CN103224972B - L-酪氨酸酶法转化制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种L-酪氨酸酶法转化制备方法。所述方法的步骤为：1、将有丝氨酸脱氨酶活性和酪氨酸酚裂解酶活性的菌株分别在培养基中培养备用；2、将所述两种细胞与含L-丝氨酸的氨基酸料液混合，加入500g/L的苯酚水溶液，以及浓度为0.2g/L磷酸吡哆醛和浓度为0.01-1.0g/L的表面活性剂，在25～55℃，用体积百分比为25%的氨水调节pH值为6～11的条件下酶促反应6-35小时；3、将转化液在4000转/分钟离心15分钟，收集混合物，用200-7000ml纯水溶解混合物，滴加10mol/L的氢氧化钠调节pH值至12-13，搅拌升温至80℃，滤液用6mol/L的盐酸调节pH值至6，烘干后获得所需的L-酪氨酸。
Description
技术领域
本发明涉及到生物技术领域，特别涉及到一种L-酪氨酸酶法转化制备方法。
背景技术
L-酪氨酸是一种芳香族氨基酸，是动物体内合成蛋白质所需要的重要氨基酸之一，其所带的氨基和羧基具有重要的生理功能。在医药领域，L-酪氨酸是合成甲状腺素、多巴、肾上腺的前体；在食品领域，L-酪氨酸是一种重要的添加剂；临床上，L-酪氨酸还用于生殖避孕疗效研究。根据目前文献报道，L-酪氨酸的制备方法主要有提取法、化学合成法、发酵法和酶转化法。
1、提取法
提取法生产L-酪氨酸是利用天然蛋白资源如人发、猪毛、羽毛、猪血粉等为原料，经过水解、提取、精制等步骤分离制得L-酪氨酸。
陈士安（CN 101823975 A）公开了一种以禽类羽毛为原料工业化生产L-酪氨酸的方法。该方法以废弃禽类羽毛为主要原料，用盐酸水解禽类羽毛中蛋白质，再经分离提取得到L-酪氨酸产品，使禽类加工增值提高。由于蛋白原料水解液中含有多种氨基酸，其中L-胱氨酸和L-酪氨酸的等电点和溶解度极其相近，从L-酪氨酸和L-胱氨酸的混合物中分离出高纯度的L-酪氨酸非常困难。王先兵（CN 101182297 B）公开了从生产L-胱氨酸的排放液中进一步回收L-酪氨酸的方法。该方法将蛋白质水解法生产L-胱氨酸的精制排放液调酸，活性炭吸附L-酪氨酸，再经碱水洗脱、浓酸中和分离出L-酪氨酸粗品，精制后得到L-酪氨酸精品，产品收率95%以上。该方法分离效率高、产品纯度高、工艺简单。由于天然蛋白资源中L-酪氨酸含量较少，因此提取法效率较低。近年来随着人们环保意识的增强或宗教信仰等原因，一些西方国家禁用从动物毛发水解提取的L-酪氨酸，因此发展新的制备L-酪氨酸的方法具有重要意义。
2、化学合成法
化学合成法是通过L-苯丙氨酸羟基化或由对羟基苯甲醛与海因缩合、碱解、转氨等步骤合成。化学合成法不仅步骤较多，而且得到的产物通常为外消旋体，需经拆分才能得到具有生理活性的L-酪氨酸。3、发酵法
发酵法生产L-酪氨酸是利用经常规诱变处理的短杆菌或棒杆菌，通过发酵过程生产L-酪氨酸。该工艺控制过程复杂，既要适合微生物自身生长繁殖，又要利于微生物代谢积累，因此产酸率较低。专利（ZL 96197716.7，CN 101627110A）报道了将具有产生L-氨基酸能力的微生物或基因修饰过的微生物在培养基中培养，发酵产生L-氨基酸。其中包括L-酪氨酸产生菌，但没提及具体产酸效率。
4、酶转化法
酶法转化因具有专一性强、反应条件温和、反应周期短、分离提纯容易等优点而日益受到重视，是廉价生产L-酪氨酸的有效方法。吴敏，等（化学世界, 2002, 43(9): 476-478）以对羟基苯甲醛、海因、氢氧化钠为原料化学合成了对羟基苯丙酮酸，再利用大肠杆菌天冬氨酸转氨酶将天冬氨酸的氨基转移至对羟基苯丙酮酸上制得L-酪氨酸，转化率75%。ENEI Hitoshi，等（Agr. Biol. Chem., 37(3): 493-499, 1973）以DL-丝氨酸和苯酚为底物，利用Erwinia herbicola ATCC 21434中酪氨酸酚裂解酶酶法合成了L-酪氨酸，100 ml反应体系中得到了5.35 g L-酪氨酸。