CN102517352B - L-半胱氨酸酶法转化制备方法 - Google Patents
L-半胱氨酸酶法转化制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及L-半胱氨酸的酶法转化制备方法。该制备方法采用含有L-丝氨酸的混合氨基酸料液为原料，将具有L-色氨酸合成酶活性的湿菌体或粗酶液与含有L-丝氨酸的混合氨基酸料液混合，添加适量硫氢化物或硫化物，25～55℃，pH6～11条件下进行酶促反应，将反应生成的L-半胱氨酸通空气或滴加双氧水氧化，等电点结晶法分离得到L-胱氨酸，再经过电解还原制得L-半胱氨酸。该方法解决了混合氨基酸料液中L-丝氨酸的分离及综合利用难题，得到了附加值较高的L-半胱氨酸产品，具有原料来源广、价格低廉，操作简便，酶促转化时间短、生产成本低等优点。
Description
一、技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及L-半胱氨酸的酶法转化制备方法。
二、背景技术
L-半胱氨酸是自然界存在的氨基酸，也是人体的非必需氨基酸之一，其所带的巯基具有重要的生理功能。L-半胱氨酸及其衍生物可用于医药领域、化妆品工业、食品领域和饲料添加剂领域等，具有非常广泛的应用。
根据目前文献报导L-半胱氨酸的制备方法主要有提取法、化学合成法、发酵法和酶转化法。
1、提取法
目前国内生产L-半胱氨酸主要以人或动物毛发为原料，先经酸水解提取L-胱氨酸，再经过电解还原制得L-半胱氨酸。该方法大规模工业化生产受到原料来源的限制，产物中易混入其它氨基酸，分离难度大，环保成本高。也有厂家在生产L-半胱氨酸的相关产品中回收L-胱氨酸，曾庆群等(CN 101104599A，2008)对N-乙酰-L-半胱氨酸生产过程中排放的废液进行氧化处理，分离回收了L-胱氨酸，提高了原料利用率，降低了生产成本。
但是，近年来随着人们环保意识的增强或宗教信仰等原因，一些西方国家禁用由动物毛发为原料制得的L-半胱氨酸，因此寻求新的制备L-半胱氨酸的方法势在必行。
2、化学合成法
化学合成法是利用氯代烷类化合物经过氧化反应、加成反应、还原反应、取代反应，最后得到DL-半胱氨酸。化学合成法不仅步骤较多，而且得到的产物通常为外消旋体，需经拆分后才能得到具有生理活性的L-半胱氨酸。
马云峰(CN 1876628A，2006)以DL-半胱氨酸为原料，以无机酸为溶剂，以D-二苯甲酰酒石酸或L-二苯甲酰酒石酸为拆分剂，将外消旋半胱氨酸与拆分剂按一定摩尔比溶于稀的无机酸溶液中，保温搅拌、冷却结晶，分别制得L-半胱氨酸和D-半胱氨酸。
3、发酵法
目前发酵法生产L-半胱氨酸正处于实验室探索阶段，其主要问题是微生物体内的L-半胱氨酸合成过程复杂，且巯基来源难以解决。
张建国(CN 101831397A，2010)利用基因改造的大肠杆菌BL21(DE3)，在含葡萄糖、玉米粉、牛肉膏、乳糖、氯化钠、硫代硫酸钠等成分的培养基中发酵产生了L-半胱氨酸，基因改造前的大肠杆菌BL21(DE3)L-半胱氨酸产量几乎为0，而基因改造后的BL21(DE3)L-半胱氨酸产量达到1g/L。
托马斯·迈尔(CN 1262646C，2006)采用半胱氨酸代谢去调节、CysB活性增加的改造菌株，在含葡萄糖、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠等成分的培养基中补料分批发酵，流加葡萄糖及硫代硫酸盐，发酵48h后发酵液中L-半胱氨酸含量达到22.6g/L。
