CN102605014B - 一种l-2-氨基丁酸的生物制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及 一种 L-2- 氨基丁酸的生物制备方法，其以 L- 苏氨酸为原料，使 L- 苏氨酸在水中、在 L- 苏氨酸脱氨酶和具有亮氨酸脱氢酶和辅酶再生功能的全细胞的催化作用下，在温度 15 ℃ ~50 ℃下搅拌反应得到 L-2- 氨基丁酸 。 本发明方法以水代替缓冲盐溶液构成水相反应体系，原料成本降低；用于催化的苏氨酸脱氨酶和全细胞均可由微生物发酵大规模生产，成本低，来源广；生物酶促催化反应为水相反应，酶法转化条件温和，原料转化彻底，后处理简单，采取等电点结晶与薄膜蒸发分离技术相结合的方法分离产物，同时回收水和甲酸铵，成本低，无废水废渣，工艺环保 , 适于产业化生产 L-2- 氨基丁酸。

Description

一种L-2-氨基丁酸的生物制备方法
技术领域
本发明涉及一种L-2-氨基丁酸的生物制备方法。
背景技术
 L-2-氨基丁酸是抑制人体神经信息传递的天然氨基酸，作为重要的化工原料和医药中间体，已被广泛应用于药物合成。L-2-氨基丁酸是合成新型抗癫痫药左乙拉西坦的主要生产原料, 也是合成抑菌抗结核药乙胺丁醇盐酸盐的关键手性前体; 乙胺丁醇也是多种手性药物的手性中间体。
受技术和成本的限制，我国L-2-氨基丁酸的产量不能满足国内和外贸出口的需求。L-2-氨基丁酸的制备方法已有化学法和生物方法, 传统的化学法不论是有机合成或化学拆分均因生产成本高而失去竞争力。生物方法中因酶催化方法制备方法效率高，专一性强而得到广泛的应用。在酶法制备L-2-氨基丁酸的研究中，转氨酶法和脱氢酶法是目前报道较多的方法.    
转氨酶法中最为典型的是Fotheringham等在Rozzell等人研究的基础上，开发的以L-苏氨酸为原料，建立的三酶催化体系制备L-2-氨基丁酸的方法，其三酶体系为苏氨酸脱氨酶、芳香氨基酸转氨酶和乙酰乳酸合成酶。但该法生产L-2-氨基丁酸的转化率只有54%，浓度只有20克/升左右，而且转化时产生一定量的副产物NH 3 ，L-丙氨酸和3-羟基-2-丁酮，产品分离纯化困难，质量难以提高。
脱氢酶法例如中国发明专利ZL201010146920.6，报道了以L-苏氨酸为原料，建立的三酶催化体系制备L-2-氨基丁酸的方法，其三酶体系为以L-苏氨酸为原料，先由苏氨酸脱氨酶转化成2-丁酮酸, 再由亮氨酸脱氢酶2-丁酮酸合成L-2-氨基丁酸，反应中加入用于再生辅酶的甲酸脱氢酶。三种酶的加入总量为0.5~5克/升，底物L-苏氨酸的加入量为10~100克/升，缓冲液pH值为7.0~9.0的磷酸盐溶液，调节反应液的pH值所用的溶液为浓氨水，温度为15~40℃；时间为3~48小时；反应为一锅法。但该发明方法中，所述三种酶均需要克隆表达后经细胞破碎，冷冻干燥得到冻干粉的酶制剂，增加了催化剂的成本；反应体系需要以磷酸盐作为缓冲体系，增加了原料成本. 该工艺反应后处理只是初步处理，按照该工艺产品中的无机盐及甲酸铵等杂质难以达到原料药的要求。因此，有必要进一步开发一种高效，低成本，且易于产业化大生产的酶催化制备L-2-氨基丁酸的新方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种改进的L-2-氨基丁酸的生物制备方法，该方法高效，成本低，易于产业化生产。
为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：
一种L-2-氨基丁酸的生物制备方法，其以L-苏氨酸为原料，使L-苏氨酸在水中、在L-苏氨酸脱氨酶和具有亮氨酸脱氢酶和辅酶再生功能的全细胞的催化作用下，在温度15℃~50℃下搅拌反应得到L-2-氨基丁酸。
根据本发明的进一步实施方案：所述苏氨酸脱氨酶和全细胞的加入总量为0.5~70克/升水， L-苏氨酸的加入量为10~130克/升水。优选地，所述苏氨酸脱氨酶和全细胞的加入量分别为L-苏氨酸加入量的0.3%~0.6%和25 %~70%。
优选地，使反应在温度25℃~40℃下进行；反应的时间为5~30小时。
根据本发明的一个方面，所述方法还使得所述反应在辅酶磷酸吡哆醛(PLP)的存在下进行，磷酸吡哆醛的加入量为L-苏氨酸加入量的0.01% ~ 0.05%。
根据本发明的又一方面，所述方法还使得所述反应在甲酸铵的存在下进行，甲酸铵的加入量为L-苏氨酸加入量的1 ~ 1.2当量。
根据一个具体方面，所述制备方法的实施过程如下：取L-苏氨酸，甲酸铵，L-苏氨酸脱氨酶，全细胞，磷酸吡哆醛，溶解在水中，控制温15℃~50℃，搅拌反应，利用液相色谱-质谱联用(LC/MS)监测反应的转化率，至转化率超过98%，停止反应。进一步地，所述方法还包括在反应结束后，以等电点结晶和薄膜蒸发分离技术相结合的方法分离产物。更具体地，反应结束后，加热体系至70~80℃，破坏酶蛋白，离心除去蛋白，上层清液用甲酸调节pH为5.5~6(最优选5.8)蒸发回收水得浅黄色固体，进一步用甲醇洗涤该浅黄色固体，抽滤，烘干得白色固体即为L-2-氨基丁酸。优选地，所述方法还包括从洗涤浅黄色固体后产生的洗涤液中回收甲酸铵和甲醇。采取等电点结晶与薄膜蒸发分离技术相结合的方法分离产物，同时回收水和甲酸铵，成本低，无废水，无废渣，工艺环保。