N. G. Faleev，等（Enzyme Microb Tech, 1980, 2(4): 305-308）利用部分纯化的酪氨酸酚裂解酶以甘氨酸、甲醛和苯酚为底物酶法合成了L-酪氨酸。Matoishi Kaori，等（JP 2006320238）对野生菌Erwinia herbicola和Citrobacter freundii中酪氨酸酚裂解酶点突变，再以L-丝氨酸和苯酚为底物酶法合成了L-酪氨酸，酶活较野生型菌株提高了1.1-1.5倍。Kim Do Young，等（J Microbiol Biotechn, 2007, 17(1): 116-122）在分批补料反应器中流加苯酚、丙酮酸和氨，利用Symbiobacterium toebii来源酪氨酸酚裂解酶催化反应，转化30 h生成130 g/L L-酪氨酸，L-酪氨酸对苯酚的最大转化率94%。
酶法转化主要以苯酚、氨、丙酮酸或L-丝氨酸纯品为底物，以不同来源的酪氨酸酚裂解酶催化合成L-酪氨酸，且丙酮酸比L-丝氨酸更适合做该酶底物。由于生产成本问题，目前以L-丝氨酸或丙酮酸纯品酶法合成L-酪氨酸无明显附加值，故以L-丝氨酸或丙酮酸纯品酶法合成L-酪氨酸无现实意义。
发明内容
本发明的目的在于利用氨基酸工业生产中富含L-丝氨酸的混合氨基酸料液为底物，添加适量的苯酚，以丝氨酸脱氨基酶和酪氨酸酚裂解酶双酶催化合成L-酪氨酸的L-酪氨酸法酶法转化制备方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种L-酪氨酸酶法转化制备方法，所述方法按以下步骤进行：
1、将具有丝氨酸脱氨酶活性和酪氨酸酚裂解酶活性的菌株分别在培养基中培养，产生高酶活丝氨酸脱氨酶和酪氨酸酚裂解酶备用；
2、采用游离细胞法，将丝氨酸脱氨酶细胞和酪氨酸酚裂解酶细胞与含L-丝氨酸的氨基酸料液混合，再加入17-616ml浓度为500g/L的苯酚水溶液，维持溶液中苯酚含量为10g/L，以及浓度为0.2g/L磷酸吡哆醛和浓度为0.01-1.0g/L的表面活性剂，在温度为25～55℃，用体积百分比为25%的氨水调节pH值为 6～11的条件下进行酶促反应，反应时间为6-35小时，反应结束后，转化液中的L-酪氨酸的浓度为16.3-589.6g/L；
3、将步骤2获取的转化液放入离心机，在转速为4000转/分钟离心分离15分钟，收集湿细胞和固体L-酪氨酸混合物，用200-7000ml纯水溶解固体混合物，然后滴加浓度为10mol/L的氢氧化钠调节pH值至12-13，搅拌升温至80℃，将固体混合物完全溶解，加入活性炭脱色除去菌体细胞，将溶液过滤，滤液用浓度为6mol/L的盐酸调节pH值至6，冷却结晶，真空抽滤，用纯水洗涤产品，烘干后获得所需的L-酪氨酸。
步骤1所述的丝氨酸脱氨酶菌株为Escherichia coli K-12，酪氨酸酚裂解酶菌株为Citrobacter freundii ATCC 8090、Citrobacter koseri ATCC BAA-895或Erwinia herbicola ATCC 21434中的任意一种。
步骤2所述的含L-丝氨酸的氨基酸料液来源于角蛋白水解液或蚕丝水解液，氨基酸料液中总氨基酸含量的重量比W∕W为10%～40%，其中L-丝氨酸在总氨基酸含量中的重量比W/W为10%～90%。
步骤2所述的表面活性剂为吐温80、十六烷基三甲基溴化铵或聚乙二醇辛基苯基醚中的任意一种。
本发明的积极效果为：
1、本发明利用丝氨酸脱氨酶先将L-丝氨酸分解成丙酮酸和氨，再以酪氨酸酚裂解酶催化丙酮酸、苯酚和氨合成L-酪氨酸，丙酮酸比L-丝氨酸更适合做酪氨酸酚裂解酶的底物，因此双酶催化比酪氨酸酚裂解酶单酶催化效率更高，实施效果更突出，其中L-丝氨酸摩尔转化率达到95%以上；
2、本发明采用含L-丝氨酸的混合氨基酸料液为原料，充分利用了工业副产物，解决了混合氨基酸料液中L-丝氨酸高效分离的难题，同时也为绿色环保生产L-酪氨酸提供了新途径，具有良好的经济和社会效益；