Takagi Hiroshi(EP1234874，2002)以棒状杆菌为出发菌株，通过基因改造提高胞内丝氨酸乙酰转移酶活性，同时降低半胱氨酸脱巯基酶活性，在含葡萄糖、硫酸铵等成分的产半胱氨酸培养基中发酵，积累了L-半胱氨酸和L-胱氨酸。
4、酶转化法
自1979年Sano K.等(Applied and Environmental Microbiology，34(6)：806-810，1977)发现嗜硫氮杂环戊烯假单胞菌转化DL-2-氨基-Δ2-噻唑啉-4-羧酸(DL-ATC)为L-半胱氨酸以来，酶法生产L-半胱氨酸已成为近年来人们关注和研究的方向。酶法转化因具有专一性强、反应条件温和、环境友好等优点而日益受到重视。
日本具有用DL-ATC为原料酶法制备L-半胱氨酸较为成熟的生产工艺，国内学者也做了相关研究。王普(CN 100467587C，2009)以假单胞菌zjwp-14湿菌体或粗酶液为酶源，以DL-ATC为底物，于20～52℃酶促转化1～9h，得到含L-半胱氨酸的反应液，经分离提取制得L-半胱氨酸。陈宁(CN 101348809A，2009)以恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)TS-1138为供试菌种，以全细胞为酶源酶法转化DL-ATC合成了L-半胱氨酸。
以DL-ATC为底物酶法合成L-半胱氨酸，需要化学合成DL-ATC，且酶转化过程中需要多步酶促反应，整体催化效率不高。
焦庆才等(Bioresource Technology，102：3554-3557，2011)以L-丝氨酸和吲哚为底物，以色氨酸合成酶基因工程菌DM206(pET-28a-trpBA/BL21)酶法合成了L-色氨酸。但据文献报道色氨酸合成酶不仅能够催化L-丝氨酸和吲哚合成L-色氨酸，还能催化L-丝氨酸和硫氢化钠反应生成L-半胱氨酸。
Ken-ichi Ishiwata等(Journal of Fermentation and Bioengineering，67(3)：169-172，1989)以L-丝氨酸和硫氢化钠为底物，色氨酸合成酶酶法合成了L-半胱氨酸，在最佳条件下反应液中L-半胱氨酸达到114g/L，转化率是以L-丝氨酸和吲哚为底物酶法合成L-色氨酸的47％。
日本专利(JP62215396-A，1987；JP63007790-A，1988)报道了以L-丝氨酸为底物，以硫化氢或硫氢化物或硫化物为巯基供体，色氨酸合成酶酶法合成L-半胱氨酸。日本专利(JP62019098-A，1987)以DL-丝氨酸和硫化物为底物，用色氨酸合成酶将L-丝氨酸转化生成L-半胱氨酸或L-胱氨酸，同时分离制备了D-丝氨酸。
以上色氨酸合成酶酶法合成L-半胱氨酸的报道均以L-丝氨酸纯品为底物，目前L-丝氨酸和L-半胱氨酸的生产成本大体相当，故以L-丝氨酸纯品酶法合成L-半胱氨酸无现实意义。
三、发明内容
本发明需要解决的问题是提供一种高效、低成本的制备L-半胱氨酸的方法。本发明以氨基酸工业中富含L-丝氨酸的混合氨基酸料液代替L-丝氨酸纯品，以色氨酸合成酶酶法合成L-半胱氨酸。
本发明可以通过以下技术方案来达到：
L-半胱氨酸的酶法转化制备方法，其步骤为：
(1)色氨酸合成酶基因工程菌DM206(pET-28a-trpBA/BL21)，在含有异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)或乳糖的培养基中培养，诱导产生色氨酸合成酶；
