CN101580864A - 一菌双酶生产光学纯l-丙氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一菌双酶生产光学纯L-丙氨酸的方法,包括摇瓶种子培养和发酵,利用一种假单胞菌产生两种酶:L-天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-β-脱羧酶,以富马酸铵盐为底物,直接生成L-丙氨酸,通过改变体系反应条件,加入L-丙氨酸消旋酶抑制剂,得到光学纯度的L-丙氨酸。本发明减少整个L-天冬氨酸生产环节及设备投资,减轻环境污染;L-丙氨酸收率高,光学纯度≥99.99%,满足特殊要求厂家对高光学纯度L-丙氨酸的需求。
Description
技术领域
本发明涉及L-丙氨酸的生产方法,具体涉及一种用酶法生产L-丙氨酸的方法。
背景技术
近年来,手性药物的研究方兴未艾,国内有多家生产手性药物的公司。不同的手性药物,表现在药效、副作用上有很大的差异。L-丙氨酸是一种广为使用的药物手性源,比如生产L-氨基丙醇、VB6、S-2-氯乙酸、安尿通等。
国内外企业在使用L-丙氨酸的过程中,对其光学纯度要求越来越高。低光学纯度的L-丙氨酸合成药物,在使用时发现疗效低、副作用大。因此,研究一种高光学纯度的L-丙氨酸生产工艺势在必行。
国内现有宁波科瑞生物工程公司、北京怡康盛达生物技术有限公司、安徽省科苑(集团)股份有限公司等多家公司均生产L-丙氨酸产品,产品有食品级和工业级,生产的方法大都是利用假单胞菌产生的L-天冬氨酸-β-脱羧酶,将L-天冬氨酸转化成L-丙氨酸。南京工业大学(南京化工大学)开展L-丙氨酸酶法合成的研究较早,利用假单胞菌获得高活性的L-天冬氨酸-β-脱羧酶,以L-天冬氨酸为底物,采用游离细胞法转化生产L-丙氨酸,平均收率为90%,产品质量达到美国药典XXIII版标准和日本味之素99版标准;并拥有酶法生产L-丙氨酸的发明专利,该技术可生产得到光学纯度的L-丙氨酸;同时成立了国家生化工程技术中心,中心拥有年产1000吨L-丙氨酸的生产技术。大连轻工业学院对中空纤维膜反应器,利用假单胞菌转化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸,转化率超过90%。中国药科大学也对L-丙氨酸酶法生产技术进行了研究,采用循环式生物反应器,利用固定化德阿昆合假单胞菌体的L-天冬氨酸-β-脱羧酶,转化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸。
已有的文献及专利有如下报道:
1、L-丙氨酸酶法工业生产的研究
在800升气升式发酵罐上配有假单胞菌Pse.NX-1,获得高L-天冬氨酸-β-脱羧酶酶活。以L-天冬氨酸为底物游离细胞法转化生产L-丙氨酸,每升培养液可转化L-天冬氨酸2kg,最高达2.5kg,提取得到L-丙氨酸1.2kg,平均收率90%,产品质量达到美国药典XXIII版标准和日本味之素99版标准。(《工业微生物》1997,27(2),17-20页);
2、利用假单胞菌天冬氨酸-β-脱羧酶高效生产L-丙氨酸
通过右边筛选得到一株具有高活性L-Asp-β-脱羧酶的菌株PseudomonasNX-1,对该株酶形成和酶反应的条件进行了详细的研究,该株可以高效地转化L-Asp生成L-Ala,转化4-5d,每L培养液可转化L-Asp量高达1400g左右,生成L-Ala浓度高达90%以上,摩尔转化率近100%。(《南京化工学院学报》1995,17(1),1-6页);
3、游离细胞法与固定化细胞法生产L-丙氨酸的比较
利用假单胞菌的L-天冬氨酸-β-脱羧酶从L-天冬氨酸为底物生产L-丙氨酸,具有2种方法,一种为游离细胞法,另一种为固定化细胞法。该文比较这2种方法的生产工艺、转化率、提取收率和生产成本后得出结论:采用游离细胞法生产L-丙氨酸优于固定化细胞法。(《工业微生物》1998,28(1),38-39,44页);4、D-天冬氨酸及L-丙氨酸的制备方法(《中国专利》申请(专利)号:02138553.X;公开(公告)号:CN1405317;公开(公告)日:2003.03.26)
该制备方法是培养假单胞菌属微生物,产生高活力的L-天冬氨酸β-脱羧酶,采用游离细胞法,将含酶细胞或培养液和DL-天冬氨酸或DL-天冬氨酸盐的溶液混合,32℃-45℃下进行酶反应,然后用等电点结晶结合离子交换树脂法分离反应生成物,得到高化学纯度和光学纯度的D-天冬氨酸和L-丙氨酸。
5、中空纤维膜反应器转化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸
采用中空纤维膜反应器,利用假单胞菌P.dacunhaeDQ-pl转化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸,最适pH6.0,最适温度30℃,EDTA和Tween-80对细胞产酶有促进作用,游离细胞半衰期为93h。采用对流扩散式中空纤维膜反应器转化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸,转化率超过90%。(《食品与发酵工业》2003,29(1),32-35页);
6、用循环式生物反应器酶法生产L-丙氨酸
用固定化德阿昆合假单胞(Pseudomonas dacunhae)菌体的L-天冬氨酸β-脱羧酶,在新设计的生物反应器中转化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸。该反应器能不断缓慢溶解固体L-天冬氨酸,使反应系统的pH和底物浓度维持恒定。用80g固定化菌体为酶源,在69h内能将4.2kgL-天冬氨酸全部转化生成L-丙氨酸,且仅消耗较少的PLP和氨水。(《药物生物技术》1997,4(4),212-215页)。
由上可知,现有的酶法生产L-丙氨酸的研究及生产报道,一般是利用假单胞菌产生L-天冬氨酸-β-脱羧酶,转化L-天冬氨酸生成L-丙氨酸,此法生产的产品光学纯度较低,一般≤95%,且生产环节多,成本高。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题,本发明的目的在于提供一菌双酶生产光学纯L-丙氨酸的方法,采用该方法生产的L-丙氨酸,其光学纯度及收率高、生产环节简化,成本低。
本发明为实现其目的所采取的技术方案包括摇瓶种子培养和发酵。本发明利用一种假单胞菌产生两种酶:L-天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-β-脱羧酶,以富马酸铵盐为底物,直接生成L-丙氨酸,通过改变体系反应条件,加入L-丙氨酸消旋酶抑制剂,得到光学纯度的L-丙氨酸。
L-天冬氨酸酶
底物:富马酸铵盐 产物:L-丙氨酸
种子培养基和培养条件(质量百分比,以下同):富马酸0.8~1.2%,蛋白胨0.8~1.2%,菌玉米浆0.6~0.8%,硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.01~0.03%,磷酸二氢钾(KH2PO4)0.01~0.02%,余量为纯净水,用氨水调pH值至6.0~8.0;培养温度29±2℃;
发酵培养基:谷氨酸钠1.0~2.0%,蛋白胨1.0~1.2%,玉米浆0.6~0.8%,硫酸镁0.01~0.02%,磷酸二氢钾(KH2PO4)0.01~0.03%,余量为纯净水,用氨水调pH值至6.0~8.0;
发酵培养条件:培养温度29±2℃,通风比1∶2,罐压0.05MPa。
具体技术参数:
①种子培养基和培养条件:富马酸1.0%,蛋白胨1.0%,玉米浆0.8%,硫酸镁0.02%,磷酸二氢钾0.01%,余量为纯净水,用氨水调pH值至7.0。在1000ml三角瓶中分装250ML培养基,接种后用摇床在29±2℃条件下培养24小时。
②发酵培养基:谷氨酸钠2.0%,蛋白胨1.0%,玉米浆0.8%,硫酸镁0.02%,0.01%磷酸二氢钾,余量为纯净水,用氨水调pH值至7.0。
③发酵培养条件:定容后,121℃灭菌15分钟,冷却后将培养好的种子液按1%接种量接种培养,培养温度29±2℃,通风比1∶2,罐压0.05MPa,培养过程测定菌体生长OD值、pH值和酶活力。
④转化条件:
转化温度50℃,转化pH值6.5。
⑤离心条件:
转化温度50℃,转化pH值6.5。
⑥提取条件:
脱色温度70℃。
⑦干燥条件:
干燥温度90℃,干燥时间15分钟。
本发明的有益效果:L-丙氨酸是一种具有光学活性的氨基酸,主要用于生产L-氨基丙醇、(S)-2-二氯乙酸。本发明减少整个L-天冬氨酸生产环节及设备投资,减轻环境污染;L-丙氨酸收率高,光学纯度≥99.99%,满足特殊要求厂家对高光学纯度L-丙氨酸的需求。
具体实施方式
本发明先进行无菌培养得到一级种子,再到发酵罐进行扩大培养产酶,在反应罐进行转化,然后离心、脱色、过滤、浓缩、结晶、离心、干燥,产品化验合格后入库。
实施例1
配种子液1000ml,种子液配比(质量百分比,以下同):富马酸1.0%,蛋白胨1.0%,玉米浆0.8%,硫酸镁0.02%,磷酸二氢钾0.01%,余量为纯净水,用氨水调pH值至7.0。分装在5只1000ml三角瓶灭菌后,30℃接种斜面,摇床培养15h,摇床转速为90r/min,接种100L发酵液,发酵液配比为谷氨酸钠2.0%,蛋白胨1.0%,玉米浆0.8%,硫酸镁0.02%,磷酸二氢钾0.01%,余量为纯净水,用氨水调pH值至7.0。发酵培养条件:培养温度29±2℃,通风比1∶2,罐压0.05MPa,培养26h。取发酵液配制500L转化液,加入富马酸铵盐25g,转化温度50℃,转化PH值6.5。70℃脱色,90℃干燥。得到产品21.24kg,产品光学纯度≥99.95%.
