면서, 결정화 공정을 사용하지 않고도 분무-건조되고 본질적으로 순수한 과립형 글루콘산을 생성되게 하는, 방대하고 고가의 다운스트림, 회수 및/또는 정제를 필요로 하지 않는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 제 2 목적은 상기 방법 30을 제공하는 것으로서, 이로 인해 생성된 최종 글루콘산 용액은, 전환되지 않은 잔여 글루코오스를 포함하는 저 농도의 불순물을 갖는다.
본 발명의 제 3 목적은 소듐 하이드록사이드와 같은 적은 (감소된) 양의 완충제가 사용될 필요가 있는 상기 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 제 4 목적은 결정화 방법을 사용할 필요없이, 건조한 저-제진 (low-dust)의 과립형 글루콘산 생성물을 생성시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 그밖의 양상에서, 실질적으로 순수한 글루콘산 용액을 제공하기 위한 것이 본원의 목적이다.
본 발명의 더 추가적인 양상은 건조한 저-제진 (low-dust)의 과립형 글루콘산 생성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 지침에 따라, 본원에 공개된 것은 글루코오스를 글루콘산으로 효소 전환시키는 방법이다. 본 방법은 글루코오스의 용액을 제공하는 것을 포함한다. 본 방법은 산소 공급물의 존재하에 상기 용액 내 글루코오스의 1g ds. 당 약 25 - 약 30 GOU의 글루코오스 옥시다아제 및 용액 내 글루코오스의 1g ds. 당 1200 CU 이상의 카탈라아제를 상기 용액에 가하는 것을 추가로 포함한다. 상기 방식에서, 글루코오스는 효소에 의해 글루콘산으로 전환된다.
바람직하게, 글루코오스 용액은 약 25 % (w/w) ds.의 글루코오스 내지 약 60 % (w/w) ds.의 글루코오스, 더 바람직하게, 약 30 % (w/w) ds.의 글루코오스 내지 약 50 % (w/w) ds.의 글루코오스를 갖는다.
바람직한 구체예로, 상기 용액 내 글루코오스 1g ds. 당 약 27 GOU 글루코오스 옥시다아제를 상기 용액에 가한다.
바람직하게, 상기 용액 내 글루코오스 1g ds. 당 약 1279 - 약 1999 CU 카탈라아제를 상기 용액에 가한다.
제 1 의 바람직한 구체예로, 상기 용액 내 글루코오스 1g ds. 당 1279 CU 이상의 카탈라아제를 상기 용액에 가한다.
제 2 의 바람직한 구체예로, 상기 용액 내 글루코오스 1g ds. 당 1559 CU 이상의 카탈라아제를 상기 용액에 가한다.
제 3 의 바람직한 구체예로, 상기 용액 내 글루코오스 1g ds. 당 1999 CU 이상의 카탈라아제를 상기 용액에 가한다.
바람직하게, 상기 글루코오스 옥시다아제 및 카탈라아제를 두 번의 동등한 투여량으로 글루코오스 용액에 가하며, 여기서, 제 1 차 투여량은 반응의 개시 (log 0 시간)에, 제 2 차 투여량은 의도하는 총 반응 시간의 중간 (50%) 시점에 가한다.
또 다른 바람직한 구체예로, 글루코오스 옥시다아제 및 카탈라아제를 3 번의 동등한 투여량으로 글루코오스 용액에 가하며, 여기서, 제 1 차 투여량은 반응의 개시 (log 0 시간)에, 제 2 차 투여량은 총 반응 시간의 1/3 시점에, 제 3 차 투여량은 총 반응 시간의 2/3 시점에 가한다.
바람직하게, 상기 카탈라아제는 아스퍼자일러스 나이저 (Aspergillus niger) 종의 균주 (strain)에 의해 천연적으로 생성된다.
바람직하게, 글루코오스의 용액은 반응 전반에 걸쳐 약 5 - 약 7의 pH로 유지되며, 더 바람직하게, 상기 글루코오스 용액은 반응 전반에 걸쳐 pH 6 로 유지된다.
바람직하게, 글루코오스 용액의 온도는 반응 전반에 걸쳐 약 25℃ - 약 40℃로 유지되고, 및 더 바람직하게는 반응 전반에 걸쳐 약 30℃ - 약 35℃로 유지된다.
바람직하게, 글루코오스 용액의 압력은 반응 전반에 걸쳐 약 1 bar로 유지된다.
바람직하게, 글루코오스 용액을 통과하는 공기의 흐름은 반응 전반에 걸쳐 약 1vvm로 유지된다.
본원에 공개되어 있는, 특히 바람직한 구체예에서, 글루코오스를 글루콘산으로 효소 전환하기 위한 방법은 약 25 % (w/w) ds.의 글루코오스 내지 약 60 % 15(w/w) ds.의 글루코오스를 갖는 글루코오스 용액을 제공하는 것을 포함한다.
