CN101586131A - 一种制备l-天冬氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用富马酸发酵液制备天冬氨酸酶以及L－天冬氨酸的方法。方法包括两个部分，一是富马酸发酵液的清液部分培养大肠杆菌生产天冬氨酸酶，二是利用发酵液的固体沉淀部分富马酸钙与硫酸铵反应生成富马酸铵，经过浓缩后在天冬氨酸酶的作用下生成L－天冬氨酸。该种方法实现了以糖基路线生产L－天冬氨酸，实现了富马酸发酵液全利用以至达到节能减排的目标，有效的降低了L－天冬氨酸的生产成本，减少了对环境的污染，使得L－天冬氨酸得到可持续的生产，具有较广的工业化生产前景。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及用富马酸发酵液制备L-天冬氨酸的方法。
背景技术
L-天冬氨酸(L-Aspartic acid，缩写为L-Asp)，化学名称α-氨基丁二酸。L-天冬氨酸作为一种常见的酸性氨基酸，在医药、食品、美容、化工、材料等方面具有非常广泛的用途。以天冬氨酸为唯一单体的新型可生物降解高分子材料聚天冬氨酸应用越来越广泛；天冬氨酸还是新型甜味剂阿斯巴甜的两大原料之一，同时它还是L-赖氨酸及嘌呤、嘧啶碱基的合成前体，作为K+、Mg2+离子载体向心肌输送电解质，用于改善心肌功能。因此，天冬氨酸市场应用前景越来越被人所看好。
现有技术中，L-天冬氨酸的生产方法主要有蛋白质水解提取法、微生物发酵法、化学合成法、酶催化转化法。
蛋白质水解提取法是从天然蛋白质的水解液中提取L-天冬氨酸，但由于其产量低，产物分离纯化困难，成本高，现已很少使用。
微生物发酵法主要是利用微生物利用葡萄糖等作为碳源直接发酵得到天冬氨酸的方法。日本科学家在微生物发酵法生产天冬氨酸方面开展了大量的工作，内尾等报道用Brev.flavum的谷氨酸缺陷型突变株，在含3.6％葡萄糖的培养基中，30℃培养4天，生产天冬氨酸4g/L(内尾良辅等：特许公报38836(1972))；椎尾等用Brev.flavum的柠檬酸合成酶缺失株，在含3.6％葡萄糖的培养基中，30℃培养2天，生产天冬氨酸10.6g/L(椎尾等.公开特许公报，昭57-107184)；后来椎尾等还进一步用Brev.flavum的丙酮酸激酶缺失株，在限制生物素条件下，培养2天，由100g/L葡萄糖生产天冬氨酸22.6g/L(椎尾等，第61回日本生化学会大学抄录，P.795(1988))；后藤等用5％葡萄糖培养基培养佛拉氏链霉菌生成天冬氨酸1.0g/L(后藤等：公开特许公报28836(1976))。微生物发酵法的缺点在于其生产周期均较长，产酸率较低，难于实现L-天冬氨酸的工业化连续生产。
国内外文献报道的化学合成工艺主要有两种，一种是由马来酸酐、氨气为原料，分别以二氧六环、二甲苯为溶剂进行一系列反应，最后催化加氢合成DL-天冬氨酸；第二种方法是以丙二酸二乙酯、醋酸、亚硝酸钠为原料进行一系列反应来合成。但这两种方法工艺流程均特别长，难以大规模工业化生产，同时上述工艺副产物多，且产物为光学消旋体DL-天冬氨酸，需进行光学拆分，成本高。
酶催化转化法是目前产业化制备天冬氨酸的主要方法，是以富马酸铵或富马酸和氨水为原料，在天冬氨酸酶的催化作用下制得天冬氨酸。如木住等用含6.5％富马酸铵的培养基，培养大肠杆菌突变株，37℃振荡培养1天后，静置3天，生成天冬氨酸56g/L(木住等：特许公报38831(1978))；王雪根等采用含富马酸铵0.4％、富马酸钠2％以及其他营养物的培养基培养大肠杆菌ATCC11303，采用固定细胞和游离细胞催化富马酸铵转化为L-天冬氨酸，摩尔转化率为98％～99％(工业微生物，2000，30(1)：32～35.)。对于产天冬氨酸酶的微生物而言大肠杆菌等微生物在其培养产酶过程中均需加入富马酸(盐)作为产酶培养的必须条件，至富集产酶后再用于天冬氨酸的催化生产。
而现有技术的工艺中所用的富马酸原料均来源于顺酐异构法制备，为石油基产品，而随着化石资源的日益紧缺，其生产成本日益偏高；同时随着化石资源的枯竭也必将影响L-天冬氨酸的可持续性生产。于是，富马酸原料来源的变更将成为大势所趋，需要形成一个全新的生产L-天冬氨酸的工艺路线。