(2)将含有色氨酸合成酶的湿菌体或粗酶液与含L-丝氨酸的混合氨基酸料液混合，再加入适量磷酸吡哆醛、表面活性剂、硫氢化钠或硫化钠或硫氢化铵或硫化铵或硫化氢，在25～55℃，pH 6～11条件下进行酶促反应；将反应生成的L-半胱氨酸氧化后分离得到L-胱氨酸，再经过电解还原制得L-半胱氨酸。
上述步骤(1)中的培养基碳源采用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和/或果糖，培养基中总碳源质量浓度为1～20g/L；氮源采用牛肉膏、酵母膏、玉米浆、蛋白胨和/或豆饼水解液，培养基中总氮源质量浓度为1～30g/L；加入IPTG或乳糖诱导，IPTG终浓度为0.05～0.15g/L，乳糖终浓度为5～15g/L。
上述步骤(2)中含L-丝氨酸的混合氨基酸料液为角蛋白水解液或蚕丝水解液或酶法合成L-丝氨酸的反应液，混合氨基酸料液中总氨基酸含量(w/w)为10％～50％，其中L-丝氨酸在总氨基酸中含量(w/w)为10％～95％。
上述步骤(2)的转化液中加入适量的表面活性剂吐温-80或十六烷三甲基溴化铵(CTAB)或聚乙二醇辛基苯基醚(OP)，其浓度为0.005g/L～5.0g/L。
目前，我国L-半胱氨酸生产主要来源于毛发水解提取法，该方法工艺成熟，但大规模工业化生产受到原料来源的限制，短时间内难以扩大生产规模，环保压力大。而另一方面我国在氨基酸工业生产中，会产生大量不能直接用于食品和医药方面的富含L-丝氨酸的混合氨基酸料液，该混合氨基酸料液直接分离制备L-丝氨酸成本高、效率低。本发明以富含L-丝氨酸的混合氨基酸料液为原料，以色氨酸合成酶酶法合成了L-半胱氨酸。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
(1)本发明采用的色氨酸合成酶基因工程菌DM206，在优选的培养基中培养可以高效表达色氨酸合成酶，使酶法合成L-半胱氨酸有较高的催化速率和转化率，其中L-丝氨酸摩尔转化率达到80％以上。
(2)本发明采用含L-丝氨酸的混合氨基酸料液为反应原料，充分利用了工业副产物，解决了混合氨基酸料液中L-丝氨酸高效分离的难题，同时也为大规模生产L-半胱氨酸提供了更为丰富的原料，具有良好的经济效益和社会效益。
(3)L-半胱氨酸氧化后得到L-胱氨酸，L-胱氨酸和混合氨基酸料液中的其它氨基酸理化性质有较大差异，用等电点结晶法即可实现分离。
(4)酶法合成L-半胱氨酸具有反应条件温和，酶立体选择性强，催化效率高，成本低，工艺流程简单等优点，适合工业化生产。
四、具体实施方式
实施例一
1.将1000mL发酵液离心得到的色氨酸合成酶湿菌体18g加入到500mL转化液中，转化液中含38g/L L-丝氨酸的毛发酸水解液(氨基酸总含量15％)、13g NaHS、0.2g/L磷酸吡哆醛和0.005g/L OP，pH 8.5，37℃酶促反应21h，反应结束后转化液中L-半胱氨酸浓度为36g/L，对L-丝氨酸摩尔转化率为82.2％。
2.将转化液4000r/min离心15min，去除菌体细胞，上清液用6mol/L盐酸调pH 1.0，加热去除H2S，活性碳脱色，抽滤，滤液用5mol/LNaOH调pH 5.0，将滤液中的L-半胱氨酸通空气氧化，析出沉淀，真空抽滤，纯水洗涤，烘干得16.8g L-胱氨酸粗品，经酸溶脱色，中和结晶，真空抽滤，洗涤，烘干得15.6gL-胱氨酸精品，比旋光(c＝2，1mol/L盐酸)，L-胱氨酸精品经电解还原制得L-半胱氨酸。
实施例二
