CN104531820B - 一种以富马酸为原料多酶偶联制备dl-丙氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种以富马酸为原料多酶偶联制备DL‑丙氨酸的方法。该制备方法以富马酸为原料，将分别含有天冬氨酸酶、天冬氨酸‑β‑脱羧酶和丙氨酸消旋酶的菌体细胞或该三种酶的粗酶液与一定浓度的富马酸铵水溶液混合，在25℃～55℃，pH 6～8进行酶促反应，利用等电点结晶或等电点结晶与离子交换树脂相结合的方法分离转化产物，得到高纯度的DL‑丙氨酸。该方法采用多酶偶联生物转化技术高效制备DL‑丙氨酸，具有原料来源广、生产工艺操作简便、酶促转化时间短和生产成本低等优点。
Description
一、技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种以富马酸为原料多酶偶联制备DL-丙氨酸的方法。
二、背景技术
DL-丙氨酸是人体的非必需氨基酸之一，可用于医药、食品、化妆品和饲料添加剂等领域，具有非常广泛的应用。
目前根据文献报道DL-丙氨酸的制备方法主要有化学合成法、直接发酵法和生物酶法。
1、化学合成法
化学合成法有Strecker法、Buchere法、α-卤代羧酸氨化法、相转移催化合成法和L-丙氨酸化学消旋法。其中Strecker和Buchere法原料价格便宜，但中间产物水解后分离比较困难，特别是DL-丙氨酸与副产物分离比较复杂，氰化物的运输和管理难度大，国内外未见报道采用该工艺大规模生产DL-丙氨酸的企业。
Kendall E C等(Organic Synthesis,1929,9:4)以乙醛为原料，加入氰化氢得氰醇，加入氨溶液反应生成氨基腈，再加碱水解得到丙氨酸的钠盐，经离子交换树脂处理得到DL-丙氨酸。
贾京潭(CN 1887857A)以L-丙氨酸为原料，以冰醋酸为溶剂加热至80～110℃溶解，维持温度95～100℃得DL-丙氨酸的粗品液，经分离制得DL-丙氨酸。
2、直接发酵法
直接发酵法生产DL-丙氨酸所用原材料为葡萄糖，根据目前已报道的发酵水平来看，糖酸转化效率较低，发酵液组成复杂提取成本高。该法的生产成本远高于化学合成法，目前国内未见有发酵法大规模工业生产DL-丙氨酸的报道。
张克旭(化学工业出版社,1992,723-725)利用胶状棒杆菌No.7183在含有葡萄糖、酵母膏、玉米浆、尿素、磷酸二氢钾和硫酸镁成分的培养基中发酵生产DL-丙氨酸，DL-丙氨酸发酵产酸率40g/L。
李良铸(化学工业出版社,2006,116-118)利用嗜氨小杆菌的精氨酸氧肟酸抗性菌株，在含有硫酸锌的葡萄糖培养基中发酵生产DL-丙氨酸，DL-丙氨酸发酵产酸率60g/L。
3、生物酶法
生物酶法生产工艺是以L-丙氨酸为原料、丙氨酸消旋酶为催化剂的一步生化反应，其设备简单、反应条件温和、酶活力高、反应速度快、具有专一性强的特点。酶法生产DL-丙氨酸已成为近年来人们关注和研究的方向。
黄建坡(CN 101575624A)以微生物湿菌体或粗酶液为酶源，以L-丙氨酸为底物，于20～40℃酶促转化，转化至旋光为零后0.5～2h停止反应，得到含DL-丙氨酸的反应液，经分离提取制得DL-丙氨酸，收率75％。
张晓斌(CN 101580858A)以诱变的大肠杆菌湿菌体或粗酶液为酶源，以L-丙氨酸为底物，于37～40℃酶促转化，转化时间12h左右，得到含DL-丙氨酸的反应液，经分离提取制得DL-丙氨酸，其中L-丙氨酸转化率96％以上。