发明内容
本发明的技术目的在于提供一种利用新的制备L-天冬氨酸的方法，该方法可以避免使用现有技术的石油基来源的富马酸底物，将发酵法制备富马酸的物料及产物最大化地合理利用，通过该方法天冬氨酸来源于糖基原料，比当前发酵法制备天冬氨酸的转化率高，可以大幅节约生物来源L-天冬氨酸的制备成本。
为了实现本发明的技术目的，本发明采用的技术方案如下：
一种制备L-天冬氨酸的方法，其特征在于将微生物发酵法得到的富马酸发酵液的清液部分用于富集天冬氨酸酶微生物的培养，收获富集天冬氨酸酶的微生物菌体，将其添加至由富马酸发酵液的沉淀部分制备而得的富马酸铵底物中进行酶催化反应得到L-天冬氨酸。
本发明所述的微生物发酵法得到的富马酸发酵液指的是现有技术中任何的利用微生物发酵制备富马酸的方法得到的富马酸发酵液，该发酵液主要包含沉淀部分和清液部分。其中，所述的沉淀部分包括由于在富马酸培养过程中为了防止富马酸产物抑制而加入的中和剂碳酸钙与产物富马酸结合而得到的富马酸钙沉淀，以及发酵微生物菌体；所述的清液即残余的发酵培养基，主要含有少量溶解的富马酸以及残余葡萄糖等未被完全利用的营养成分等，其中富马酸的含量为0.3％～0.8％(w/v)，葡萄糖含量为0～1％(w/v)；
本发明所述的产天冬氨酸酶微生物为现有技术中任何可以利用富马酸为诱导底物产天冬氨酸酶的微生物菌种，主要包括大肠杆菌；
本发明所述的将微生物发酵法得到的富马酸发酵液的清液部分用于培养产天冬氨酸酶微生物的富集培养并产酶的方法为：
(1)配制用于产天冬氨酸酶微生物的产酶培养基
将发酵法制备富马酸工艺的清液部分，加入产天冬氨酸酶微生物培养必需的营养物质，配制成产酶培养基；
其中，所述产天冬氨酸酶培养基所需添加的营养物质包括：蛋白胨0～6g/L，牛肉膏0～4g/L，玉米干粉0～10g/L，硫酸镁0～0.25g/L，硫酸二氢钾0～0.5g/L，氯化钠0～1g/L，pH 7.0(用氨水调节)；
(2)富集天冬氨酸酶微生物的培养
取一环生长良好的斜面种子于产酶培养基中，37℃，180r/min下恒温摇床培养12～16h得到种子液。将种子液以10％(v/v)接种量转接到产酶培养基中进行扩大培养，温度37℃，通风0.6～0.8vvm，搅拌转速150r/min，培养14～16h，收获菌体细胞。
本发明所述的由富马酸发酵液的沉淀部分制备而得的富马酸铵底物的制备方法为：按照富马酸钙与硫酸铵的摩尔比为1∶1.2～1∶1.5的比例，向富马酸发酵液中的固体沉淀部分中加入硫酸铵，在80℃的条件下反应1～2小时，结束后过滤硫酸钙、菌体细胞等固体物质获得富马酸铵溶液，并将其浓缩至100～300g/L。
本发明所述的酶催化反应制备L-天冬氨酸的方法为：将发酵获得的产天冬氨酸酶微生物细胞(湿重)按1％～5％的添加量加入到富马酸铵底物中，置于温度为30～37℃，搅拌转速50～100r/min，转化反应3～5小时，过滤除菌体，滤液中加入硫酸调pH至2.8～2.9，获得L-天冬氨酸晶体。
本发明的有益效果在于：
(1)天冬氨酸产业的传统制备方法中所使用的富马酸底物来源于顺酐异构法制备，为石油基产品，而随着化石资源的日益紧缺，利用该方法生产成本日益偏高；而传统的富马酸发酵产业中，发酵液的清液部分往往被作为废水处理，而其中少量的富马酸及葡萄糖等被白白浪费而未被有效利用。通常，现有技术中富马酸发酵液的清液中的富马酸的含量为0.3％～0.8％，可作为微生物产天冬氨酸酶的培养基中需要添加的诱导物富马酸。因此，本发明将发酵富马酸结束后的发酵清液进行再次利用，用于富集天冬氨酸酶微生物的培养，变废为宝，节约了天冬氨酸制备工艺的生产成本；
(2)本发明所述的富马酸发酵液的沉淀部分通过加入硫酸铵、过滤等得到的富马酸铵底物溶液，可以直接用于酶转化反应生产L-天冬氨酸；而且富马酸铵底物的来源也是可再生的糖基资源，更加有利于L-天冬氨酸的可持续性生产；