상기 방법은, 반응 전반에 걸쳐 약 5 - 약 7의 pH, 약 25℃ - 약 40℃의 온도, 약 1 bar의 압력 및 약 1vvm의 공기 흐름을 유지시켜 주면서, 산소 공급물의 존재하에 상기 용액 내 글루코오스 1g ds. 당 약 25 - 약 30 GOU의 글루코오스 옥시다아제 및 상기 용액 내 글루코오스 1g ds. 당 약 1279 - 약 1999 CU의 카탈라아제를 상기 용액에 가하는 것을 추가로 포함한다.
최종적으로, 본원에 공개된 본 발명의 그밖의 양상으로는 건조된 분무-과립형 글루콘산 생성물을 제조하는 방법 및 이에 의해 제조된 생성물이 있다.
본 발명에 관하여, 상기에 기술된 바와 같이 제조된 글루콘산-함유 용액은 농축되고, 여과되며, 이로 인해 글루콘산 결정 (소듐 글루코네이트임)이 얻어진다. 이후, 상기 결정은 분무-건조기 내 액체 소듐 글루코네이트로 분무-도포되며, 이로 인해 분무-과립형 글루콘산이 얻어진다.
[바람직한 구체예의 설명]
글루콘산으로의 글루코오스의 효소 전환을 위한 공개된 방법은, 용해된 (글루코오스) 고체 함량 25 % (w/w) ds. 이상의 글루코오스를 갖는 글루코오스 용액의 효소 전환을 가능케 하며, 이로인해 생성된 글루콘산 용액 내 전환되지 않은 잔류 글루코오스가 존재하지 않아, 소듐 하이드록사이드와 같은 완충제의 사용량이 감소되어져야 한다.
더우기, 본원에 공개된 이론은 광대한 및/또는 고가의 다운스트림, 분리, 회수 및/또는 정제 공정 및/또는 장치의 사용을 필요로 하지 않는 이러한 방법의 방식을 가능케 하고, 결정화 공정을 사용하지 않고도 분무-건조된 및 본질적으로 순수한 글루콘산의 생성을 가능하게 하며, 이로인해 얻어진 상기 글루콘산의 분무-건조된 과립의 조제를 가능케 한다.
본 발명의 상기 방법들은 결정화 또는 정제화 공정들을 사용하지 않고도 분무-과립형 글루콘산 및 순수한 글루콘산을 생성시킨다.
본 발명의 방법은 글루콘산으로의 글루콘산의 효율적인 효소 전환을 가능하게 한다. 본 방법은 글루코오스 용액을 제공하는 것을 포함한다. 본원에 지시된 바와 같이, 본 방법은 25 % (w/w) ds. 이상의 글루코오스 농도를 갖는 용액이 유용하다. 바람직하게, 글루코오스 용액은 약 25 % (w/w) ds.의 글루코오스 내지 약 60 % (w/w) ds.의 글루코오스를 갖는다. 특히, 약 30 % (w/w) ds.의 글루코오스 내지 약 50 % (w/w) ds.의 글루코오스를 갖는 글루코오스 용액을 사용함으로써 양호한 결과를 얻는다.
상기 방법은 산소 공급물의 존재하에, 상기 용액 내 글루코오스 1g ds. 당 약 25 - 30 GOU의 글루코오스 옥시다아제를 상기 용액에 가하는 것을 추가로 포함한다. 바람직하게, 상기 용액 내 글루코오스 1g ds. 당 약 27 - 29 GOU의 글루코오스 옥시다아제를 사용한다. 한 구체예에서, 용액 내 글루코오스 1g ds. 당 약 28.6 GOU의 글루코오스 옥시다아제가 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 한 글루코오스 옥시다아제의 단위는 분석 조건 25℃ 및 pH 7.0의 조건하에서, 분 당 옥시다아제 1 마이크로몰 D-글루코오스에 요구되는 효소의 양으로서 정의된다.
상기 방법은 산소 공급물의 존재하에, 상기 용액 내 글루코오스 1g ds. 당 1200 CU 이상의 카탈라아제를 상기 용액에 가하는 것을 추가로 포함한다. 바람직하게, 상기 용액 내 글루코오스 1g ds. 당 약 1279 - 약 1999 CU의 카탈라아제를 상기 용액에 가한다. 특히 바람직한 구체예에서, 용액 내 글루코오스 1g ds. 당 1279, 1559 및 1999 CU의 카탈라아제를 상기 용액에 가한다.
본원에 사용된 바와 같이, 한 카탈라아제의 단위는 분석 조건(35) 25℃ 및 pH 7.0의 조건하에서, 분 당 1u 몰의 과산화수소를 분해하기 위해 요구되는 효소의 양으로서 정의된다.