Junlin Liu等(World J Microbiol Biotechnol 2012,28:267–274)以L-丙氨酸为底物，以丙氨酸消旋酶基因工程菌(pET-32a-Alr/BL21)酶法合成了DL-丙氨酸。
三、发明内容
本发明需要解决的问题是提供一种高效、低成本的以富马酸为原料直接制备DL-丙氨酸的方法。
本发明以富马酸为原料，以天冬氨酸酶、天冬氨酸-β-脱羧酶和丙氨酸消旋酶复合酶为生物催化剂多酶偶联制备DL-丙氨酸。
本发明可以通过以下技术方案来达到：
一种以富马酸为原料多酶偶联转化制备DL-丙氨酸的方法，其步骤为：
(1)将分别具有天冬氨酸酶、天冬氨酸-β-脱羧酶和丙氨酸消旋酶活性的菌株在培养基中培养，产生高活性的天冬氨酸酶、天冬氨酸-β-脱羧酶和丙氨酸消旋酶；
(2)将分别具有天冬氨酸酶、天冬氨酸-β-脱羧酶和丙氨酸消旋酶活性的湿菌体或粗酶液与一定浓度的富马酸铵水溶液混合，再加入适量的磷酸吡哆醛、表面活性剂，在25～55℃，pH 6～8条件下进行酶促反应，利用等电点结晶或等电点结晶与离子交换树脂相结合的方法分离制备反应生成的DL-丙氨酸。
上述步骤(1)中的培养基碳源采用葡萄糖或麦芽糖或蔗糖或果糖，培养基中总碳源质量浓度为1～30g/L；氮源采用牛肉膏或酵母膏或玉米浆或蛋白胨或豆饼水解液，培养基中总氮源质量浓度为1～30g/L；天冬氨酸酶来源于大肠杆菌Escherichia coli，天冬氨酸-β-脱羧酶来源于徳阿昆哈假单胞菌Pseudomonas dacunhae，丙氨酸消旋酶来源于谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum；大肠杆菌Escherichia coli和谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心，徳阿昆哈假单胞菌Pseudomonas dacunhae购买于上海工微所科技有限公司。
上述步骤(2)中富马酸铵水溶液的质量浓度为50～300g/L，加入的磷酸吡哆醛(PLP)质量浓度为0.01～1.0g/L，加入的表面活性剂为吐温-80或十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)或TritonX 100，其质量浓度为0.01～1.0g/L。
目前，我国DL-丙氨酸主要生产技术是采用具有丙氨酸消旋酶活性的微生物为催化剂，以L-丙氨酸为原料酶法消旋制备DL-丙氨酸，该法生产工艺简单、技术成熟，但是其生产成本远高于直接利用富马酸为原料的新工艺。本发明以富马酸为底物，以天冬氨酸酶、天冬氨酸-β-脱羧酶和丙氨酸消旋酶多酶偶联的方法制备DL-丙氨酸，省去了中间产物L-天冬氨酸和L-丙氨酸的分离提取步骤，协调酶催化反应条件，使多酶催化反应同时进行，缩短了反应时间，降低了生产成本，提高了生产效率。本发明所述以富马酸为原料多酶偶联制备DL-丙氨酸的方法，由以下步骤构成：
(1)将具有天冬氨酸酶活性的大肠杆菌Escherichia coli、具有天冬氨酸-β-脱羧酶活性的徳阿昆哈假单胞菌Pseudomonas dacunhae和具有丙氨酸消旋酶活性的谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum分别在培养基中培养，产生高活性的天冬氨酸酶、天冬氨酸-β-脱羧酶和丙氨酸消旋酶；
