CN111662937B - 一种制备氯霉素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明的提供一种从廉价易得的对硝基苯甲醛和L‑苏氨酸在转醛酶的作用下制备(2S,3R)‑对硝基苯丝氨酸，此氨基酸中间体再进行还原、二氯乙酰化就得到了目标产物氯霉素。

Description

一种制备氯霉素的方法

技术领域

本发明涉及一种制备氯霉素的方法，属于生物制药和生物化工的技术领域。

背景技术

氯霉素是目前市场上最广谱抗菌素药物之一,其抗菌作用机制是与核蛋白体50S亚基结合，抑制肽酰基转移酶，从而抑制蛋白质合成。它对大多数革兰氏阴性以及阳性细菌、流感杆菌、百日咳杆菌、痢疾杆菌、大肠杆菌、肺炎杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌、立克次体、沙眼衣原体等都能有效控制。其在生物医药领域应用非常广泛，因此探索一种温和、高效、经济的方法制备氯霉素受到了广大化学生物工作者的关注。

氯霉素，其结构式如下所示：

目前工业制备氯霉素的方法是：以苯乙酮为起始原料，通过溴化、氨化、乙酰化、羟醛缩合、异丙醇铝还原、水解脱保护、手性拆分以及二氯乙酰化等8步化学反应制备的，流程如下：

此方法存在多个缺点：

1、此路线需要手性拆分，而拆分的理论收率只有50％，这导致了整条路线的收率在30％以下；另外拆分的步骤非常繁琐，给工业生产带来很大的不便。

2、此路线中需要用到乙酰基保护，再脱保护，原子经济性较差并且反应步骤的增加使得整体的收率降低，同时也对工业化生产增加了难度。

3、此路线还原步骤中使用异丙醇铝，此过程产生大量难于处理的三废，对环境危害非常大。

因此，探索一种温和、高效、经济、对环境友好的氯霉素制备方法是非常有意义的。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种简单易行的合成氯霉素的新方法，该方法操作简单，条件温和，大幅度降低了生产的成本，适合大规模的工业化生产。

本发明提供一种从廉价易得的对硝基苯甲醛和L-苏氨酸在转醛酶的作用下制备(2S,3R)-对硝基苯丝氨酸，此氨基酸中间体再进行还原、二氯乙酰化就得到了目标产物氯霉素，合成路径如下所示：

优选地，酶反应过程中，添加磷酸吡哆醛作为辅酶。

优选地，酶反应在磷酸缓冲液中进行。

优选地，酶反应结束后，氨基酸中间体无需纯化直接进行还原反应。

进一步的，本发明发现，转醛酶催化制备(2S,3R)-对硝基苯丝氨酸的过程中,体系会释放出一分子乙醛，随着反应的进行，乙醛量的累积会导致转醛酶的失活，从而使得转醛酶的用量比较大，并且反应的转化率较低。

本发明进一步优选，在酶反应过程中添加乙醛还原酶使乙醛还原为乙醇；

进一步的，本发明所述的乙醛还原为乙醇的体系为辅酶烟酰胺腺嘌呤双核苷酸(NAD)的再生体系，反应流程如下：。

优选的，添加葡萄糖和葡萄糖脱氢酶实现辅酶NAD的再生：

优选的，添加甲酸和甲酸脱氢酶实现辅酶NAD的再生：

优选的，添加异丙醇和醇脱氢酶实现辅酶NAD的再生。再生过程如下所示：

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。

实施例1：转醛酶催化制备氨基酸

在500mL反应瓶中依次加入10g对硝基苯甲醛，10g L-苏氨酸，40mg磷酸吡哆醛，300mL 100mM磷酸缓冲液(pH7.5)加热至30℃磁力搅拌均匀，加入1g转醛酶酶粉(购自苏州引航生物科技有限公司，商品编号为YH1062，此处仅给出其中一种型号的产品予以阐述本发明的效果)，开始搅拌反应，20小时后取样HPLC检测转化率90％以上。反应结束，过滤,收集白色固体，白色固体产物用乙醇重结晶，得到产品9.4克，ee>99％，dr>99:1。。

实施例2：

在250mL反应瓶中加入100mM磷酸缓冲液(pH＝7.5)100g，在搅拌下加入10g对硝基苯甲醛、10g L-苏氨酸以及葡萄糖12g，体系搅拌10分钟。用3M氢氧化钠调节体系PH＝7.5，控制体系温度至35℃搅拌均匀，在搅拌下依次加入20mg磷酸吡哆醛、20mg烟酰胺腺嘌呤双核苷酸、0.5g转醛酶酶粉(购自苏州引航生物科技有限公司，商品编号为YH1062)，0.5g乙醛还原酶酶粉(购自苏州引航生物科技有限公司，商品编号为YH2012)和0.5g葡萄糖脱氢酶酶粉(购自苏州引航生物科技有限公司，商品编号为YH1901)，开始搅拌反应，在反应过程中用3M的NaOH调节体系的PH保持在7.5。20小时后取样HPLC检测，转化率98％以上。反应结束，过滤,收集白色固体，白色固体产物用乙醇重结晶，得到产品12.3克，ee>99％，dr>99:1。