혹종의 적당한 카탈라아제가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 아스퍼자일러스 나이저 및 마이크로코커스 라이소데이크티커스(Micrococcus lysodeikticus) 의 균주로 부터 천연적으로 생성된 (즉, 유도된) 카탈라아제, 뿐만 아니라 보빈(bovine) 공급물과 같은 포유동물 공급물에 의해 생성된 카탈라아제가 사용될 수 있다. 이에 관련해서, 우리는 본원에서 5 종 아스퍼자일러스 나이저의 균주에 의해 천연적으로 생성된 카탈라아제가 특히 효력이 있다는 것을 반견해 왔다.
바람직하게, 옥시다아제 및 카탈라아제는 동등한 사용량으로 글루코오스 용액에 가해진다. 상기에 관하여, 본원의 한 구체예에서, 상기 옥시다아제 및 상기 카탈라아제는 두 번의 동등한 사용량으로 상기 용액에 가해지며, 여기서, 제 1차 투여량은 반응의 개시 (log 0 시간)에 있어, 제 2 차 투여량은 의도하는 총 반응 시간의 중간 (50%) 시점에 있어 가해진다. 상기 시점을 예시함에 있어, 24시간 동안 반응을 실행시킬 경우, 이 경우에 있어서는, 제 1 차 투여량을 반응의 개시에 있어 가하고, 제 2 차 투여량을 개시 13 시간 후 가해 주어야 할 것이다.
추가적으로 상기에 관한 제 2 구체예에 있어, 글루코오스 옥시다아제 및 15 카탈라아제는 3 번의 동등한 사용량으로 상기 용액에 가해지며, 여기서, 제 1 차 투여량은 반응의 개시 (log 0 시간)에 있어, 제 2 차 투여량은 의도하는 반응의 전체 시간의 1/3 (33.3%) 시점에, 제 3 차 투여량은 의도하는 반응의 전체 시간의 2/3 (66.6%) 시점에 가해진다. 상기 시점을 예시함에 있어, 24 시간 동안 반응을 실행시킬 경우, 이 경우에 있어서는, 제 1 차 투여량을 반응의 개시에 가하고, 제 2 차 투여량을 개시 9 시간 후 가해 주며, 제 3 차 투여량을 개시 17 시간 후 가해 주어야 할 것이다.
상기 글루코오스 용액이 혹종의 pH로 유지됨으로써, 상기 반응이 일어날 수 있다. 그러나, 본원에서는 바람직하게 반응 전반에 걸쳐 상기 글루코오스 용액을 약 5 - 약 7의 pH로 유지한다. 가장 바람직하게는 글루코오스 용액을 반응 전반에 걸쳐 pH 6으로 유지시켜 주는 것이다.
상기 글루코오스 용액이 혹종의 온도로 유지됨으로써, 상기 반응이 일어날 수 있다. 그러나, 이에 관해, 바람직하게는 글루코오스 용액의 온도가 반응 전반에 걸쳐 약 25℃ - 약 40℃로 유지되는 것이다. 가장 바람직하게는 글루코오스 용액의 온도가 반응 전반에 걸쳐 약 30℃ - 약 35℃로 유지되는 것이다.
상기 글루코오스 용액이 혹종의 압력으로 유지됨으로써, 상기 반응이 일어날 수 있다. 그러나, 이에 관해, 바람직하게는 글루코오스 용액의 압력이 반응 전반에 걸쳐 약 1 bar로 유지되는 것이다.
상기 글루코오스 용액이 혹종의 유속으로 상기 글루코오스 용액을 통하는 공기로 통과됨으로써 유지되어, 상기 반응이 일어날 수 있다. 본원에서, 바람직하게는 상기 글루코오스 용액을 통과하는 공기의 유속이 반응 전반에 걸쳐 약 1vvm으로 유지되는 것이다.
따라서, 글루콘산으로의 글루코오스의 효소 전환에 대해 본 발명의 방법을 기술해온 바와 같이, 이에 의해 생성된 상기 글루콘산 및 분무-과립형 글루콘산 생성물을 생성하기 위한 방법은 이제 부터 단지 예시만의 목적으로 본원에 기재된 하기 실시예로 참조되어지며, 이는 한정적인 의미가 없을 뿐만아니라 한정적으로 수용되지 않아야 한다.
본원에 그 밖의 구체적인 언급이 없을 경우, 본 발명의 실시예는, 아스퍼자일러스 나이저 (독일, SOLVAY ENZYMES, GmbH 사로 부터 구매)로 부터 얻은 글루코오스 옥시다아제, 등록 상표명 MicroCatalase L-100 (인디애나, SOLVAY ENZYMES, Inc., Elkhart)하에 시판되는 마이크로코커스 라이소데이크티커스로 부터 얻은 카탈라아제 및 등록 상표명 StaleyDex 333 R (미국, Staley)로 시판되는 정질 글루코오스를 사용하여 실시되었다.