(2)培养基碳源采用葡萄糖或麦芽糖或蔗糖或果糖，培养基中总碳源质量浓度为1～30g/L；氮源采用牛肉膏或酵母膏或玉米浆或蛋白胨或豆饼水解液，培养基中总氮源质量浓度为1～30g/L；
(3)将分别具有天冬氨酸酶、天冬氨酸-β-脱羧酶和丙氨酸消旋酶活性的湿菌体或粗酶液与质量浓度为50～300g/L的富马酸铵水溶液混合，再加入质量浓度为0.01～1.0g/L的磷酸吡哆醛、质量浓度为0.01～1.0g/L的吐温或十六烷基三甲基溴化铵或TritonX 100，在25～55℃，pH 6～8条件下进行酶促反应，利用等电点结晶或等电点结晶与离子交换树脂相结合的方法分离制备反应生成的DL-丙氨酸。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
(1)本发明采用的大肠杆菌Escherichia coli、徳阿昆哈假单胞菌Pseudomonasdacunhae和谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum，在优选的培养基中可以分别高效表达天冬氨酸酶、天冬氨酸-β-脱羧酶和丙氨酸消旋酶，使多酶偶联催化制备DL-丙氨酸有较高的反应速率和转化率，其中富马酸摩尔转化率达到95％以上，L-丙氨酸消旋效率达100％。
(2)本发明利用来源广泛、成本低廉的富马酸为原料，多酶偶联生物转化工艺减少设备投资、提高生产效率、大幅度降低生产成本，具有很好的经济效益和社会效益。
(3)本发明制备DL-丙氨酸的方法底物转化完全，产物分离简单。
(4)多酶偶联酶法合成DL-丙氨酸具有反应条件温和，酶立体选择性强，催化效率高，工艺流程简单等优点，适合工业化生产。
四、具体实施方式
以下实施例仅用于对本发明进行具体说明，但本发明的保护范围并不仅限于以下实施例。
实施例一
1、取具有天冬氨酸酶活性的大肠杆菌湿菌体0.5g，具有天冬氨酸-β-脱羧酶活性的Pseudomonas dacunhae湿菌体5g和具有丙氨酸消旋酶活性的Corynebacteriumglutamicum湿菌体10g，加入到1000ml转化液中，转化液中含50g/L富马酸、0.01g/L磷酸吡哆醛和0.01g/L吐温80，pH 6.0，25℃酶促反应10h，反应液旋光为零。反应结束后转化液中DL-丙氨酸浓度为36.4g/L，对富马酸的摩尔转化率为95％。
2、将转化液4000r/min离心15min去除菌体，上清液升温到70～80℃，加入活性炭脱色，脱色液经过超滤和纳滤净化处理，净化液真空浓缩至80ml，冷却结晶到室温，抽滤、烘干得固体DL-丙氨酸22g。
3、将结晶母液稀释后通过732型阳离子交换树脂柱分离，用3％氨水洗脱DL-丙氨酸饱和吸附柱，收集含DL-丙氨酸的洗脱液200ml，活性炭脱色后真空浓缩至50ml，趁热加入二倍体积95％乙醇，室温冷却结晶，抽滤、烘干得固体DL-丙氨酸10.2g，结晶母液回收乙醇后循环套用。两次结晶共得DL-丙氨酸32.2g，收率88.5％。
实施例二
1、取具有天冬氨酸酶活性的大肠杆菌湿菌体0.5g，具有天冬氨酸-β-脱羧酶活性的Pseudomonas dacunhae湿菌体10g和具有丙氨酸消旋酶活性的Corynebacteriumglutamicum湿菌体10g，加入到1000ml转化液中，转化液中含100g/L富马酸、0.1g/L磷酸吡哆醛和0.1g/L TritonX 100，pH 7.0，40℃酶促反应18h，反应液旋光为零。反应结束后转化液中DL-丙氨酸浓度为73.6g/L，对富马酸摩尔转化率为96％。
