CN102660626A - 一种生物拆分制备n-甲基-d-天门冬氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物拆分制备N-甲基-D-天门冬氨酸的方法，以谷氨酸或谷氨酸钠作为碳源，蛋白胨、酵母膏、酵母浸粉和玉米浆干粉至少一种原料作为氮源在培养基上培养假单胞菌1154(Pseudomonas1154)菌株，生成高活力的N-甲基-L-天门冬氨酸-β-脱羧酶；然后和N-甲基-DL-天门冬氨酸盐溶液混合进行酶不对称催化反应；最后分离反应生成物，得到N-甲基-D-天门冬氨酸。本发明原材料成本低廉、反应步骤少，反应条件温和、时间短，产品容易分离、纯度高，适合大生产的需要。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物拆分制备N-甲基-D-天门冬氨酸的方法。
背景技术
N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)是D-天门冬氨酸的甲基化产物，白色，分子式为C5H9NO4，分子量为147，易溶于水，化学稳定性良好，但吸湿性较强，易潮解。NMDA一般仅存在于动物的神经和内分泌组织中，对神经和内分泌具有重要的调控作用。NMDA是神经兴奋性氨基酸递质天门冬氨酸和谷氨酸的强效激活剂，适量的NMDA能够显著促进动物腺垂体中生长激素（GH）、黄体生长素（LH）、促性腺激素释放激素（CnRH）以及催乳素（PRL）的分泌。
目前N-甲基-D-天门冬氨酸主要采用化学合成法生产。蒋光玉等在其论文《N-甲基-D-天门冬氨酸的合成》中提到：在室温条件下，以D-天门冬氨酸为主要原料，首先与甲醇和氯化亚砜发生酯化反应，合成D-天门冬氨酸二甲酯盐酸盐（DDAH）。DDAH在DMF溶液中，以K2CO3为缚酸剂，然后向其中缓慢滴加CH3I，在室温条件下反应16h，生成N-甲基-D-天门冬氨二甲酯。然后在碱性条件下，向N-甲基-D-天门冬氨二甲酯溶液中加入乙酸乙酯、石油醚和纯化水混合液，反应30min后，用4mol/LHCl调节pH值5.00-6.00，减压过滤获得白色晶体，然后用纯化水和石油醚1:1的混合液洗涤三次，干燥后获得N-甲基-D-天门冬氨酸晶体。
采用以上制备方法存在原材料成本高、反应步骤多、时间长、产品不易分离及废液中含有毒物质等缺点。
发明内容
针对上述现有技术存在的问题，本发明提供了一种生物拆分制备N-甲基-D-天门冬氨酸的方法，其原材料成本低廉、反应步骤少，反应条件温和、时间短，产品容易分离、纯度高，适合大生产的需要。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种生物拆分制备N-甲基-D-天门冬氨酸的方法，包括以下步骤：
（1）以10-25g/L的谷氨酸或谷氨酸钠作为碳源，15-25g/L蛋白胨、15-25g/L酵母膏、15-25g/L酵母浸粉和10-20g/L玉米浆干粉至少一种原料作为氮源在培养基上培养假单胞菌1154(Pseudomonas 1154)菌株，生成高活力的N-甲基-L-天门冬氨酸-β-脱羧酶；
（2）将上述培养液和N-甲基-DL-天门冬氨酸盐溶液混合进行酶不对称催化反应；
（3）然后分离反应生成物，最后得到N-甲基-D-天门冬氨酸。
所述步骤（1）培养假单胞菌1154(Pseudomonas 1154)菌株时，培养温度为30℃-40℃，时间15h-30h。
所述步骤（2）中N-甲基-DL-天门冬氨酸盐为N-甲基-DL-天门冬氨酸的钠盐、钾盐或铵盐。
所述步骤（2）酶不对称催化反应时，pH值为4.00-8.00，温度为25℃-58℃。
所述步骤（3）分离提取N-甲基-D-天门冬氨酸的方法为等电点结晶法，pH值调整为2.00-3.00。
本发明的有益效果是：通过培养微生物假单胞菌得到高活力的N-甲基-L-天门冬氨酸-β-脱羧酶，该酶具有高专一性，能够得到光学纯度接近100%的N-甲基-D-天门冬氨酸；酶反应的底物为N-甲基-DL-天门冬氨酸的钠盐、钾盐或铵盐，原材料单一、易得；酶反应时pH值为4.00-8.00，温度为25℃-58℃，时间为24h-72h，反应条件温和，时间短，适合大生产的需要；本发明采用游离细胞一步酶法拆分N-甲基-DL-天门冬氨酸得到N-甲基-D-天门冬氨酸，反应步骤少，操作简单。
具体实施方式
N-甲基-L-天门冬氨酸-β-脱羧酶可以催化N-甲基-L-天门冬氨酸脱羧反应生成N-甲基-L-丙氨酸，而对其光学异构体N-甲基-D-天门冬氨酸则完全不发生作用，产生该酶的菌种有假单胞菌、产气荚膜梭菌属、无色杆菌属、诺卡氏菌属等。