(3)本发明直接利用富马酸发酵液制备天冬氨酸酶及L-天冬氨酸，使用于现有技术中任何可产天冬氨酸酶的微生物，因此没有任何的微生物的使用限制，适用领域广；而且无论从酶转化底物还是产酶培养基的来源，都是有效结合了富马酸发酵工业的现有工艺，且无需额外处理，有效地降低L-天冬氨酸的生产成本，具备优异的工业化生产前景；
附图说明
图1制备L-天冬氨酸的工艺流程图
具体实施方式
实施例1
富马酸发酵液：
采用米根霉(Rhizopus oryzae ME-F12)菌株，发酵培养基配方为：葡萄糖130g/L，尿素0.06g/L，KH2 PO4 0.6g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，ZnSO4·7H2O 0.0176g/L，FeSO4·7H2O 0.000498g/L，CaCO3为葡萄糖浓度的60％，pH为5.5。发酵条件见文献(中国生物工程杂志，2008，28(4)：59～64)。发酵结束后，发酵液中富马酸(钙盐)浓度为66.5g/L，残余葡萄糖浓度7.8g/L，清液中富马酸浓度为4.6g/L。
菌种：大肠杆菌(E.coli ATCC 11303)
(1)配制用于产天冬氨酸酶微生物的产酶培养基
向富马酸发酵液的清液在其中加入营养物质：牛肉膏2g/L，蛋白胨6g/L，硫酸镁0.25g/L，硫酸二氢钾0.5g/L，氯化钠1g/L，用氨水调节至pH 7.0；
(2)富集天冬氨酸酶微生物的培养
取一环生长良好的斜面种子于装有30mL上述产酶培养基的250mL摇瓶中，置于温度为37℃、转速为180r/min的摇床上，震荡培养12h得到种子液；将种子液以10％(v/v)接种量转接到产酶培养基中进行扩大培养，温度37℃，通风0.8vvm，搅拌转速150r/min，培养16h，收获菌体细胞。
(3)富马酸铵底物的制备
按照富马酸钙与硫酸铵的摩尔比为1∶1.2的比例，向富马酸发酵液中的固体沉淀部分中加入硫酸铵，在80℃的条件下搅拌反应1小时，将过滤获得的富马酸铵溶液稀释至100g/L(以富马酸计)，加入氨水调整pH至8.5。
(4)细胞酶催化转化产L-天冬氨酸
向转化底物中加入1％(w/v)的富集天冬氨酸酶的菌体(湿重)，在温度37℃，搅拌转速50r/min的条件下，转化3小时结束反应，过滤除菌体细胞，加入硫酸调整滤液pH值至2.85，收集L-天冬氨酸晶体。
(5)结果如表1
表1转化结果
实施例2
本实施例与实施例1方法相同，条件改变。
富马酸发酵液：
采用米根霉(Rhizopus oryzae ME-F12)菌株，发酵培养基配方为：葡萄糖130g/L，尿素0.06g/L，KH2PO4 0.6g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，ZnSO4·7H2O 0.0176g/L，FeSO4·7H2O 0.000498g/L，CaCO3为葡萄糖浓度的60％，pH为5.5。发酵条件见文献(中国生物工程杂志，2008，28(4)：59～64)。发酵结束后，发酵液中富马酸(钙盐)浓度为62g/L，残余葡萄糖浓度10.3g/L，清液中富马酸浓度为4.2g/L。
菌种：大肠杆菌(E.coli ATCC 11303)
(1)配制用于产天冬氨酸酶微生物的产酶培养基
向富马酸发酵液的清液中加入营养物质：玉米干粉10g/L，蛋白胨4g/L，pH 7.0(用氨水调节)；
(2)富集天冬氨酸酶细胞的培养
取一环生长良好的斜面种子于装有30mL上述产酶培养基的250mL摇瓶中，置于温度为37℃、转速为180r/min的摇床上，震荡培养16h得到种子液；将种子液以10％(v/v)接种量转接到产酶培养基中进行扩大培养，温度37℃，通风0.6vvm，搅拌转速150r/min，培养14h，收获菌体细胞。
(3)富马酸铵底物的制备
按照富马酸钙与硫酸铵的摩尔比为1∶1.5的比例，向富马酸发酵液中的固体沉淀部分中加入硫酸铵，在80℃的条件下搅拌反应2小时，将过滤获得的富马酸铵溶液浓缩至200g/L(以富马酸计)，加入氨水调整pH至8.5。
(4)细胞酶催化转化产L-天冬氨酸
向转化底物中加入2％(w/v)的富集天冬氨酸酶的菌体(湿重)，在温度30℃，搅拌转速100r/min的条件下，转化5小时结束反应，过滤除细胞，加入硫酸调整滤液pH值至2.8，收集L-天冬氨酸晶体。