1.将1000mL发酵液离心得到的色氨酸合成酶湿菌体19g加入到500mL转化液中，转化液中含46g/L L-丝氨酸的毛发酸水解液(氨基酸总含量10％)、15g NaHS、0.2g/L磷酸吡哆醛和5g/L吐温-80，pH 9.0，35℃酶促反应28h，反应结束后转化液中L-半胱氨酸浓度为45g/L，对L-丝氨酸摩尔转化率为84.9％。
2.将转化液4000r/min离心15min，去除菌体细胞，上清液用6mol/L盐酸调pH 1.0，加热去除H2S，活性碳脱色，抽滤，滤液用5mol/LNaOH调pH 5.0，将滤液中的L-半胱氨酸通空气氧化，析出沉淀，真空抽滤，纯水洗涤，烘干得21g L-胱氨酸粗品，经酸溶脱色，中和结晶，真空抽滤，洗涤，烘干得19.6g L-胱氨酸精品，比旋光(c＝2，1mol/L盐酸)，L-胱氨酸精品经电解还原制得L-半胱氨酸。
实施例三
1.将1000mL发酵液离心得到的色氨酸合成酶湿菌体18g加入到500mL转化液中，转化液中含25g/L L-丝氨酸的毛发酸水解液(氨基酸总含量25％)、8g NaHS、0.2g/L磷酸吡哆醛和0.5g/L吐温-80，pH 9.0，25℃酶促反应15h，反应结束后转化液中L-半胱氨酸浓度为23.8g/L，对L-丝氨酸摩尔转化率为82.6％。
2.将转化液4000r/min离心15min，去除菌体细胞，上清液用6mol/L盐酸调pH 1.0，加热去除H2S，活性碳脱色，抽滤，滤液用5mol/L NaOH调pH 5.0，将滤液中的L-半胱氨酸滴加双氧水氧化，析出沉淀，真空抽滤，纯水洗涤，烘干得10.5g L-胱氨酸粗品，经酸溶脱色，中和结晶，真空抽滤，洗涤，烘干得9.8gL-胱氨酸精品，比旋光(c＝2，1mol/L盐酸)，L-胱氨酸精品经电解还原制得L-半胱氨酸。
实施例四
1.将1000mL发酵液离心得到的色氨酸合成酶湿菌体19g加入到500mL转化液中，转化液中含70g/L L-丝氨酸的蚕丝酸水解液(氨基酸总含量35％)、32g Na2S、0.2g/L磷酸吡哆醛和0.05g/L CTAB，pH 9.0，40℃酶促反应40h，反应结束后转化液中L-半胱氨酸浓度为68.8g/L，对L-丝氨酸摩尔转化率为85.3％。
2.将转化液4000r/min离心15min，去除菌体细胞，上清液用6mol/L盐酸调pH 0.5，加热去除H2S，活性碳脱色，抽滤，滤液用5mol/LNaOH调pH 5.0，将滤液中的L-半胱氨酸滴加双氧水氧化，析出沉淀，真空抽滤，纯水洗涤，烘干得32.5g L-胱氨酸粗品，经酸溶脱色，中和结晶，真空抽滤，洗涤，烘干得31g L-胱氨酸精品，比旋光(c＝2，1mol/L盐酸)，L-胱氨酸精品经电解还原制得L-半胱氨酸。
实施例五
1.将1000mL发酵液离心得到的色氨酸合成酶湿菌体18g加入到500mL转化液中，转化液中含84g/L L-丝氨酸的蚕丝酸水解液(氨基酸总含量30％)、26g NH4HS、0.2g/L磷酸吡哆醛和0.5g/L CTAB，pH 7.0，37℃酶促反应40h，反应结束后转化液中L-半胱氨酸浓度为81.6g/L，对L-丝氨酸摩尔转化率为84.3％。
2.将转化液4000r/min离心15min，去除菌体细胞，上清液用6mol/L盐酸调pH 0.5，加热去除H2S，活性碳脱色，抽滤，滤液用5mol/LNaOH调pH 5.0，将滤液中的L-半胱氨酸滴加双氧水氧化，析出沉淀，真空抽滤，纯水洗涤，烘干得38.2g L-胱氨酸粗品，经酸溶脱色，中和结晶，真空抽滤，洗涤，烘干得37g L-胱氨酸精品，比旋光(c＝2，1mol/L盐酸)，L-胱氨酸精品经电解还原制得L-半胱氨酸。