培养这些微生物，利用其产生的N-甲基-L-天门冬氨酸-β-脱羧酶作用N-甲基-DL-天门冬氨酸溶液，可以不对称催化其中的N-甲基-L-天门冬氨酸生成N-甲基-L-丙氨酸，而其光学异构体N-甲基-D-天门冬氨酸则完全不参加反应。利用N-甲基-D-天门冬氨酸在酸性条件下溶解性小的特性，调节反应溶液pH值2.00-3.00，则其从反应体系中结晶出来，而N-甲基-L-丙氨酸则溶解在溶液中，从而达到分离的目的。
以下是实施例，将对本发明作进一步说明，但对本说明没有限制。
实施例1
配制含蛋白胨20g/L，谷氨酸钠15g/L，玉米浆干粉18g/L，甘油5g/L，硫酸镁0.2g/L，磷酸二氢钾1g/L的培养基10L，用氢氧化钠或盐酸调整pH值到7.00-7.20，分装入1000ml三角烧瓶中，每瓶250ml。将上述培养基于121℃灭菌30min，冷却备用。将保存在斜面上的假单胞菌1154菌株用ф1mm接种环按每瓶一环的量接入上述培养基中。温度33℃，湿度45%，摇床转速120rpm ，培养20h。
合并上述细胞培养液，加入到10L含有20%N-甲基-DL-天门冬氨酸钠的溶液中，维持pH值5.00-7.00，温度40℃，反应48h。
转化液于3000rpm，离心30min，收集上清液；活性炭0.8%，温度70℃，脱色45min，减压过滤；脱色液用浓硫酸调节pH值为2.00，析出白色晶体；减压过滤获得白色晶体，然后用无水乙醇洗涤三次，置于干燥箱中干燥后得到N-甲基-D-天门冬氨酸晶体。
实施例2
配制含蛋白胨20g/L，酵母浸粉20g/L，谷氨酸20g/L，氯化钠 15g/L ，玉米浆干粉15g/L ,硫酸镁0.2g/L，磷酸二氢钾1g/L的发酵液7L，调整pH值7.00-7.20，将上述培养基加到10L发酵罐中，121℃灭菌30min，冷却。按10%接种量接入假单胞菌1154菌株，温度33℃，搅拌转速400rpm，通风比1：0.2，培养22h。
向上述细胞培养液加入N-甲基-DL-天门冬氨酸铵700g，维持pH值4.00-8.00，温度40℃，反应48h。
转化液于3000rpm，离心30min，收集上清液；活性炭0.8%，温度70℃，脱色45min，减压过滤；脱色液用浓硫酸调节pH值为2.60，析出白色晶体；减压过滤获得白色晶体，然后用无水乙醇洗涤三次，置于干燥箱中干燥后得到N-甲基-D-天门冬氨酸晶体。
实施例3
同实施例2培养基配方，在10T罐中配制培养基7T，按0.5接种量接入假单胞菌1154菌株，温度33℃，搅拌转速150rpm，通风比1：0.2，培养22h。
在转化罐中，将上述细胞培养液升温至40℃，维持pH4.00-8.00，不断流加30%浓度的N-甲基-DL-天门冬氨酸钠溶液进行酶促反应； 转化结束后，活性炭1.0%，80℃，脱色60min，板框过滤；脱色液用浓硫酸调节pH值为3.00，析出白色晶体；离心洗涤后，采用沸腾式干燥机干燥得到N-甲基-D-天门冬氨酸晶体。
Claims (5)
1.一种生物拆分制备N-甲基-D-天门冬氨酸的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）以10-25g/L的谷氨酸或谷氨酸钠作为碳源，15-25g/L蛋白胨、15-25g/L酵母膏、15-25g/L酵母浸粉和10-20g/L玉米浆干粉至少一种原料作为氮源在培养基上培养假单胞菌1154(Pseudomonas 1154)菌株，生成N-甲基-L-天门冬氨酸-β-脱羧酶；
（2）将上述培养液和N-甲基-DL-天门冬氨酸盐溶液混合进行酶不对称催化反应；
（3）然后分离反应生成物，最后得到N-甲基-D-天门冬氨酸。
2.根据权利要求1所述的一种生物拆分制备N-甲基-D-天门冬氨酸的方法，其特征在于所述步骤（1）培养假单胞菌1154(Pseudomonas 1154)菌株时，培养温度为30℃-40℃，时间15h-30h。
3.根据权利要求1所述的一种生物拆分制备N-甲基-D-天门冬氨酸的方法，其特征在于所述步骤（2）中N-甲基-DL-天门冬氨酸盐为N-甲基-DL-天门冬氨酸的钠盐、钾盐或铵盐。
4.根据权利要求1所述的一种生物拆分制备N-甲基-D-天门冬氨酸的方法，其特征在于所述步骤（2）酶不对称催化反应时，pH值为4.00-8.00，温度为25℃-58℃。
5. 根据权利要求1所述的一种生物拆分制备N-甲基-D-天门冬氨酸的方法，其特征在于所述步骤（3）分离提取N-甲基-D-天门冬氨酸的方法为等电点结晶法，pH值调整为2.00-3.00。
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