3、使用该方法酶促反应生成的L-酪氨酸和混合氨基酸料液中其它氨基酸理化性质有较大差异，用等电点结晶法即可实现分离；
4、该酶法合成的L-酪氨酸具有反应条件温和，酶立体选择性强，催化效率高，成本低，工艺流程简单等优点，适合工业化生产。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的具体实施方式。
实施例一
含L-丝氨酸的氨基酸料液来源于角蛋白水解液。
1、取Escherichia coli K-12湿菌体10 g和Citrobacter freundii ATCC 8090湿菌体15 g加入到1000 ml含90g/L的L-丝氨酸的混合氨基酸料液中（料液中总氨基酸的含量为10%），添加0.2 g磷酸吡哆醛和0.01g吐温80，流加154 ml 浓度为500 g/L苯酚水溶液，维持转化液中苯酚含量10 g/L，用体积百分比浓度为25%的氨水控制转化液pH值为 9，在45℃的温度下，酶促反应15小时，反应结束后，转化液中L-酪氨酸浓度为147.3 g/L，对L-丝氨酸摩尔转化率为95%。
2、将转化液放入离心机中，在转速为4000 转/分钟下离心15分钟，收集湿细胞和固体L-酪氨酸混合物226 g，用2000 ml纯水溶解固体混合物，滴加浓度为10 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至13，搅拌升温至80℃，将固体混合物完全溶解，加入活性炭脱色除去菌体细胞，将溶液过滤，滤液用6 mol/L盐酸调节pH值至6，冷却结晶，真空抽滤，用少量纯水洗涤产品，烘干得L-酪氨酸138 g，收率94%，比旋光= - 11.5o（c=5，1 mol/L盐酸）。
实施例二
含L-丝氨酸的氨基酸料液来源于角蛋白水解液。
1、取Escherichia coli K-12湿菌体11 g和Citrobacter freundii ATCC 8090湿菌体15 g加入到1000 ml含80g/L的L-丝氨酸的混合氨基酸料液中（料液中总氨基酸的含量为20%），添加0.2 g磷酸吡哆醛和0.1 g吐温80，流加137 ml浓度为 500 g/L苯酚水溶液，维持转化液中苯酚含量10 g/L，用体积百分比浓度为25%氨水控制转化液pH 8，在40℃的温度下，酶促反应14 h，反应结束后，转化液中L-酪氨酸浓度为131 g/L，对L-丝氨酸摩尔转化率为95%。
2、将转化液放入离心机中，在转速为4000 转/分钟下离心15分钟，收集湿细胞和固体L-酪氨酸混合物202 g，用1600 ml纯水溶解固体混合物，滴加浓度为10 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至12，搅拌升温至80℃，将固体混合物完全溶解，加入活性炭脱色除去菌体细胞，将溶液过滤，滤液用6 mol/L盐酸调节pH值至6，冷却结晶，真空抽滤，用少量纯水洗涤产品，烘干得L-酪氨酸123 g，收率94%，比旋光= - 11.3o（c=5，1 mol/L盐酸）。
实施例三
含L-丝氨酸的氨基酸料液来源于角蛋白水解液。
1、取Escherichia coli K-12湿菌体10 g和Citrobacter koseri ATCC BAA-895湿菌体14 g加入到1000 ml含60g/L的L-丝氨酸的混合氨基酸料液中（料液中总氨基酸的含量为30%），添加0.2 g磷酸吡哆醛和0.1 g聚乙二醇辛基苯基醚（OP），流加103 ml浓度为 500 g/L苯酚水溶液，维持转化液中苯酚含量10 g/L，用体积百分比浓度为25%氨水控制转化液pH 10，在30℃的温度下，酶促反应18h，反应结束后，转化液中L-酪氨酸浓度为98.3 g/L，对L-丝氨酸摩尔转化率为95%。
