CN101717810A - D-丝氨酸酶法转化制备方法 - Google Patents
D-丝氨酸酶法转化制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于医药生物技术领域的D-丝氨酸酶法转化制备方法。该制备方法采用DL-丝氨酸作为原料，将具有高L-色氨酸合成酶活性的基因工程菌与含有DL-丝氨酸的转化液混合，30～50℃下进行酶促反应，然后用等电点结晶法或等电点结晶与离子交换树脂相结合的方法分离转化产物，得到高纯度D-丝氨酸和L-色氨酸。该方法实现了D-丝氨酸和L-色氨酸的同时生产，具有原料价格低廉，操作简便，转化时间短，生产成本低等优点。
Description
一、技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及D-丝氨酸酶法转化制备方法。
二、背景技术
D-丝氨酸是一种重要的手性中间体，在新药研究、有机合成和多肽合成等领域的应用正引起人们越来越多的关注。同时，D-丝氨酸也广泛应用于医学研究中，以D-丝氨酸为中心的研究已经成为目前神经科学领域的热点之一。例如，D-丝氨酸不仅用于合成治疗结核病的特效药D-环丝氨酸，还可作为制备其它医药中间体的重要原料。另外D-丝氨酸还可显著改善孤独症病人的社交退缩，并可用于治疗精神分裂症等脑疾病。
D-丝氨酸很难从自然界中获得，目前研究或产业化一般通过拆分外消旋丝氨酸的方法制备，拆分的方法有生物酶法、化学拆分法和物理拆分法。
1、生物酶法
生物酶法制备D-丝氨酸又可分为生物酶拆分法和生物酶合成法。
Ikeda等(US7186532，2007)利用具有较高L-丝氨酸脱氨酶活性的微生物作用于DL-丝氨酸，通过选择性降解L-丝氨酸而获得D-丝氨酸。
池田创等(CN1531599，2004)利用高活性的L-丝氨酸脱氨酶重组菌株与含有DL-丝氨酸的介质混合分解L-丝氨酸，然后从该介质中提取残存的D-丝氨酸。
日本专利(Japanese Published Unexamined Patent Application No.64-2594)报导在含有DL-丝氨酸的培养基中培养假丝酵母属(Candida)、球拟酵母属(Torulopsis)或隐球菌属(Cryptococcus)等能同化L-丝氨酸而不同化D-丝氨酸的微生物，从培养液中分离D-丝氨酸。
日本专利(Japanese Published Unexamined Patent Application No.5-91895)使具有酪氨酸酶活性的微生物与含有DL-丝氨酸和酚的反应液互相作用，将L-丝氨酸转换成L-酪氨酸，提取残存的D-丝氨酸。
2008年，庞敏等(食品与发酵工业，2008)利用E.coli Blt7-A的色氨酸酶酶促转化DL-丝氨酸，将DL-丝氨酸的拆分和L-色氨酸的合成同步化。朱延新等(CN1834257，2006)用乙酰甘氨酸为起始原料，制备乙酰-DL-丝氨酸，再用酰化酶或蛋白酶拆分得到D-丝氨酸。
安乐城正等(CN101040047，2007)发现一种具有由甲醛和甘氨酸合成D-丝氨酸活性的新型酶DNA并构建了该酶的基因工程菌，能够利用100mM甘氨酸和甲醛以70％以上的高反应收率合成D-丝氨酸。
日本专利(Japanese Published Unexamined PatentApplication No.61-152291)公开报导了通过微生物作用，由DL-羟甲基乙内酰脲生成N-氨基甲酰基-D-丝氨酸，然后水解得到D-丝氨酸的方法。