实施例六
1.将1000mL发酵液离心得到的色氨酸合成酶湿菌体17g加入到500mL转化液中，转化液中含44g/L L-丝氨酸的蚕丝酸水解液(氨基酸总含量20％)、20g(NH4)2S、0.2g/L磷酸吡哆醛和0.5g/L吐温80，pH 6.0，55℃酶促反应30h，反应结束后转化液中L-半胱氨酸浓度为41.2g/L，对L-丝氨酸摩尔转化率为81.3％。
2.将转化液4000r/min离心15min，去除菌体细胞，上清液用6mol/L盐酸调pH 0.5，加热去除H2S，活性碳脱色，抽滤，滤液用5mol/L NaOH调pH 5.0，将滤液中的L-半胱氨酸通空气氧化，析出沉淀，真空抽滤，纯水洗涤，烘干得18.8g L-胱氨酸粗品，经酸溶脱色，中和结晶，真空抽滤，洗涤，烘干得17g L-胱氨酸精品，比旋光(c＝2，1mol/L盐酸)，L-胱氨酸精品经电解还原制得L-半胱氨酸。
实施例七
1.将1000mL发酵液离心得到的色氨酸合成酶湿菌体19g加入到500mL转化液中，转化液中含105g/L酶法合成L-丝氨酸的反应液(氨基酸总含量11％)、47g Na2S、0.2g/L磷酸吡哆醛和0.5g/L吐温-80，pH 11，37℃酶促反应45h，反应结束后转化液中L-半胱氨酸浓度为102g/L，对L-丝氨酸摩尔转化率为84.3％。
2.将转化液4000r/min离心15min，去除菌体细胞，上清液用6mol/L盐酸调pH 0.5，加热去除H2S，活性碳脱色，抽滤，滤液用5mol/L NaOH调pH 5.0，将滤液中的L-半胱氨酸通空气氧化，析出沉淀，真空抽滤，纯水洗涤，烘干得49.6g L-胱氨酸粗品，经酸溶脱色，中和结晶，真空抽滤，洗涤，烘干得48g L-胱氨酸精品，比旋光(c＝2，1mol/L盐酸)，L-胱氨酸精品经电解还原制得L-半胱氨酸。
实施例八
1.将1000mL发酵液离心得到的色氨酸合成酶湿菌体19g加入到500mL转化液中，转化液中含120g/L酶法合成L-丝氨酸的反应液(氨基酸总含量50％)、39g NaHS、0.2g/L磷酸吡哆醛和0.5g/L吐温-80，pH 8，37℃酶促反应45h，反应结束后转化液中L-半胱氨酸浓度为118g/L，对L-丝氨酸摩尔转化率为85.3％。
2.将转化液4000r/min离心15min，去除菌体细胞，上清液用6mol/L盐酸调pH 0.5，加热去除H2S，活性碳脱色，抽滤，滤液用5mol/L NaOH调pH 5.0，将滤液中的L-半胱氨酸通空气氧化，析出沉淀，真空抽滤，纯水洗涤，烘干得57.6g L-胱氨酸粗品，经酸溶脱色，中和结晶，真空抽滤，洗涤，烘干得56g L-胱氨酸精品，比旋光(c＝2，1mol/L盐酸)，L-胱氨酸精品经电解还原制得L-半胱氨酸。
实施例九
1.将1000mL发酵液离心得到的19g色氨酸合成酶湿菌体超声波破碎制成20ml粗酶液，加入到500mL转化液中，转化液中含200g/L酶法合成L-丝氨酸的反应液(氨基酸总含量30％)和0.2g/L磷酸吡哆醛，通入H2S气体并用氨水调pH 9.0，37℃酶促反应50h，反应结束后转化液中L-半胱氨酸浓度为193g/L，对L-丝氨酸摩尔转化率为83.7％。
2.将转化液4000r/min离心15min，去除菌体细胞，上清液用6mol/L盐酸调pH 0.5，加热去除H2S，活性碳脱色，抽滤，滤液用5mol/L NaOH调pH 5.0，将滤液中的L-半胱氨酸通空气氧化，析出沉淀，真空抽滤，纯水洗涤，烘干得95gL-胱氨酸粗品，经酸溶脱色，中和结晶，真空抽滤，洗涤，烘干得93.4g L-胱氨酸精品，比旋光(c＝2，1mol/L盐酸)，L-胱氨酸精品经电解还原制得L-半胱氨酸。