실시예 1
pH의 효과
본 발명의 방법에 따른 글루코오스 옥시다아제-카탈라아제 효소 시스템에 의한 글루콘산으로의 글루코오스의 전환에 미치는 pH의 효과는 40% (w/w) ds.의 글루코오스 농도 하에서 연구되었다.
40% (w/w) ds. 글루코오스 용액 (8ℓ)를 제조하여 10ℓ 발효기 (fermentor ; 미국, 뉴저지, Chempec,Inc. 사 제품)에 도입하였다. 필요에 따라, 산 (즉, 5N 황산) 또는 알카리 (즉, 4N 소듐 하이드록사이드)로 희석하여 pH 4.0으로 조절하였다.
상기 반응을 1bar의 압력하에 35℃에서 수행하였고, 1 VVM의 속도로 공기- 기포를 발생시켰다. 50 % (w/w) 소듐 하이드록사이드를 부가함으로써 반응 동안 pH를 특정 pH로 유지시켰다. 발포방지제 MAZU DF6000 (PPG/MAZER CEMICAL) (80-120ppm)을 가함으로써 발포를 조절하였다.
로그 0 및 로그 12 시간에 글루코오스 용액의 용해된 고체 1g 당 12.25 글루코오스 옥시다아제 단위 (Gou) 및 글루코오스 용액의 용해된 고체 1g 당 726.8 카탈라아제 단위 (cu)의 사용량을 발효기에 가하였다.
글루콘산으로의 글루코오스의 전환은, 소비된 밀리당량의 소듐 하이드록사이드의 측정 및/또는 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC) 방법을 사용함으로써 상기 시료를 분석하여 측정되었다.
HPLC 분석은, RI 검출기 모델 ERC-7515A, (미국, ANSPEC Co.,Ins.사 제품)에 부착된 Beckman 112 용매 운송 모듈 (Solvent Delivery Module) (미국, BECKMAN)로 구성된 HPLC 시스템을 사용하여 수행되었다. 글루코오스 및 글루콘산은 80℃에서 HPX 87-C 칼럼 (미국, Bio-Rad 사 제품)을 사용하여 분리되었고, 0.01M의 칼슘 아세테이트 (pH 5.5)가 이동상으로서 1 ml/min의 유속으로 사용되었다.
470nm에서 5% (w/w) NaOH 용액 내 37.5 % (w/w) 액체 글루콘산의 흡광도 (광학 밀도)를 측정하여 유색의 불순물들을 측정하였다.
이후, 상기 반응 혼합물의 pH가 각 실험에 있어 각기 pH 5.0, pH 6.0, pH 7.0 및 pH 8.0인 것을 제하고는 상기 기술한 바와 동일한 반응 조건 및 동일한 실험안이 사용되는 4개의 부가적인 실험들이 수행되었다.
글루콘산으로의 글루코오스 전환의 효율에 있어, 상이한 pH의 효과는 하기 표 1에 요약되어 있다.
표 1은, 본 발명의 방법을 사용하여 pH가 5 - 7 일 때, 24시간 이내에 글루코오스가 글루콘산으로 100% 전환된다는 것을 나타낸다.
실시예 2
효소 사용-단일 첨가 및 복합 첨가
본 발명의 방법에 따른 글루콘산으로의 글루코오스의 전환 반응에 있어, 한 번 또는 몇번의 투여량으로 글루코오스 옥시다아제 및 카탈라아제를 가한 것의 효과는, 효소의 투여 방법 및 타이밍을 제하고는 실험안 및 방법 조건이 동일하게 유지된 세 개의 실험을 수행하여 측정되었다.
글루콘산으로의 글루코오스 전환은, 모든 실험의 반응 혼합물이 pH 6.0으로 유지되고; 효소 첨가의 양 및 타이밍을 다양화 하였다는 예외 사항을 제하고는 표 1에 상기 기술한 바와 같은 동일한 조건하에 동일한 실험안을 사용하여 세 가지 별개의 실험들로 수행되었다. 이점에 있어서, 가해진 글루코오스 및 카탈라아제의 전체 농도는 일정하게 유지되었지만 (용해된 글루코오스 고체의 1g 당 27 글루코오스 옥시다아제 단위 및 용해된 글루코오스 고체의 1g 당 1599 카탈라아제 단위로) 이는 한 번, 두 번, 세 번의 투여량으로 가해졌다.