以上提及酶法制备D-丝氨酸的方法存在酶活低，L-丝氨酸分解不完全，需要进行DL-丝氨酸分离，生成的D-丝氨酸浓度低等不利因素，用作D-丝氨酸工业生产都有难度。
2、化学拆分法
2005年，秦为民等(化学试剂，2005)以2-N-(N’-苄基)脯氨酰-氨基-二苯甲酮甘氨酸席夫碱Ni(II)复合物与聚甲醛反应，生成2-N-(N’-苄基)脯氨酰-氨基-二苯甲酮丝氨酸席夫碱Ni(II)复合物，经水解制备了D-或L-丝氨酸。
2007年，吴刘洋等(氨基酸和生物资源，2007)以DL-丝氨酸为原料经过酯化、拆分和水解制备D-丝氨酸，总收率为74.8％，光学纯度达到98％以上。
2、物理拆分法
2007年，Seung-Hee Son等(Journal of Applied Polymer Science，2007)运用传统的制备反渗透膜的界面聚合技术制备了分子印迹复合膜，该膜能够有效的选择透过D-丝氨酸。当光学拆分外消旋丝氨酸时，D-丝氨酸的扩散速率比L-丝氨酸快，复合膜中的D-丝氨酸浓度会随着时间的延长而增加，当操作时间达60h时复合膜中丝氨酸对映体过量值为80％左右。
马云峰等(CN1900052，2007)以诱导结晶法制备左旋丝氨酸和右旋丝氨酸，收率96％以上。
三、发明内容
D-丝氨酸酶法转化制备过程中，反应条件温和，L-色氨酸合成酶专一性强，转化效率高，提取工艺简单，且产生高附加值的L-色氨酸。本发明的目的在于避免上述现有技术中的不足之处而提供一种高效、低成本的D-丝氨酸及L-色氨酸的制备方法。
本发明可以通过以下技术方案来达到：
D-丝氨酸酶法转化制备方法，其步骤为：
(1)色氨酸合成酶基因工程菌BA3(张绪梅等，生物技术通讯，2006)，在含有IPTG或乳糖的培养基中培养，诱导产生高活力的色氨酸合成酶；
(2)采用游离细胞法，将含酶细胞或酶提取液与缓冲液配制的含有DL-丝氨酸的转化液混合后，再加入适量的吲哚和表面活性剂，在30～50℃条件下进行酶促转化反应，最适转化温度35～45℃。
(3)将反应生成物进行分离，得到高纯度的D-丝氨酸，同时还得到L-色氨酸。
上述步骤(1)中的培养基碳源采用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖和/或乳糖，其浓度为1～20g/L，氮源采用有机氮源，如牛肉膏、酵母膏、玉米浆、蛋白胨、豆饼水解液和/或蛋白质水解物，其浓度为1～30g/L，加入IPTG或乳糖诱导，其浓度为0.05～10g/L。
上述步骤(2)的转化液缓冲体系为磷酸缓冲液、硼酸缓冲液和/或碳酸缓冲液，使转化液pH7.5～9.5，最适转化液pH8～9；在转化液中加入表面活性剂，如吐温-80，十六烷三甲基溴化铵(CTAB)，聚乙二醇辛基苯基醚(OP)，其浓度为0.005～5g/L。
上述步骤(3)中分离反应体系中D-丝氨酸和L-色氨酸的方法是采用等电点结晶法或等电点结晶与离子交换树脂分离相结合的方法。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
(1)本发明采用色氨酸合成酶基因工程菌BA3在优选的培养基中培养可以高产率的生成色氨酸合成酶，使反应有非常高的转化率和反应速率，D-丝氨酸及L-色氨酸的光学纯度达到99％以上。
(2)本发明采用游离细胞法转化DL-丝氨酸，同时制备得到D-丝氨酸及L-色氨酸，原料价格低廉，操作简便，大大提高反应速率，简化工艺流程。
(3)D-丝氨酸和L-色氨酸的理化性质差异很大，利用溶解度的差异就可以分离制备，成本低，工艺流程简单，适合工业化生产。