实施例2
配种子液2000ml,种子液配比为富马酸1.2%,蛋白胨1.1%,玉米浆0.9%,硫酸镁0.03%,磷酸二氢钾0.02%,余量为纯净水,用氨水调pH值至7.0。分装在10只1000ml三角瓶灭菌后,30℃接种斜面,摇床培养18h,摇床转速为100r/min,接种100L发酵液,发酵液配比为谷氨酸钠2.2%,蛋白胨1.1%,玉米浆0.9%,硫酸镁0.03%,磷酸二氢钾0.02%,余量为纯净水,用氨水调pH值至7.0。发酵培养条件:培养温度29±2℃,通风比1∶2,罐压0.05MPa,培养28h。取发酵液配制500L转化液,加入富马酸铵盐25g,转化温度55℃,转化PH值6.8。80℃脱色,100℃干燥。得到产品20.22kg,产品光学纯度≥99.95%.
实施例3
配种子液800ml,种子液配比为富马酸0.8%,蛋白胨0.8%,玉米浆0.6%,硫酸镁0.01%,磷酸二氢钾0.01%,余量为纯净水,用氨水调pH值至7.0。分装在4只1000ml三角瓶灭菌后,30℃接种斜面,摇床培养14h,摇床转速为110r/min,接种100L发酵液,发酵液配比为谷氨酸钠1.8%,蛋白胨0.9%,玉米浆0.6%,硫酸镁0.01%,磷酸二氢钾0.01%,余量为纯净水,用氨水调pH值至7.0。发酵培养条件:培养温度29±2℃,通风比1∶3,罐压0.05MPa,培养20h。取发酵液配制500L转化液,加入富马酸铵盐25g,转化温度45℃,转化PH值6.0。60℃脱色,80℃干燥。得到产品20.01kg,产品光学纯度≥99.95%.
本发明的优点如下:
(1)利用一种微生物(假单胞杆菌)产生两种酶,即L-天冬氨酸酶和L-天门冬氨酸-β-脱羧酶,利用全细胞作为催化剂生产光学纯L-丙氨酸。
(2)利用该种微生物,以富马酸铵盐为底物,直接生产光学纯L-丙氨酸。
(3)通过改变体系反应条件,加入抑制L-丙氨酸消旋酶活性的物质,生产的产品光学纯度≥99.99%。
本发明与国内外同类技术主要区别在于:
(1)本技术只需要培养一种微生物,产生两种酶,而国内外同类技术利用两种微生物,分别产生两种酶。
(2)本技术反应物直接使用富马酸铵盐作为原料,而国内外同类技术利用L-天门冬氨酸作为原料。
(3)本技术生产的产品光学纯度≥99.99%,而国内外同类技术生产的产品光学纯度≤95%。
(4)其它:由于本技术使用一菌双酶技术,与国内外同类技术相比:减少了生产过程,节约设备投资,减少环境污染,降低了生产成本。
Claims (1)
1、一菌双酶生产光学纯L-丙氨酸的方法,包括摇瓶种子培养和发酵,其特征在于:
a、利用一种假单胞菌产生两种酶:L-天冬氨酸酶、L-天冬氨酸-β-脱羧酶,以富马酸铵盐为底物,加入L-丙氨酸消旋酶抑制剂,得到光学纯度的L-丙氨酸;
b、种子培养基和培养条件(质量百分比):富马酸0.8~1.2%,蛋白胨0.8~1.2%,菌玉米浆0.6~0.8%,硫酸镁0.01~0.03%,磷酸二氢钾0.01~0.02%,余量为纯净水,用氨水调pH值至6.0~8.0;培养温度29±2℃;
c、发酵培养基(质量百分比):谷氨酸钠1.0~2.0%,蛋白胨1.0~1.2%,玉米浆0.6~0.8%,硫酸镁0.01~0.02%,磷酸二氢钾0.01~0.03%,余量为纯净水,用氨水调pH值至6.0~8.0;
发酵培养条件:培养温度29±2℃,通风比1∶2,罐压0.05MPa。
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