2、将转化液放入离心机中，在转速为4000 转/分钟下离心15分钟，收集湿细胞和固体L-酪氨酸混合物158 g，用1200 ml纯水溶解固体混合物，滴加浓度为10 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至12，搅拌升温至80℃，将固体混合物完全溶解，加入活性炭脱色除去菌体细胞，将溶液过滤，滤液用6 mol/L盐酸调节pH值至6，冷却结晶，真空抽滤，用少量纯水洗涤产品，烘干得L-酪氨酸92.5 g，收率94%，比旋光= - 11.5o（c=5，1 mol/L盐酸）。
实施例四
含L-丝氨酸的氨基酸料液来源于角蛋白水解液。
1、取Escherichia coli K-12湿菌体11 g和Citrobacter freundii ATCC 8090湿菌体14 g加入到1000 ml含40g/L的L-丝氨酸的混合氨基酸料液中（料液中总氨基酸的含量为40%），添加0.2 g磷酸吡哆醛和0.01 g十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），流加69 ml浓度为 500 g/L苯酚水溶液，维持转化液中苯酚含量10 g/L，用体积百分比浓度为25%氨水控制转化液pH 9，在42℃的温度下，酶促反应10 h，反应结束后，转化液中L-酪氨酸浓度为65.5 g/L，对L-丝氨酸摩尔转化率为95%。
2、将转化液放入离心机中，在转速为4000 转/分钟下离心15分钟，收集湿细胞和固体L-酪氨酸混合物116g，用800 ml纯水溶解固体混合物，滴加浓度为10 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至12，搅拌升温至80℃，将固体混合物完全溶解，加入活性炭脱色除去菌体细胞，将溶液过滤，滤液用6 mol/L盐酸调节pH值至6，冷却结晶，真空抽滤，用少量纯水洗涤产品，烘干得L-酪氨酸62.2 g，收率95%，比旋光= - 11.6o（c=5，1 mol/L盐酸）。
实施例五
含L-丝氨酸的氨基酸料液来源于蚕丝水解液。
1、取Escherichia coli K-12湿菌体10g和Citrobacter freundii ATCC 8090湿菌体15g加入到1000 ml含30g/L的L-丝氨酸的混合氨基酸料液中（料液中总氨基酸的含量为30%），添加0.2 g磷酸吡哆醛和0.1g吐温80，流加52 ml 浓度为500 g/L苯酚水溶液，维持转化液中苯酚含量10 g/L，用体积百分比浓度为25%的氨水控制转化液pH值至 6，在55℃的温度下，酶促反应10小时，反应结束后，转化液中L-酪氨酸浓度为49g/L，对L-丝氨酸摩尔转化率为95%。
2、将转化液放入离心机中，在转速为4000 转/分钟下离心15分钟，收集湿细胞和固体L-酪氨酸混合物96g，用600ml纯水溶解固体混合物，滴加浓度为10 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至12，搅拌升温至80℃，将固体混合物完全溶解，加入活性炭脱色除去菌体细胞，将溶液过滤，滤液用6 mol/L盐酸调节pH值至6，冷却结晶，真空抽滤，用少量纯水洗涤产品，烘干得L-酪氨酸46g，收率94%，比旋光= - 11.8o（c=5，1 mol/L盐酸）。
实施例六
含L-丝氨酸的氨基酸料液来源于蚕丝水解液。
1、取Escherichia coli K-12湿菌体10 g和Erwinia herbicola ATCC 21434湿菌体15 g加入到1000 ml含40g/L的L-丝氨酸的混合氨基酸料液中（料液中总氨基酸的含量为40%），添加0.2 g磷酸吡哆醛和0.5g吐温80，流加68 ml 浓度为500 g/L苯酚水溶液，维持转化液中苯酚含量10 g/L，用体积百分比浓度为25%的氨水控制转化液pH值至 11，在25℃的温度下，酶促反应24小时，反应结束后，转化液中L-酪氨酸浓度为65.5g/L，对L-丝氨酸摩尔转化率为95%。