(4)具有原料来源丰富，价格低廉，转化时间短，操作简便，生产成本低等优点。
四、具体实施方式
实施例一
1.将1000mL发酵液离心得到的色氨酸合成酶基因工程菌20g加入到0.1mol/L磷酸缓冲液(pH8.5)配制的1000mL转化液中，转化液含6％DL-丝氨酸(g/mL)、33g吲哚和0.5％吐温-80(g/mL)溶液6mL，37℃酶促反应18h。反应液中析出白色固体物，反应体系中L-色氨酸浓度为5.5％，对L-丝氨酸摩尔转化率为95％。
2.将反应液4000rpm离心10min，收集湿细胞和白色固体混合物79g，用500mL纯水溶解固体混合物，滴加6mol/L NaOH调pH12～13，搅拌升温到60～80℃将固体L-色氨酸溶解完全，加活性炭脱色除菌体，滤液用6mol/L HCl调pH至5.9，酸化液冷却至室温，析出的结晶真空过滤，用少量纯水洗涤，烘干得33.2gL-色氨酸，比旋光度[α]D 20：-30.0°(C＝1，H2O)。
3.将890mL离心上清液与580mL L-色氨酸结晶母液合并，混合液用6mol/LHCl调pH至3.5，加纯水稀释到2000mL上氢型阳离子树脂柱，吸附饱和后，采用2％和4％氨水洗脱，分别收集洗脱液浓缩结晶、精制得L-色氨酸10.3g，比旋光度[α]D 20：-31.9°(C＝1，H2O)，D-丝氨酸23.5g，比旋光度[α]D 20：-13.9°(C＝5，5MHCl)，结晶母液循环使用。
实施例二
1.将1000mL发酵液离心得到的色氨酸合成酶基因工程菌21g加入到0.1mol/L磷酸缓冲液(pH8.8)配制的1000mL转化液中，转化液含10％DL-丝氨酸(g/mL)、55g吲哚和0.5％吐温-80(g/mL)溶液6mL，40℃酶促反应20h。反应液中析出白色固体物，反应体系中L-色氨酸浓度为8.9％，对L-丝氨酸摩尔转化率为92％。
2.将反应液4000rpm离心10min，收集湿细胞和白色固体混合物149g，用700mL纯水溶解固体混合物，滴加6mol/LNaOH调pH12～13，搅拌升温到60～80℃将固体L-色氨酸溶解完全，加活性炭脱色除菌体，滤液用6mol/L HCl调pH至5.9，酸化液冷却至室温，析出的结晶真空过滤，用少量纯水洗涤，烘干得60.6gL-色氨酸，比旋光度[α]D 20：-30.1°(C＝1，H2O)。
3.将880mL离心上清液与780mL L-色氨酸结晶母液合并，混合液用6mol/LHCl调pH至3.5，加纯水稀释到2200mL上氢型阳离子树脂柱，吸附饱和后，采用2％和4％氨水洗脱，分别收集洗脱液浓缩结晶、精制得L-色氨酸12.1g，比旋光度[α]D 20：-32.1°(C＝1，H2O)，D-丝氨酸39.5g，比旋光度[α]D 20：-13.8°(C＝5，5MHCl)，结晶母液循环使用。
实施例三
1.将1000mL发酵液离心得到的色氨酸合成酶基因工程菌22g加入到0.1mol/L碳酸钠缓冲液(pH9.5)配制的1000mL转化液中，转化液含15％DL-丝氨酸(g/mL)、83g吲哚和0.05％OP溶液(g/mL)6mL，37℃酶促反应22h。反应液中析出白色固体物，反应体系中L-色氨酸浓度为13.2％，对L-丝氨酸摩尔转化率为91％。
2.将反应液4000rpm离心10min，收集湿细胞和白色固体混合物175g，用900mL纯水溶解固体混合物，滴加6mol/L NaOH调pH12～13，搅拌升温到60～80℃将固体L-色氨酸溶解完全，加活性炭脱色除菌体，滤液用6mol/L HCl调pH至5.9，酸化液冷却至室温，析出的结晶真空过滤，用少量纯水洗涤，烘干得88.5gL-色氨酸，比旋光度[α]D 20：-29.8°(C＝1，H2O)。