2、将转化液4000r/min离心15min去除菌体，上清液升温到70～80℃，加入活性炭脱色，脱色液经过超滤和纳滤净化处理，净化液真空浓缩至150ml，冷却结晶到室温，抽滤、烘干得固体DL-丙氨酸46g。
3、将结晶母液稀释后通过732型阳离子交换树脂柱分离，用3％氨水洗脱DL-丙氨酸饱和吸附柱，收集含DL-丙氨酸的洗脱液300ml，活性炭脱色后真空浓缩至100ml，趁热加入二倍体积95％乙醇，室温冷却结晶，抽滤、烘干得固体DL-丙氨酸19.5g，结晶母液回收乙醇后循环套用。两次结晶共得DL-丙氨酸65.5g，收率89％。
实施例三
1、取具有天冬氨酸酶活性的大肠杆菌湿菌体1.0g，具有天冬氨酸-β-脱羧酶活性的Pseudomonas dacunhae湿菌体15g和具有丙氨酸消旋酶活性的Corynebacteriumglutamicum湿菌体15g，加入到1000ml转化液中，转化液中含300g/L富马酸、0.5g/L磷酸吡哆醛和0.5g/L CTAB，pH 8.0，45℃酶促反应30h，反应液旋光为零。反应结束后转化液中DL-丙氨酸浓度为218.6g/L，对富马酸摩尔转化率为95％。
2、将转化液4000r/min离心15min去除菌体，上清液升温到70～80℃，加入活性炭脱色，脱色液经过超滤和纳滤净化处理，净化液真空浓缩至400ml，冷却结晶到室温，抽滤、烘干得DL-丙氨酸136.6g。
3、将结晶母液稀释后通过732型阳离子交换树脂柱分离，用3％氨水洗脱DL-丙氨酸饱和吸附柱，收集含DL-丙氨酸的洗脱液800ml，活性炭脱色后真空浓缩至270ml，趁热加入二倍体积95％乙醇，室温冷却结晶，抽滤、烘干得固体DL-丙氨酸62.2g，结晶母液回收乙醇后循环套用。两次结晶共得DL-丙氨酸198.8g，收率91％。
实施例四
1、取具有天冬氨酸酶活性的大肠杆菌湿菌体0.7g，具有天冬氨酸-β-脱羧酶活性的Pseudomonas dacunhae湿菌体10g和具有丙氨酸消旋酶活性的Corynebacteriumglutamicum湿菌体10g，加入到1000ml转化液中，转化液中含200g/L富马酸、0.2g/L磷酸吡哆醛和0.2g/L TritonX 100，pH 6.0，40℃酶促反应24h，反应液旋光为零。反应结束后转化液中DL-丙氨酸浓度为147.3g/L，对富马酸摩尔转化率为96％。
2、将转化液4000r/min离心15min去除菌体，上清液升温到70～80℃，加入活性炭脱色，脱色液经过超滤和纳滤净化处理，净化液真空浓缩至280ml，冷却结晶到室温，抽滤、烘干得固体DL-丙氨酸100.5g。
3、将结晶母液稀释后通过732型阳离子交换树脂柱分离，用3％氨水洗脱DL-丙氨酸饱和吸附柱，收集含DL-丙氨酸的洗脱液700ml，活性炭脱色后真空浓缩至180ml，趁热加入二倍体积95％乙醇，室温冷却结晶，抽滤、烘干得固体DL-丙氨酸31.5g，结晶母液回收乙醇后循环套用。两次结晶共得DL-丙氨酸132g，收率89.6％。
实施例五
1、取具有天冬氨酸酶活性的大肠杆菌湿菌体0.7g，具有天冬氨酸-β-脱羧酶活性的Pseudomonas dacunhae湿菌体10g和具有丙氨酸消旋酶活性的Corynebacteriumglutamicum湿菌体10g，加入到1000ml转化液中，转化液中含150g/L富马酸、0.1g/L磷酸吡哆醛和0.2g/L CTAB，pH 7.0，55℃酶促反应20h，反应液旋光为零。反应结束后转化液中DL-丙氨酸浓度为109.4g/L，对富马酸摩尔转化率为95％。