효소 첨가의 양 및 시간에 관하여, 제 1 실험에서는 로그 0 시간에서 27 GOU/g ds. 및 1599 CU/g ds.를 가하였고; 제 2 실험에서는 로그 0 및 로그 12 시간에서 13.5 GOU/g ds. 및 799.5 CU/g ds.를 가하였으며; 제 3 실험에서는 로그 0, 로그 6 및 로그 12시간에서 9 GOU/g ds. 및 533 CU/g ds.를 가하였다.
글루콘산으로의 글루코오스 전환에 있어, 반응 전반적으로 한 번 또는 몇번의 투여량으로 글루코오스 옥시다아제 및 카탈라아제를 가한 효과는 하기 표 2에 요약되어 있다:
실시예 3
글루코오스 옥시다아제에 의한 글루콘산으로의 글루코오스 산화에 있어 카탈라아제의 역할
본 발명의 방법에 따른 글루콘산으로의 글루코오스 전환에 있어 다양한 농도의 카탈라아제의 효과는, 첨가된 카탈라아제의 농도를 제하고는 동일한 실험안 및 방법 조건하에 다섯 가지의 실험을 수행함으로써 측정되었다.
글루콘산으로의 글루코오스 전환은, 반응 혼합물의 온도가 40℃로 유지되고; 가해진 글루코오스의 농도가 28.6 GOU/g ds.이며; 가해진 농도가 하기 기재될 바와 같이 다양하고; 모든 카탈라아제 및 글루코오스 옥시다아제가 로그 0 시간에 가해진 것으로 하는 예외 사항을 제하고는 상기 실시예 2에 기술된 바와 같은 동일한 방법 조건 및 동일한 실험안을 사용하여 다섯 가지 별개의 실험으로 실시되었다.
가해진 카탈라아제의 농도에 관하여, 가해진 카탈라아제의 농도를 하기에서 처럼 다양화 하였다: 제 1 실험에 있어서, 0 카탈라아제 단위/g ds.를 가하였고; 제 2 실험에 있어서, 959 카탈라아제 단위/g ds.를 가했으며; 제 3 실험에 있어서, 1279 카탈라아제 단위/g ds.를 가하였고; 제 4 실험에 있어서, 1559 카탈라아제 단위/g ds.를 가했으며; 제 5 실험에 있어서, 1999 카탈라아제 단위/g ds.를 가하였다.
동일한 조건하에 글루콘산으로의 글루코오스 전환에 있어서, 카탈라아제 농도를 다양화 한것에 대한 효과는 하기 표 3에 요약되어 있다:
상기 표 3의 결과는, 본 발명의 방법에 있어서 과산화수소에 의한 글루코오스 옥시다아제의 비활성화는 카탈라아제의 첨가로 상당히 감소된다는 사실을 나타낸다. 카탈라아제의 부재하에, 글루콘산으로의 글루코오스 산화는 5 시간 동안 단지 7%의 전환률로 수행되었다. 글루콘산으로의 글루코오스 전환률 (%)은 카탈라아제의 농도가 증가됨에 따라 증가하여, 고농도의 카탈라아제로 심지어 최대 전환률인 80%에 까지 이르렀다. 상기 전환되지 않은 잔여 글루코오스는 상기 실험 조건하에 글루코오스 옥시다아제와 관련된 안정성 (반-수명)으로 기인한 것일수 있다.
실시예 4
글루코오스 옥시다아제-카탈라아제 효소 시스템을 사용한 글루콘산으로의 글루코오스 산화에 있어서 온도의 효과
본 발명의 방법에 따르는 글루콘산으로의 글루코오스 전환에 있어서, 다양한 온도의 효과는, 반응의 온도를 제하고는 동일하게 유지된 방법 조건 및 실험안으로 네 가지의 실험을 수행함으로써 측정되었다.
글루콘산으로의 글루코오스 전환은, 하기에 기술될 바와 같이 반응 혼합물의 온도가 다양한; 50%의 상기 글루코오스 옥시다아제 단위 (13.5 글루코오스 옥시다아제 단위) 및 50%의 상기 10 카탈라아제 단위 (799.5 카탈라아제 단위)는 로그 0 시간에서 가해 지며, 50%의 상기 글루코오스 옥시다아제 단위 (13.5 글루코오스 옥시다아제 단위) 및 50%의 상기 카탈라아제 단위 (799.5 카탈라아제 단위)가 로그 9 시간에서 가해진 것을 제하고는 상기 실시예 2에 기술된 바와 같은 동일한 방법 조건 및 동일한 실험안을 사용하여 네 가지 별개의 실험으로 수행되었다.
사용 온도에 관하여, 사용 온도를 하기와 같이 다양화 하였다: 제 1 실험에 있어서, 온도는 25℃이고; 제 2 실험에 있어서, 온도는 30℃이며; 제 3 실험에 있어서, 온도는 35℃이고; 제 4 실험에 있어서, 온도는 40℃이었다.