Claims (3)
1.一种L-半胱氨酸的酶法转化制备方法，其特征是该方法为：
(1)具有色氨酸合成酶的基因工程菌DM206，在含有异丙基-β-D-硫代半乳糖苷或乳糖的培养基中培养，产生色氨酸合成酶；
(2)将1000ml发酵液离心得到的色氨酸合成酶湿菌体19g加入到500ml转化液中，转化液中含有46g/L且氨基酸总含量为10％的L-丝氨酸的毛发酸水解液、15g NaHS、0.2g/L磷酸吡哆醛和5g/L吐温-80，pH9.0，35℃酶促反应28h，反应结束后转化液中L-半胱氨酸浓度为45g/L，对L-丝氨酸摩尔转化率为84.9％；
(3)将转化液4000r/min离心15min，去除菌体细胞，上清液用6mol/L盐酸调pH1.0，加热除去H2S，活性炭脱色，抽滤，滤液用5mol/L NaOH调pH5.0，将滤液中的L-半胱氨酸通空气氧化，析出沉淀，真空抽滤，纯水洗涤，烘干得21g L-胱氨酸粗品，经酸溶脱色，中和结晶，真空抽滤，洗涤，烘干得19.6g L-胱氨酸精品，L-胱氨酸精品电解还原制得L-半胱氨酸。
2.一种L-半胱氨酸的酶法转化制备方法，其特征是该方法为：
(1)具有色氨酸合成酶的基因工程菌DM206，在含有异丙基-β-D-硫代半乳糖苷或乳糖的培养基中培养，产生色氨酸合成酶；
(2)将1000ml发酵液离心得到的色氨酸合成酶湿菌体19g加入到500ml转化液中，转化液中含有70g/L且氨基酸总含量为35％的L-丝氨酸的蚕丝酸水解液、32g Na2S、0.2g/L磷酸吡哆醛和0.05g/L CTAB，pH9.0，40℃酶促反应40h，反应结束后转化液中L-半胱氨酸浓度为68.8g/L，对L-丝氨酸摩尔转化率为85.3％；
(3)将转化液4000r/min离心15min，去除菌体细胞，上清液用6mol/L盐酸调pH0.5，加热除去H2S，活性炭脱色，抽滤，滤液用5mol/L NaOH调pH5.0，将滤液中的L-半胱氨酸滴加双氧水氧化，析出沉淀，真空抽滤，纯水洗涤，烘干得32.5g L-胱氨酸粗品，经酸溶脱色，中和结晶，真空抽滤，洗涤，烘干得31g L-胱氨酸精品，L-胱氨酸精品电解还原制得L-半胱氨酸。
3.一种L-半胱氨酸的酶法转化制备方法，其特征是该方法为：
(1)具有色氨酸合成酶的基因工程菌DM206，在含有异丙基-β-D-硫代半乳糖苷或乳糖的培养基中培养，产生色氨酸合成酶；
(2)将1000ml发酵液离心得到的色氨酸合成酶湿菌体19g加入到500ml转化液中，转化液中含有120g/L且氨基酸总含量为50％的L-丝氨酸的毛发酸水解液、39g NaHS、0.2g/L磷酸吡哆醛和0.5g/L吐温-80，pH8.0，37℃酶促反应45h，反应结束后转化液中L-半胱氨酸浓度为118g/L，对L-丝氨酸摩尔转化率为85.3％；
(3)将转化液4000r/min离心15min，去除菌体细胞，上清液用6mol/L盐酸调pH0.5，加热除去H2S，活性炭脱色，抽滤，滤液用5mol/L NaOH调pH5.0，将滤液中的L-半胱氨酸通空气氧化，析出沉淀，真空抽滤，纯水洗涤，烘干得57.6g L-胱氨酸粗品，经酸溶脱色，中和结晶，真空抽滤，洗涤，烘干得56g L-胱氨酸精品，L-胱氨酸精品电解还原制得L-半胱氨酸。
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