实施例3：

在250mL反应瓶中加入100mM磷酸缓冲液(pH＝7.5)100g，在搅拌下加入10g对硝基苯甲醛、10g L-苏氨酸以及10g异丙醇，体系搅拌10分钟。用3M氢氧化钠调节体系PH＝7.5，控制体系温度至35℃搅拌均匀，在搅拌下依次加入20mg磷酸吡哆醛、20mg烟酰胺腺嘌呤双核苷酸、0.5g转醛酶酶粉(购自苏州引航生物科技有限公司，商品编号为YH1062)，0.5g乙醛还原酶酶粉(购自苏州引航生物科技有限公司，商品编号为YH2012)和0.5g醇脱氢酶酶粉(购自苏州引航生物科技有限公司，商品编号为YH2023)，开始搅拌反应，20小时后取样HPLC检测，转化率99％以上。反应结束，过滤,收集白色固体，白色固体产物用乙醇重结晶，得到产品13.4克，ee>99％，dr>99:1。

实施例4：

在250mL反应瓶中加入100mM磷酸缓冲液(pH＝7.5)100g，在搅拌下加入10g对甲砜基苯甲醛、10g L-苏氨酸以及甲酸10g，体系搅拌10分钟。用3M氢氧化钠调节体系PH＝7.5，控制体系温度至35℃搅拌均匀，在搅拌下依次加入20mg磷酸吡哆醛、20mg烟酰胺腺嘌呤双核苷酸、1g转醛酶酶粉(购自苏州引航生物科技有限公司，商品编号为YH1062)，1g乙醛还原酶酶粉(购自苏州引航生物科技有限公司，商品编号为YH2012)和1g甲酸脱氢酶酶粉(购自苏州引航生物科技有限公司，商品编号为YH1805)，开始搅拌反应，20小时后取样HPLC检测，转化率99％以上。反应结束，过滤,收集白色固体，白色固体产物用乙醇重结晶，得到产品11.8克，ee>99％，dr>99:1。

实施例5：氨基酸的还原

在氮气保护下，向1升的三口瓶中加入上述制备好的氨基酸22.6克，500毫升四氢呋喃，以及9.8克硼氢化钠(分批加)。加料完毕，体系冷却至0度，将浓硫酸12.5克(溶解在20毫升四氢呋喃中)缓慢滴加至反应体系。滴加完毕，体系升至室温反应三小时。反应完毕，用4N的盐酸淬灭，用氯仿洗去有机物，收集水相。用液碱将水相的PH调节至10，大量白色固体析出，过滤，收集固体，烘干即的相应的氨基醇粗品产品。粗品用甲醇结晶，得到纯品氨基醇17.4克。

实施例6：二氯乙酰化反应

在装有搅拌器、回流冷凝器、温度计的100mL三颈瓶中，加入实施例5所得的D-氨基物4.5g，甲醇10mL和二氯乙酸甲酯3mL。在60～65℃搅拌反应1h，随后加入活性炭0.2g，保温脱色3min，趁热过滤，向滤液中滴加蒸馏水(每分钟约1mL的速度滴加)至有少量结晶析出时停止加水，稍停片刻，继续加入剩余蒸馏水(共33mL)。冷至室温，放置30min，抽滤，滤饼用4mL蒸馏水洗涤，抽干，105℃干燥，即得6.2克氯霉素纯品。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种制备氯霉素的方法，其特征在于，对硝基苯甲醛和L-苏氨酸在转醛酶的作用下制得(2S,3R)-对硝基苯丝氨酸，此氨基酸中间体再进行还原、二氯乙酰化得到氯霉素，酶反应过程中，添加磷酸吡哆醛作为辅酶。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在酶反应过程中添加乙醛还原酶使酶反应产生的乙醛还原为乙醇。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的乙醛还原为乙醇的体系以烟酰胺腺嘌呤双核苷酸作为辅酶。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，添加葡萄糖以及葡萄糖脱氢酶实现辅酶烟酰胺腺嘌呤双核苷酸的再生。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，添加异丙醇和醇脱氢酶实现辅酶烟酰胺腺嘌呤双核苷酸的再生。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，添加甲酸和甲酸脱氢酶实现辅酶烟酰胺腺嘌呤双核苷酸的再生。

7.如权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述酶反应在磷酸缓冲液中进行。

8.如权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述还原反应的还原剂选自：硼氢化钠、硼氢化钾、氢化锂铝。

9.如权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述氨基酸中间体无需纯化直接进行还原反应。