2、将转化液4000r/min离心15min去除菌体，上清液升温到70～80℃，加入活性炭脱色，脱色液经过超滤和纳滤净化处理，净化液真空浓缩至200ml，冷却结晶到室温，抽滤、烘干得固体DL-丙氨酸73g。
3、将结晶母液稀释后通过732型阳离子交换树脂柱分离，用3％氨水洗脱DL-丙氨酸饱和吸附柱，收集含DL-丙氨酸的洗脱液500ml，活性炭脱色后真空浓缩至150ml，趁热加入二倍体积95％乙醇，室温冷却结晶，抽滤、烘干得固体DL-丙氨酸24.4g，结晶母液回收乙醇后循环套用。两次结晶共得DL-丙氨酸97.4g，收率89％。
实施例六
1、取具有天冬氨酸酶活性的大肠杆菌湿菌体0.7g，具有天冬氨酸-β-脱羧酶活性的Pseudomonas dacunhae湿菌体10g和具有丙氨酸消旋酶活性的Corynebacteriumglutamicum湿菌体10g，加入到1000ml转化液中，转化液中含300g/L富马酸、0.1g/L磷酸吡哆醛和0.1g/L吐温80，pH 6.0，40℃酶促反应35h，反应液旋光为零。反应结束后转化液中DL-丙氨酸浓度为221g/L，对富马酸摩尔转化率为96％。
2、将转化液4000r/min离心15min去除菌体，上清液升温到70～80℃，加入活性炭脱色，脱色液经过超滤和纳滤净化处理，净化液真空浓缩至400ml，冷却结晶到室温，抽滤、烘干得DL-丙氨酸144g。
3、将结晶母液稀释后通过732型阳离子交换树脂柱分离，用3％氨水洗脱DL-丙氨酸饱和吸附柱，收集含DL-丙氨酸的洗脱液800ml，活性炭脱色后真空浓缩至300ml，趁热加入二倍体积95％乙醇，室温冷却结晶，抽滤、烘干得固体DL-丙氨酸58.4g，结晶母液回收乙醇后循环套用。两次结晶共得DL-丙氨酸202.4g，收率91.6％。
实施例七
1、取具有天冬氨酸酶活性的大肠杆菌湿菌体1.0g，具有天冬氨酸-β-脱羧酶活性的Pseudomonas dacunhae湿菌体15g和具有丙氨酸消旋酶活性的Corynebacteriumglutamicum湿菌体10g，加入到1000ml转化液中，转化液中含250g/L富马酸、0.5g/L磷酸吡哆醛和0.5g/L CTAB，pH 7.0，42℃酶促反应36h，反应液旋光为零。反应结束后转化液中DL-丙氨酸浓度为182.3g/L，对富马酸摩尔转化率为95％。
2、将转化液4000r/min离心15min去除菌体，上清液升温到70～80℃，加入活性炭脱色，脱色液经过超滤和纳滤净化处理，净化液真空浓缩至350ml，冷却结晶到室温，抽滤、烘干得固体DL-丙氨酸121g。
3、结晶母液经过活性炭脱色，真空浓缩至100ml，趁热加入二倍体积95％乙醇，室温冷却结晶，抽滤、烘干得固体DL-丙氨酸43.4g，结晶母液回收乙醇后循环套用。两次结晶共得DL-丙氨酸164.4g，收率90.2％。
Claims (4)
1.一种以富马酸为原料多酶偶联制备DL-丙氨酸的方法，其特征是该方法为：