根据本发明，所述具有亮氨酸脱氢酶和辅酶再生功能的全细胞的来源参考文献方法(Applied and environmental microbiology 1997, 63(12):4651)。L-苏氨酸、L-苏氨酸脱氨酶、磷酸吡哆醛及甲酸铵可商购获得。
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
由于以上技术方案的实施，本发明与已有技术相比具有如下优势：
本发明方法以水代替缓冲盐溶液构成水相反应体系，原料成本降低；用于催化的L-苏氨酸脱氨酶和全细胞均可由微生物发酵大规模生产，成本低，来源广；生物酶促催化反应为水相反应，酶法转化条件温和，原料转化彻底，后处理简单，采取等电点结晶与薄膜蒸发分离技术相结合的方法分离产物，同时回收水和甲酸铵，成本低，无废水，无废渣，工艺环保, 适于产业化生产L-2-氨基丁酸。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。
     实施例1
取L-苏氨酸100mg，甲酸铵160mg，L-苏氨酸脱氨酶0.6mg，全细胞(Applied and environmental microbiology 1997, 63(12):4651) 50mg，磷酸吡哆醛(PLP) 0.05mg，溶解在1mL水中，保持水浴温度35℃，搅拌，转速500rpm。LC/MS跟踪检测转化情况，22h转化率98.6%。
实施例2
取L-苏氨酸20g，甲酸铵12.7g，L-苏氨酸脱氨酶0.12g，全细胞(Applied and environmental microbiology 1997, 63(12):4651) 13g，PLP 0.01g，溶解在200mL水中，保持水浴温度35℃，搅拌，转速500rpm。LC/MS跟踪检测转化情况，21h转化率大于99%。停止反应，反应液加热至70~80℃，加热1h左右，破坏酶蛋白，离心去蛋白。上层清液用甲酸调pH为5.8左右，蒸干回收水，剩余物为浅黄色固体，该固体用200~300mL甲醇洗涤除去甲酸铵，洗涤液回收甲酸铵和溶剂甲醇，抽滤，烘干得白色固体14.2g，收率为71%。纯度大于99.5%，比旋光度19.6 ??。
实施例3
取L-苏氨酸12g，甲酸铵7.56g，L-苏氨酸脱氨酶0.06g，全细胞(Applied and environmental microbiology 1997, 63(12):4651) 3g，PLP 0.005g，溶解在100mL水中，保持水浴温度35℃，搅拌，转速500rpm。LC/MS跟踪检测转化情况，24h转化率大于99 %。收率86%。
实施例4
取L-苏氨酸1000g, 甲酸铵635g, L-苏氨酸脱氨酶60g, 全细胞(Applied and environmental microbiology 1997, 63(12):4651) 600g, PLP 0.5g，溶解在10000mL水中，保持水浴温度35℃，搅拌，转速500rpm。LC/MS跟踪检测转化情况，28h转化率大于99%。停止反应，反应液加热至70~80℃，加热1h左右，破坏酶蛋白，离心去蛋白。上层清液用甲酸调pH为5.8左右，薄膜蒸发回收水，剩余物为浅黄色固体，该固体用10000~15000mL甲醇洗涤除去甲酸铵，洗涤液回收甲酸铵和溶剂甲醇，抽滤，烘干得白色固体720g，收率为83%。纯度大于99.5%。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种L-2-氨基丁酸的生物制备方法，以L-苏氨酸为原料，其特征在于：所述方法使L-苏氨酸在水中、在L-苏氨酸脱氨酶和具有亮氨酸脱氢酶和辅酶再生功能的全细胞的催化作用下，在甲酸铵、辅酶磷酸吡哆醛的存在下、在温度15℃~50℃下搅拌反应得到L-2-氨基丁酸，所述苏氨酸脱氨酶和全细胞的加入总量为0.5~70克/升水，所述苏氨酸脱氨酶和全细胞的加入量分别为L-苏氨酸加入量的0.3%~0.6%和25% ~70%，L-苏氨酸的加入量为10~130克/升水，磷酸吡哆醛的加入量为L-苏氨酸加入量的0.01% ~ 0.05%，甲酸铵的加入量为L-苏氨酸加入量的1~1.2当量，所述方法还包括在反应结束后，以等电点结晶和薄膜蒸发分离技术相结合的方法分离产物，具体地，反应结束后，加热体系至70~80℃，破坏酶蛋白，离心除去蛋白，上层清液用甲酸调节pH为5.5~6，蒸发回收水得浅黄色固体，进一步用甲醇洗涤该浅黄色固体，抽滤，烘干得白色固体即为L-2-氨基丁酸。
2.根据权利要求1所述的L-2-氨基丁酸的生物制备方法，其特征在于：使所述反应在温度25℃~40℃下进行。
3.根据权利要求1所述的L-2-氨基丁酸的生物制备方法，其特征在于：所述反应的时间为5~30小时。
4.根据权利要求1所述的L-2-氨基丁酸的生物制备方法，其特征在于：所述方法还包括从洗涤浅黄色固体后产生的洗涤液中回收甲酸铵和甲醇。
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