동일한 조건하에 글루콘산으로의 글루코오스 전환에 있어, 상기 다른 온도들의 효과는 하기 표 4에 요약되어 있다:
실시예 5
글루코오스 옥시다아제-카탈라아제 효소 시스템을 사용한 글루콘산으로의 글루코오스 전환에 있어서, 글루코오스 농도의 효과
본 발명의 방법에 따르는 글루콘산으로의 글루코오스 전환에 있어 글루코오스의 다양한 농도의 효과는 가해진 글루코오스 농도를 제하고는 동일하게 유지된 방법 조건 및 실험안으로 6 가지의 실험을 수행함으로써 측정되었다.
글루콘산으로의 글루코오스의 전환은, 반응 혼합물의 온도를 30℃로 유지하고; 가해진 글루코오스의 농도를 하기에 기술될 바와 같이 다양화 하며; 모든 카탈라아제 및 글루코오스 옥시다아제를 로그 0 시간에서 가한 것을 제하고 상기 실시예 2에 기술된 바와 같은 동일한 방법 조건 및 동일한 실험안을 사용한 여섯 가지의 독립된 실험으로 수행되었다.
글루코오스 옥시다아제-카탈라아제 효소에 의한 글루콘산으로의 글루코오스의 전환률에 있어서 (용해된 고체) 글루코오스 농도의 효과는, 하기와 같이 다양한 글루코오스 농도를 사용한 것을 제하고는 상기 실시예 2에 기술된 바와 같이, 연구되었다: 제 1 실험에 있어서, 상기 글루코오스 농도는 30% ds.이고; 제 2 실험에 있어서, 상기 글루코오스 농도는 35% ds.이며; 제 3 실험에 있어서, 상기 글루코오스 농도는 40% ds.이고; 제 4 실험에 있어서, 상기 글루코오스 농도는 45% ds.이며; 제 5 실험에 있어서, 상기 글루코오스 농도는 50% ds.이고; 제 6 실험에 있어서, 상기 글루코오스 농도는 55% ds.이다.
동일한 조건하에 글루콘산으로의 글루코오스 전환에 있어 글루코오스 농도를 다양화한 것의 효과는 하기 표 5 (a 및 b)에 요약되어 있다:
표 5 (a 및 b)의 결과는, 본 발명의 방법을 사용하는 것이 반응 속도에 있어 용해된 고체의 상당한 이득 효과를 가져옴을 나타낸다. 용해된 고체들의 증가와 더불어 산소의 용해도 증가가 아마도 속도를 늦추게 한 요인일 것이다. 그러나 상기 효소들의 사용량을 조절함으로써, 특정 시간 내에 전환을 종료시킬 수 있다. 표 5 (a 및 b)의 데이터는, 산소/유용한 산소의 농도 및 반응 시간의 길이 (효소가 사용된 반응)가 전체적 공정의 경제성에 상당한 영향을 미침을 명백하게 보여준다.
실시예 6
다른 공급물로 부터 얻은 카탈라아제의 평가
글루코오스 옥시다아제를 사용함으로써 글루콘산으로의 글루코오스의 전환에 있어 다른 공급물로 부터의 카탈라아제의 효과는 동일한 반응 조건하에 연구되었다. 다음의 카탈라아제들이 사용되었다: 미국, SOLVAY ENZYMES, Inc.가 시판하는 산업 생성물인 보빈(bovine) 카탈라아제 (CATALASE L), 독일, SOLVAY ENZYMES, GmbH사가 시판하는 아스퍼자일러스 나이저 카탈라아제 및 마이크로코커스 카탈라아제.
상기 모든 시료들의 카탈라아제 활성은 H. Luck에 의한 효소 분석 방법 (H.U. Bergmeyer 등, 1965, 885 - 894쪽, Verlag Chemie & Academic Press, New York, London)내 기술된 바와 같이 분광 광도 분석으로 측정되었다.
상기 실험은 상기 글루코오스 및 상기 카탈라아제를 로그 0 시간에서 글루코오스 용액에 가하는 것을 제하고는 실시예 2에 기술된 반응 조건하 및 실험안을 사용하여 수행되었다.
상기 결과는 하기 표 6에 요약되어 있다:
표 6을 통해 알 수 있는 바와 같이, A.나이저 및 마이크로코커스 카탈라아제는 모두 속도가 다양하기는 하지만 글루코오스가 글루코오스로 100% 전환되는 것으로 나타났다. 그러나, 보빈 (Bovine) 카탈라아제는 단지 60%의 전환률로 달성되었다. 비록 세 개의 효소들이 모두 동일한 사용량으로 가해졌다 하더라도, 그 속도는 다르게 관찰되었다. 이는 과산화수소에 대한 카탈라아제의 안정성이 다르기 때문이다.