(1)将具有天冬氨酸酶活性的大肠杆菌Escherichia coli、具有天冬氨酸-β-脱羧酶活性的徳阿昆哈假单胞菌Pseudomonas dacunhae和具有丙氨酸消旋酶活性的谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum分别在培养基中培养，产生高酶活天冬氨酸酶、天冬氨酸-β-脱羧酶和丙氨酸消旋酶；培养基碳源采用葡萄糖或麦芽糖或蔗糖或果糖，培养基中总碳源质量浓度为1～30g/L，氮源采用牛肉膏或酵母膏或玉米浆或蛋白胨或豆饼水解液，培养基中总氮源质量浓度为1～30g/L；
(2)取具有天冬氨酸酶活性的大肠杆菌湿菌体0.7g，具有天冬氨酸-β-脱羧酶活性的徳阿昆哈假单胞菌湿菌体10g和具有丙氨酸消旋酶活性的谷氨酸棒杆菌湿菌体10g，加入到1000mL转化液中，转化液中含200g/L富马酸、0.2g/L磷酸吡哆醛和0.2g/L TritonX-100，pH6.0，40℃酶促反应24h，反应液旋光为0， 反应结束后转化液中DL-丙氨酸浓度为147.3g/L，对富马酸摩尔转化率为96％；
(3)将转化液4000r/min离心15min去除菌体，上清液升温到70～80℃，加入活性炭脱色，脱色液经过超滤和纳滤净化处理，净化液真空浓缩至280mL，冷却结晶到室温，抽滤、烘干得固体DL-丙氨酸100.5g；
(4)将结晶母液稀释后通过732型阳离子交换树脂柱分离，用3％氨水洗脱DL-丙氨酸饱和吸附柱，收集含DL-丙氨酸的洗脱液700mL，活性炭脱色后真空浓缩至180mL，趁热加入二倍体积95％乙醇，室温冷却结晶，抽滤、烘干得固体DL-丙氨酸31.5g，结晶母液回收乙醇后循环套用， 两次结晶共得DL-丙氨酸132g，收率89.6％。
2.一种以富马酸为原料多酶偶联制备DL-丙氨酸的方法，其特征是该方法为：
(1)将具有天冬氨酸酶活性的大肠杆菌、具有天冬氨酸-β-脱羧酶活性的徳阿昆哈假单胞菌和具有丙氨酸消旋酶活性的谷氨酸棒杆菌分别在培养基中培养，产生高酶活天冬氨酸酶、天冬氨酸-β-脱羧酶和丙氨酸消旋酶；培养基碳源采用葡萄糖或麦芽糖或蔗糖或果糖，培养基中总碳源质量浓度为1～30g/L，氮源采用牛肉膏或酵母膏或玉米浆或蛋白胨或豆饼水解液，培养基中总氮源质量浓度为1～30g/L；
(2)取具有天冬氨酸酶活性的大肠杆菌湿菌体0.7g，具有天冬氨酸-β-脱羧酶活性的徳阿昆哈假单胞菌湿菌体10g和具有丙氨酸消旋酶活性的谷氨酸棒杆菌湿菌体10g，加入到1000mL转化液中，转化液中含150g/L富马酸、0.1g/L磷酸吡哆醛和0.2g/L CTAB，pH 7.0，55℃酶促反应20h，反应液旋光为0，反应结束后转化液中DL-丙氨酸浓度为109.4g/L，对富马酸摩尔转化率为95％；
(3)将转化液4000r/min离心15min去除菌体，上清液升温到70～80℃，加入活性炭脱色，脱色液经过超滤和纳滤净化处理，净化液真空浓缩至200mL，冷却结晶到室温，抽滤、烘干得固体DL-丙氨酸73g；
(4)将结晶母液稀释后通过732型阳离子交换树脂柱分离，用3％氨水洗脱DL-丙氨酸饱和吸附柱，收集含DL-丙氨酸的洗脱液500mL，活性炭脱色后真空浓缩至150mL，趁热加入二倍体积95％乙醇，室温冷却结晶，抽滤、烘干得固体DL-丙氨酸24.4g，结晶母液回收乙醇后循环套用，两次结晶共得DL-丙氨酸97.4g，收率89％。
3.一种以富马酸为原料多酶偶联制备DL-丙氨酸的方法，其特征是该方法为：
(1)将具有天冬氨酸酶活性的大肠杆菌、具有天冬氨酸-β-脱羧酶活性的徳阿昆哈假单胞菌和具有丙氨酸消旋酶活性的谷氨酸棒杆菌分别在培养基中培养，产生高酶活天冬氨酸酶、天冬氨酸-β-脱羧酶和丙氨酸消旋酶；培养基碳源采用葡萄糖或麦芽糖或蔗糖或果糖，培养基中总碳源质量浓度为1～30g/L，氮源采用牛肉膏或酵母膏或玉米浆或蛋白胨或豆饼水解液，培养基中总氮源质量浓度为1～30g/L；