2、将转化液放入离心机中，在转速为4000 转/分钟下离心15分钟，收集湿细胞和固体L-酪氨酸混合物113g，用800ml纯水溶解固体混合物，滴加浓度为10 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至12，搅拌升温至80℃，将固体混合物完全溶解，加入活性炭脱色除去菌体细胞，将溶液过滤，滤液用6 mol/L盐酸调节pH值至6，冷却结晶，真空抽滤，用少量纯水洗涤产品，烘干得L-酪氨酸62g，收率95%，比旋光= - 11.4o（c=5，1 mol/L盐酸）。
实施例七
含L-丝氨酸的氨基酸料液来源于蚕丝水解液。
1、取Escherichia coli K-12湿菌体10g和Citrobacter freundii ATCC 8090湿菌体14g加入到1000 ml含10g/L的L-丝氨酸的混合氨基酸料液中（料液中总氨基酸的含量为10%），添加0.2 g磷酸吡哆醛和0.01g聚乙二醇辛基苯基醚（OP），流加17 ml 浓度为500 g/L苯酚水溶液，维持转化液中苯酚含量10 g/L，用体积百分比浓度为25%的氨水控制转化液pH值至 9，在42℃的温度下，酶促反应6小时，反应结束后，转化液中L-酪氨酸浓度为16.3g/L，对L-丝氨酸摩尔转化率为95%。
2、将转化液放入离心机中，在转速为4000 转/分钟下离心15分钟，收集湿细胞和固体L-酪氨酸混合物52g，用200ml纯水溶解固体混合物，滴加浓度为10 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至12，搅拌升温至80℃，将固体混合物完全溶解，加入活性炭脱色除去菌体细胞，将溶液过滤，滤液用6 mol/L盐酸调节pH值至6，冷却结晶，真空抽滤，用少量纯水洗涤产品，烘干得L-酪氨酸15.3g，收率94%，比旋光= - 11.7o（c=5，1 mol/L盐酸）。
实施例八
含L-丝氨酸的氨基酸料液来源于蚕丝水解液。
1、取Escherichia coli K-12湿菌体10g和Citrobacter freundii ATCC 8090湿菌体15g加入到1000 ml含200g/L的L-丝氨酸的混合氨基酸料液中（料液中总氨基酸的含量为40%），添加0.2 g磷酸吡哆醛和1.0g聚乙二醇辛基苯基醚（OP），流加342 ml 浓度为500 g/L苯酚水溶液，维持转化液中苯酚含量10 g/L，用体积百分比浓度为25%的氨水控制转化液pH值至 8，在45℃的温度下，酶促反应28小时，反应结束后，转化液中L-酪氨酸浓度为327.5g/L，对L-丝氨酸摩尔转化率为95%。
2、将转化液放入离心机中，在转速为4000 转/分钟下离心15分钟，收集湿细胞和固体L-酪氨酸混合物460g，用4000ml纯水溶解固体混合物，滴加浓度为10 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至12，搅拌升温至80℃，将固体混合物完全溶解，加入活性炭脱色除去菌体细胞，将溶液过滤，滤液用6 mol/L盐酸调节pH值至6，冷却结晶，真空抽滤，用少量纯水洗涤产品，烘干得L-酪氨酸308g，收率94%，比旋光= - 11.3o（c=5，1 mol/L盐酸）。
实施例九
含L-丝氨酸的氨基酸料液来源于蚕丝水解液。
1、取Escherichia coli K-12湿菌体10g和Citrobacter freundii ATCC 8090湿菌体15g加入到1000 ml含360g/L的L-丝氨酸的混合氨基酸料液中（料液中总氨基酸的含量为40%），添加0.2 g磷酸吡哆醛和1.0g吐温80，流加616 ml 浓度为500 g/L苯酚水溶液，维持转化液中苯酚含量10 g/L，用体积百分比浓度为25%的氨水控制转化液pH值至 9，在40℃的温度下，酶促反应35小时，反应结束后，转化液中L-酪氨酸浓度为589.6g/L，对L-丝氨酸摩尔转化率为95%。