(5)结果如表2
表2转化结果
实施例3
本实施例与实施例1方法和菌种、富马酸发酵液来源相同，条件改变。
(1)配制用于产天冬氨酸酶微生物的产酶培养基
向富马酸发酵液的清液中加入营养物质：玉米干粉8g/L，牛肉膏4g/L，硫酸镁0.20g/L，硫酸二氢钾0.4g/L，pH 7.0(用氨水调节)；
(2)富集天冬氨酸酶细胞的培养
取一环生长良好的斜面种子于装有30mL上述产酶培养基的250mL摇瓶中，置于温度为37℃、转速为180r/min的摇床上，震荡培养14h得到种子液；将种子液以10％(v/v)接种量转接到产酶培养基中进行扩大培养，温度37℃，通风0.7vvm，搅拌转速150r/min，培养15h，收获菌体细胞。
(3)富马酸铵底物的制备
按照富马酸钙与硫酸铵的摩尔比为1∶1.4的比例，向富马酸发酵液中的固体沉淀部分中加入硫酸铵，在80℃的条件下搅拌反应1.5小时，将过滤获得的富马酸铵溶液浓缩至300g/L(以富马酸计)，加入氨水调整pH至8.5。
(4)细胞酶催化转化产L-天冬氨酸
向转化底物中加入5％(w/v)的富集天冬氨酸酶的菌体(湿重)，在温度34℃，搅拌转速70r/min的条件下，转化4小时结束反应，过滤除细胞，加入硫酸调整滤液pH值至2.9，收集L-天冬氨酸晶体。
(5)结果如表3
表3转化结果
Claims (6)
1、一种制备L-天冬氨酸的方法，其特征在于将微生物发酵法得到的富马酸发酵液的清液部分用于富集天冬氨酸酶微生物的培养，收获富集天冬氨酸酶的微生物菌体，将其添加至由富马酸发酵液的沉淀部分制备而得的富马酸铵底物中进行酶催化反应得到L-天冬氨酸。
2、根据权利要求1所述的一种制备L-天冬氨酸的方法，其特征在于所述的将微生物发酵法得到的富马酸发酵液的清液部分用于培养产天冬氨酸酶微生物的富集培养并产酶的方法为：
(1)配制用于产天冬氨酸酶微生物的产酶培养基
将发酵法制备富马酸工艺的清液部分，加入产天冬氨酸酶微生物培养必需的营养物质，配制成产酶培养基；
(2)富集天冬氨酸酶微生物的培养
取一环生长良好的斜面种子于产酶培养基中，37℃，180r/min下恒温摇床培养12～16h得到种子液；将种子液以10％(v/v)接种量转接到产酶培养基中进行扩大培养，温度37℃，通风0.6～0.8vvm，搅拌转速150r/min，培养14～16h，收获菌体细胞。
3、根据权利要求2所述的一种制备L-天冬氨酸的方法，其特征在于所述的步骤(1)中产天冬氨酸酶培养基所必需的营养物质包括：蛋白胨0～6g/L，牛肉膏0～4g/L，玉米干粉0～10g/L，硫酸镁0～0.25g/L，硫酸二氢钾0～0.5g/L，氯化钠0～1g/L，pH 7.0。
4、根据权利要求1所述的一种制备L-天冬氨酸的方法，其特征在于所述的由富马酸发酵液的沉淀部分制备而得的富马酸铵底物的制备方法为：按照富马酸钙与硫酸铵的摩尔比为1∶1.2～1∶1.5的比例，向富马酸发酵液中的固体沉淀部分中加入硫酸铵，在80℃的条件下反应1～2小时，结束后过滤硫酸钙、菌体细胞等固体物质获得富马酸铵溶液，并将其浓缩至100～300g/L。
5、根据权利要求1所述的一种制备L-天冬氨酸的方法，其特征在于所述的酶催化反应制备L-天冬氨酸的方法为：将发酵获得的产天冬氨酸酶微生物细胞(湿重)按1％～5％的添加量加入到富马酸铵底物中，置于温度为30～37℃，搅拌转速50～100r/min，转化反应3～5小时，过滤除菌体，滤液中加入硫酸调pH至2.8～2.9，获得L-天冬氨酸晶体。
6、根据权利要求1、2、5之一所述的一种制备L-天冬氨酸的方法，其特征在于所述的产天冬氨酸酶微生物为大肠杆菌。
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Legal Events
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Granted publication date: 20111228 Termination date: 20170612 |