(2)取具有天冬氨酸酶活性的大肠杆菌湿菌体0.7g，具有天冬氨酸-β-脱羧酶活性的徳阿昆哈假单胞菌湿菌体10g和具有丙氨酸消旋酶活性的谷氨酸棒杆菌湿菌体10g，加入到1000mL转化液中，转化液中含300g/L富马酸、0.1g/L磷酸吡哆醛和0.1g/L吐温80，pH 6.0，40℃酶促反应35h，反应液旋光为0，反应结束后转化液中DL-丙氨酸浓度为221g/L，对富马酸摩尔转化率为96％；
(3)将转化液4000r/min离心15min去除菌体，上清液升温到70～80℃，加入活性炭脱色，脱色液经过超滤和纳滤净化处理，净化液真空浓缩至400mL，冷却结晶到室温，抽滤、烘干得DL-丙氨酸144g；
(4)将结晶母液稀释后通过732型阳离子交换树脂柱分离，用3％氨水洗脱DL-丙氨酸饱和吸附柱，收集含DL-丙氨酸的洗脱液800mL，活性炭脱色后真空浓缩至300mL，趁热加入二倍体积95％乙醇，室温冷却结晶，抽滤、烘干得固体DL-丙氨酸58.4g，结晶母液回收乙醇后循环套用， 两次结晶共得DL-丙氨酸202.4g，收率91.6％。
4.一种以富马酸为原料多酶偶联制备DL-丙氨酸的方法，其特征是该方法为：
(1)将具有天冬氨酸酶活性的大肠杆菌、具有天冬氨酸-β-脱羧酶活性的徳阿昆哈假单胞菌和具有丙氨酸消旋酶活性的谷氨酸棒杆菌分别在培养基中培养，产生高酶活天冬氨酸酶、天冬氨酸-β-脱羧酶和丙氨酸消旋酶；培养基碳源采用葡萄糖或麦芽糖或蔗糖或果糖，培养基中总碳源质量浓度为1～30g/L，氮源采用牛肉膏或酵母膏或玉米浆或蛋白胨或豆饼水解液，培养基中总氮源质量浓度为1～30g/L；
(2)取具有天冬氨酸酶活性的大肠杆菌湿菌体1.0g，具有天冬氨酸-β-脱羧酶活性的徳阿昆哈假单胞菌湿菌体15g和具有丙氨酸消旋酶活性的谷氨酸棒杆菌湿菌体10g，加入到1000mL转化液中，转化液中含250g/L富马酸、0.5g/L磷酸吡哆醛和0.5g/L CTAB，pH 7.0，42℃酶促反应36h，反应液旋光为0，反应结束后转化液中DL-丙氨酸浓度为182.3g/L，对富马酸摩尔转化率为95％；
(3)将转化液4000r/min离心15min去除菌体，上清液升温到70～80℃，加入活性炭脱色，脱色液经过超滤和纳滤净化处理，净化液真空浓缩至350mL，冷却结晶到室温，抽滤、烘干得固体DL-丙氨酸121g；
(4)结晶母液经过活性炭脱色，真空浓缩至100mL，趁热加入二倍体积95％乙醇，室温冷却结晶，抽滤、烘干得固体DL-丙氨酸43.4g，结晶母液回收乙醇后循环套用， 两次结晶共得DL-丙氨酸164.4g，收率90.2％。
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| DL-丙氨酸生产工艺的研究进展;蒋光玉;《精细与专用化学品》;20110731;第19卷(第7期);第26-27页2.3部分、3部分 * |
| 固定化德阿昆哈假单胞菌生产L-丙氨酸的研究;吴薇;《中国优秀硕士学位论文全文数据库》;20020215;第基础科学辑卷(第A006-135期);摘要、2.2.1部分、结论部分 * |
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