2、将转化液放入离心机中，在转速为4000 转/分钟下离心15分钟，收集湿细胞和固体L-酪氨酸混合物800g，用7000ml纯水溶解固体混合物，滴加浓度为10 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至13，搅拌升温至80℃，将固体混合物完全溶解，加入活性炭脱色除去菌体细胞，将溶液过滤，滤液用6 mol/L盐酸调节pH值至6，冷却结晶，真空抽滤，用少量纯水洗涤产品，烘干得L-酪氨酸554g，收率94%，比旋光= - 11.4o（c=5，1 mol/L盐酸）。
实施例十
含L-丝氨酸的氨基酸料液来源于蚕丝水解液。
1、取Escherichia coli K-12湿菌体10g和Citrobacter freundii ATCC 8090湿菌体15g加入到1000 ml含140g/L的L-丝氨酸的混合氨基酸料液中（料液中总氨基酸的含量为20%），添加0.2 g磷酸吡哆醛和0.3g十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），流加240 ml 浓度为500 g/L苯酚水溶液，维持转化液中苯酚含量10 g/L，用体积百分比浓度为25%的氨水控制转化液pH值至 9，在42℃的温度下，酶促反应20小时，反应结束后，转化液中L-酪氨酸浓度为229.3g/L，对L-丝氨酸摩尔转化率为95%。
2、将转化液放入离心机中，在转速为4000 转/分钟下离心15分钟，收集湿细胞和固体L-酪氨酸混合物330g，用3000ml纯水溶解固体混合物，滴加浓度为10 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至12，搅拌升温至80℃，将固体混合物完全溶解，加入活性炭脱色除去菌体细胞，将溶液过滤，滤液用6 mol/L盐酸调节pH值至6，冷却结晶，真空抽滤，用少量纯水洗涤产品，烘干得L-酪氨酸215g，收率94%，比旋光= - 11.3o（c=5，1 mol/L盐酸）。
以上所述仅是本发明的非限定实施方式，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思和不作出创造性劳动的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种L-酪氨酸酶法转化制备方法，其特征在于：所述方法按以下步骤进行：
(1)取Escherichia coli K-12湿菌体10g和Citrobacter freundii ATCC8090湿菌体15g加入到1000ml含90g/L的L-丝氨酸的混合氨基酸料液中，该混合氨基酸来源于角蛋白水解液，料液中总氨基酸重量比含量10％，再添加0.2g磷酸吡哆醛和0.01g吐温80，流加154ml浓度为500g/L苯酚水溶液，维持转化液中苯酚含量10g/L，用体积百分比浓度为25％的氨水控制转化液pH9，45℃酶促反应15h，反应结束后转化液中L-酪氨酸浓度为147.3g/L，对L-丝氨酸摩尔转化率为95％；
(2)将转化液4000r/min离心15min，收集湿细胞和固体L-酪氨酸混合物226g，用2000ml纯水溶解固体混合物，滴加10mol/L氢氧化钠溶液调pH13，搅拌升温至80℃，将固体混合物完全溶解，加活性炭脱色除去菌体细胞，滤液用6mol/L盐酸调pH6，冷却结晶，真空抽滤，用少量纯水洗涤产品，烘干得L-酪氨酸138g，收率94％，比旋光c＝5，1mol/L盐酸。
2.一种L-酪氨酸酶法转化制备方法，其特征在于：所述方法按以下步骤进行：
(1)取Escherichia coli K-12湿菌体10g和Citrobacter koseri ATCC BAA-895湿菌体14g加入到1000ml含60g/L的L-丝氨酸的混合氨基酸料液中，该混合氨基酸来源于角蛋白水解液，料液中总氨基酸重量比含量30％，再添加0.2g磷酸吡哆醛和0.1g聚乙二醇辛基苯基醚，流加103ml浓度为500g/L苯酚水溶液，维持转化液中苯酚含量10g/L，用体积百分比浓度为25％的氨水控制转化液pH10，30℃酶促反应18h，反应结束后转化液中L-酪氨酸浓度为98.3g/L，对L-丝氨酸摩尔转化率为95％；