실시예 7
상이한 산업적 글루코오스 시럽의 평가
본 발명의 방법에 따른 글루콘산으로의 글루코오스의 전환에 있어, 다양한 순도를 가진 상이한 공급물인 글루코오스 시럽의 효과를 측정하였다.
상이한 글루코오스 시럽의 전환은, 상기 실시예 2에 기술되어진 바와 동일한 실험안 및 공정 조건을 사용하여 세 개의 별개 실험으로 수행되었다. 사용된 상이한 글루코오스 시럽은, 하기와 같이 다양한 순도를 갖는 산업상 이용 가능한 글루코오스 10 시럽이었다: Commercia + 1 Clintose "L" TM (미국, ADM Corn Processing); Clearsweet TM 99 Refined Liquid Dextrose (미국, Cargill); 및 Royal R Glucose Liquid, 2637 (미국, Corn Products).
본 발명의 방법에 따른 글루콘산으로의 글루코오스의 전환의 효율에 관한 상이한 글루코오스 시럽의 효과는 하기 표 7에 요약되어 있다:
표 7로 부터 알 수 있는 바와 같이, 상기 실험의 표준 조건하에서 단지 Clintose 및 정질 글루코오스만이 100%의 전환을 가져왔다. 그러나, Clearsweet 및 Royal glucose는 모두 80 - 90%의 전환률을 가져왔다.
실시예 8
건조, 분무-과립형 글루콘산/ 글루코네이트의 생성물 및 이와 산업상 제조물과의 비교
산업용 글루콘산/ 글루코네이트 보다 양호하거나 대등한 액체 또는 과립형 글루콘산/플루코네이트를 혹종의 수소 처리 또는 결정화 없이도 제조할 수 있는 본 발명의 실시 방법은 하기 실시예로 추가 예시된다.
글루콘산/ 글루코네이트는 실시예 2의 실험 3에 기술된 바와 같이 반응기로 부터 얻어졌다. 이렇게 얻어진 (액체 소듐 글루코네이트의 형태로) 글루콘산을 농축시킨 후, 결정들을 여과법 (마이크로/울트라/폴리쉬)으로 분리하여 37℃에서 건조시켰다. 이후, 상기 결정들은 분무 과립형 글루콘산/ 글루코네이트를 제조하기 위한 공급물로서 사용되었다.
사용된 분무-건조기는 공기 온도를 다양하게 할 수 있고, 베드를 통해 흐르게 할수 있는 Wurster Laboratory Model 유체 베드 건조기인 Uni-Glatt이었다. 상기 칼럼 외부의 공기 구멍 중 약 3/4가 차단되었다. 분무용 노즐은 한 쌍의 유체 노즐 (Schlick)이었다.
분무 공기 캡의 열림은 액체 노즐 둘레의 0.5mm 이고, 액체 노즐의 열림 보다 1mm 작았다. 상기 액체 노즐을 1.2mm 열었다. 상기 공기의 유속은 상기 베드를 유체화하고, 상기 Wuster 칼럼 (최대 110 CFM)을 통과하는 유속이 유지되도록 하기에 충분하였다.
(건조된) 소듐 글루코네이트 결정 (500g)을 Uni-Glatt 건조기 안에 넣고, 글루콘산/ 소듐 글루코네이트 (8480g의 맑은 여과액; 41.2°브릭스)를 결정의 낮은 대량 밀도 (0.5g/cc) 때문에 낮은 입구 공기 유속으로 결정에 분무-도포하였다 (100 - 105℃의 입구 공기 온도, 60 - 65℃의 출구 공기 온도).
초기에, 공기 유속은 50cfm (cubic feet per minute) 이었고, 이는 입자 밀도가 증가함에 따라, 110cfm로 증가되었다. 총 건조시킨 시간은 316 분이었다.
최종 입자는 매끄러운 표면을 가진 불규칙한 구(球)이었다. 상기 방법에 있어, 질량 수율은 97.5%이었다.
하기 공급 물질로 부터의 산업상 이용 가능한 각각의 글루콘산 제조법을 사용하여 상기 절차를 반복하였다: (1) Sigma Chemicals (USA); (2) ADM-Decatur (USA); (3) AKZO (USA); (4) Penta Mfg. (USA); 및 (5) PMP (USA). TLFY (6)는 본 실시예에 따라 제조된 글루콘산 제조물이다.
상기 상이한 제조물의 글루콘산 함량은 상기 실시예 1에 기술된 바와 동일한 조건 및 실험 계획안을 사용하여 HPLC에 의해 측정되었다.