3.将860mL离心上清液与980mL L-色氨酸结晶母液合并，混合液用6mol/LHCl调pH至3.5，加纯水稀释到2500mL上氢型阳离子树脂柱，吸附饱和后，采用2％和4％氨水洗脱，分别收集洗脱液浓缩结晶、精制得L-色氨酸17.3g，比旋光度[α]D 20：-31.7°(C＝1，H2O)，D-丝氨酸59.2g，比旋光度[α]D 20：-13.5°(C＝5，5MHCl)，结晶母液循环使用。
实施例四
1.将1000mL发酵液离心得到的色氨酸合成酶基因工程菌25g加入到0.1mol/L硼酸缓冲液(pH9.0)配制的1000mL转化液中，转化液含20％DL-丝氨酸(g/mL)、111g吲哚和0.05％CTAB(g/mL)6mL，45℃酶促反应26h。反应液中析出白色固体物，反应体系中L-色氨酸浓度为17％，对L-丝氨酸摩尔转化率为88％。
2.将反应液4000rpm离心10min，收集湿细胞和白色固体混合物220g，用1100mL纯水溶解固体混合物，滴加6mol/L NaOH调pH12～13，搅拌升温到60～80℃将固体L-色氨酸溶解完全，加活性炭脱色除菌体，滤液用6mol/L HCl调pH至5.9，酸化液冷却至室温，析出的结晶真空过滤，用少量纯水洗涤，烘干得106.2g L-色氨酸，比旋光度[α]D 20：-30.2°(C＝1，H2O)。
3.将830mL离心上清液与1200mL L-色氨酸结晶母液合并，混合液用6mol/LHCl调pH至3.5，加纯水稀释到2800mL上氢型阳离子树脂柱，吸附饱和后，采用2％和4％氨水洗脱，分别收集洗脱液浓缩结晶、精制得L-色氨酸19.2g，比旋光度[α]D 20：-31.4°(C＝1，H2O)，D-丝氨酸82.2g，比旋光度[α]D 20：-13.2°(C＝5，5MHCl)，结晶母液循环使用。
Claims (4)
1.一种D-丝氨酸酶法转化制备方法，其特征是由以下步骤构成：
(1)具有高活力L-色氨酸合成酶的基因工程菌，在含有IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)或乳糖的培养基中培养，产生高活力的L-色氨酸合成酶；
(2)用游离细胞法，将含酶细胞或酶提取液与缓冲液配制的含有DL-丝氨酸的转化液混合，再加入适量的吲哚、表面活性剂和磷酸吡哆醛，在30～50℃条件下进行酶促反应，最适转化温度35～45℃。将反应生成物进行分离，得到高纯度的D-丝氨酸，同时还得到L-色氨酸。
2.根据权利要求1所述D-丝氨酸酶法转化制备方法，其特征在于步骤(2)所用的DL-丝氨酸浓度为10g/L～500g/L，最适浓度为50g/L～300g/L，缓冲液包括磷酸缓冲液、碳酸缓冲液或硼酸缓冲液，使转化液pH7.5～9.5，最适转化液pH8～9。
3.根据权利要求1所述的D-丝氨酸酶法转化制备方法，其特征在于步骤(2)所述的表面活性剂包括吐温-80、十六烷基三甲基溴化铵和聚乙二醇辛基苯基醚，其浓度(g/L)为0.005～5.0。
4.根据权利要求1所述的D-丝氨酸酶法转化制备方法，其特征在于步骤(2)分离D-丝氨酸和L-色氨酸的方法为等电点结晶法或等电点结晶与离子交换树脂分离相结合的方法。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
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