(2)将转化液4000r/min离心15min，收集湿细胞和固体L-酪氨酸混合物158g，用1200ml纯水溶解固体混合物，滴加10mol/L氢氧化钠溶液调pH12，搅拌升温至80℃，将固体混合物完全溶解，加活性炭脱色除去菌体细胞，滤液用6mol/L盐酸调pH6，冷却结晶，真空抽滤，用少量纯水洗涤产品，烘干得L-酪氨酸92.5g，收率94％，比旋光c＝5，1mol/L盐酸。
3.一种L-酪氨酸酶法转化制备方法，其特征在于：所述方法按以下步骤进行：
(1)取Escherichia coli K-12湿菌体10g和Erwinia herbicola ATCC21434湿菌体15g加入到1000ml含40g/L的L-丝氨酸的混合氨基酸料液中，该混合氨基酸来源于蚕丝水解液，料液中总氨基酸重量比含量40％，再添加0.2g磷酸吡哆醛和0.5g吐温80，流加68ml浓度为500g/L苯酚水溶液，维持转化液中苯酚含量10g/L，用体积百分比浓度为25％的氨水控制转化液pH11，25℃酶促反应24h，反应结束后转化液中L-酪氨酸浓度为65.5g/L，对L-丝氨酸摩尔转化率为95％；
(2)将转化液4000r/min离心15min，收集湿细胞和固体L-酪氨酸混合物113g，用800ml纯水溶解固体混合物，滴加10mol/L 氢氧化钠溶液调pH12，搅拌升温至80℃，将固体混合物完全溶解，加活性炭脱色除去菌体细胞，滤液用6mol/L盐酸调pH6，冷却结晶，真空抽滤，用少量纯水洗涤产品，烘干得L-酪氨酸62g，收率95％，比旋光c＝5，1mol/L盐酸。
4.一种L-酪氨酸酶法转化制备方法，其特征在于：所述方法按以下步骤进行：
(1)取Escherichia coli K-12湿菌体10g和Citrobacter freundii ATCC8090湿菌体15g加入到1000ml含140g/L的L-丝氨酸的混合氨基酸料液中，该混合氨基酸来源于蚕丝水解液，料液中总氨基酸重量比含量20％，再添加0.2g磷酸吡哆醛和0.3g十六烷基三甲基溴化铵，流加240ml浓度为500g/L苯酚水溶液，维持转化液中苯酚含量10g/L，用体积百分比浓度为25％的氨水控制转化液pH9，42℃酶促反应20h，反应结束后转化液中L-酪氨酸浓度为229.3g/L，对L-丝氨酸摩尔转化率为95％；
(2)将转化液4000r/min离心15min，收集湿细胞和固体L-酪氨酸混合物330g，用3000ml纯水溶解固体混合物，滴加10mol/L氢氧化钠溶液调pH12，搅拌升温至80℃，将固体混合物完全溶解，加活性炭脱色除去菌体细胞，滤液用6mol/L盐酸调pH6，冷却结晶，真空抽滤，用少量纯水洗涤产品，烘干得L-酪氨酸215g，收率94％，比旋光c＝5，1mol/L盐酸。
5.一种L-酪氨酸酶法转化制备方法，其特征在于：所述方法按以下步骤进行：
(1)取Escherichia coli K-12湿菌体10g和Citrobacter freundii ATCC8090湿菌体15g加入到1000ml含360g/L的L-丝氨酸的混合氨基酸料液中，该混合氨基酸来源于蚕丝水解液，料液中总氨基酸重量比含量40％，再添加0.2g磷酸吡哆醛和1.0g吐温80，流加616ml浓度为500g/L苯酚水溶液，维持转化液中苯酚含量10g/L，用体积百分比浓度为25％的氨水控制转化液pH9，40℃酶促反应35h，反应结束后转化液中L-酪氨酸浓度为589.6g/L，对L-丝氨酸摩尔转化率为95％；
(2)将转化液4000r/min离心15min，收集湿细胞和固体L-酪氨酸混合物800g，用7000ml纯水溶解固体混合物，滴加10mol/L氢氧化钠溶液调pH13，搅拌升温至80℃，将固体混合物完全溶解，加活性炭脱色除去菌体细胞，滤液用6mol/L盐酸调pH6，冷却结晶，真空抽滤，用少量纯水洗涤产品，烘干得L-酪氨酸554g，收率94％，比旋光c＝5，1mol/L盐酸。
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