색상 불순물들은 470nm에서 5% (w/w) NaOH 용액 내 37.5% (w/w) 용액 글루콘산의 흡광도 (광학 밀도)를 측정하여 분석되었다.
상기 결과는 하기 표 8에 요약된다:
상기1순도 %는 1ml/분, 80℃, 0.01M Ca 아세테이트 pH 5.5, HPX-87C임.
표 8의 결과들은, 본 발명의 분무-과립형 글루콘산 제조물의 품질이 수소 처리 및 결정화와 같은 혹종의 추가 정제없이도 산업상 이용할 수 있는 건조 글루콘산 제조물보다 우수하다라는 것을 보여준다.

Claims (20)

  1. 글루코오스 용액을 제공하는 단계; 및 산소 공급 물질의 존재하에, 상기 용액 내 글루코오스 1g ds.(dissolved solids; 용해된 고체) 당 약 25 - 30 GOU (Glucose Oxidase Units; 글루코오스 옥시다아제 단위)의 글루코오스 옥시다아제 및 상기 용액 내 글루코오스 1g ds. 당 1200 CU (Catalase Units; 카탈라아제 단위) 이상의 카탈라아제를 상기 용액에 가하는 단계를 포함하는, 글루콘산으로 글루코오스를 효소 전환시키는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 약 25% (w/w) ds.의 글루코오스 내지 약 60% (w/w) ds.의 글루코오스를 갖은 글루코오스 용액를 추가로 포함하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 약 30% (w/w) ds.의 글루코오스 내지 약 50% (w/w) ds.의 글루코오스를 갖은 글루코오스 용액를 추가로 포함하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 글루코오스 1g ds. 당 약 27 GOU의 글루코오스를 상기 용액에 가하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 글루코오스 1g ds. 당 약 1279 CU의 카탈라아제를 상기 용액에 가하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 글루코오스 1g ds. 당 약 1559 CU 이상의 카탈라아제를 상기 용액에 가하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 글루코오스 1g ds. 당 약 1999 CU 이상의 카탈라아제를 상기 용액에 가하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 글루코오스 옥시다아제 및 상기 카탈라아제를 상기 글루코오스 용액에 두 번의 동등한 투여량으로 가하는 방법으로서, 제 1 차 투여량은 반응이 개시될 때 가하여 주고, 제 2 차 투여량은 의도되는 총 반응 시간의 중간 시점에 가하여 주는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 카탈라아제가 아스퍼자일러스 나이저 (Aspergillus niger) 종의 균주(strain)로 부터 천연적으로 생성된 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 글루코오스 용액이 약 5 - 약 7의 pH로 유지되는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 글루코오스 용액이 약 6의 pH로 유지되는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 글루코오스 용액의 온도가 약 25℃ - 약 40℃로 유지되는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 글루코오스 용액의 온도가 약 30℃ - 약 35℃로 유지되는 방법.
  14. 제 1 항에 있어서, 상기 글루코오스 용액의 압력이 약 1 bar로 유지되는 방법.
  15. 제 1 항에 있어서, 상기 반응동안 용액을 통과 하는 공기의 유속이 약 1 vvm으로 유지되는 것을 추가로 포함하는 방법.
  16. 약 25 % (w/w) ds. 글루코오스 내지 약 60 % (w/w) ds. 글루코오스를 갖는 글루코오스 용액을 제공하는 단계; 및 상기 글루코오스 용액을 약 5 - 약 7의 pH, 약 25℃ - 약 40℃의 온도, 약 1 bar의 압력으로 유지하고, 상기 용액을 통과하는 공기의 유속을 약 1 vvm로 유지하면서, 산소 공급물질의 존재하에, 상기 용액 내 글루코오스 1g ds. 당 약 25 - 약 30 GOU의 글루코오스 옥시다아제 및 상기 용액 내 글루코오스 1g ds. 당 약 1279 - 약 1999CU의 카탈라아제를 상기 용액에 가하는 단계를 포함하는 글루코오스를 글루콘산으로 효소 전환하는 방법.
  17. 제 1 항의 방법에 의해 제조된, 상당히 순수한 글루콘산 용액.
  18. 글루콘산-함유 액체배지 (broth)를 얻는 단계; 이 액체배지로 부터 글루콘산 결정을 얻음으로써 글루콘산 결정을 얻는 단계; 분무-건조기 내에서 액체 소듐 카보네이트로 글루콘산 결정을 분무-도포하여 분무-과립형 글루콘산을 얻는 단계를 포함하는, 분무-과립형 글루콘산을 제조하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 글루콘산 결정이 글루콘산-함유 액체배지를 농축하고 여과함으로써 글루콘산-함유 액체배지로 부터 얻어지는 방법.
  20. 제 18 항의 방법에 의해 제조된 분무-과립형 글루콘산 과립.
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