CN117586928B - 一种肥料用天冬氨酸的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种肥料用天冬氨酸的制备方法，涉及天冬氨酸制备技术领域。具体制备过程为将富马酸和氨水混合得到混合液，向混合液中加入碳酸氢铵混合后，调节pH为6‑7，加入酶原，进行酶反应，反应结束分离收集天冬氨酸。本发明在实施过程中发现富马酸和氨水的质量比以及碳酸氢铵的含量会明显影响反应效率，控制所述的富马酸、氨水和水的质量比为10:11‑13:77‑79，碳酸氢铵与混合液的质量比为10‑25g:1kg时，能够明显提高反应效率，另外提供的制备方法产物分离简单，反应过程稳定，对环境污染小，与中微量元素复配性好。

Description

一种肥料用天冬氨酸的制备方法
技术领域
本发明涉及天冬氨酸制备技术领域，具体涉及一种肥料用天冬氨酸的制备方法。
背景技术
L-天冬氨酸（L-Aspartic acid，缩写为L-Asp），化学名称α-氨基丁二酸。kg-天冬氨酸作为一种常见的酸性氨基酸，在医药、食品、美容、化工、材料等方面具有非常广泛的用途。以天冬氨酸为唯一单体的新型可生物降解高分子材料聚天冬胺酸应用越来越广泛；天冬氨酸是新型甜味剂阿斯巴甜的两大原料之一，同时还是L-赖氨酸及嘌呤、嘧啶碱基的合成前体，作为K+、Mg2+离子载体向心肌输送电解质，用于改善心肌功能；天冬氨酸作为氨基酸水溶肥料的重要原料，其与中量元素钙镁及微量元素铜铁锰锌硼等微量元素的复配性越来越成为限制其应用的因素因此，天冬氨酸肥料领域的市场应用前景越来越受到关注。
现有技术中，L-天冬氨酸的生产方法主要有蛋白质水解提取法、微生物发酵法、化学合成法、酶催化转化法。
蛋白质水解提取法是从天然的水解液中提取L-天冬氨酸，但是由于其产量低，产物分离纯化困难，成本较高，现已很少使用。
微生物发酵法主要是微生物利用葡萄糖等作为碳源直接发酵得到天冬氨酸的方法，但微生物发酵法具有生产周期长、产酸率较低，难以实现L-天冬氨酸的工业化连续生产等缺点。
文献报道的化学合成工艺主要有两种：一种是由马来酸酐、氨气为原料，分别以二氧六环、二甲苯为溶剂进行一系列反应，最后催化加氢合成DL-天冬氨酸；第二种方法是以丙二酸二乙酯、醋酸、亚硝酸钠为原料进行一系列反应合成。但这两种方法工艺流程均特别长，难以实现工业化生产，同时上述工艺副产物多，且产物为光学消旋体DL-天冬氨酸，需进行光学拆分，成本高。
酶催化转化法是目前产业化制备天冬氨酸的主要方法，是以富马酸铵或富马酸或氨水为原料，在天冬氨酸酶的催化作用下制得天冬氨酸。如王雪根等采用含富马酸铵0.4%、富马酸钠2%以及其他营养物的培养基培养大肠杆菌ATCC11303，采用固定细胞和游离细胞催化富马酸铵转化为L-天冬氨酸，摩尔转化率为98-99%（工业微生物，2000，30（1）：32-35.）。对于产天冬氨酸酶的微生物而言大肠杆菌等微生物在其培养产酶过程中均需加入富马酸（盐）作为产酶培养的必须条件，至富集产酶后在用于天冬氨酸的催化生产。
中国专利CN101586131A中公开了一种制备L-天冬氨酸的方法，方法包括两部分，一是富马酸发酵液的清液部分培养大肠杆菌生产天冬氨酸酶，二是利用发酵液的固体沉淀部分富马酸钙与硫酸铵反应生产L-天冬氨酸。该方法实现了以糖基路线生产L-天冬氨酸，实现了富马酸发酵液全利用达到了节能减排的目标，有效降低了L-天冬氨酸的生产成本，减少了环境污染，使得L-天冬氨酸得到可持续生产，但是该方法制备的天冬氨酸不适合用于生肥料。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明旨在提供一种肥料用天冬氨酸的制备方法，该方法中通过控制富马酸和氨水的质量比，并向发酵混合液中加入碳酸氢铵、二价金属离子后明显提高了天冬氨酸的生成含量。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案实现：
一种肥料用天冬氨酸的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）将大肠杆菌于培养基中发酵培养，发酵液离心，得到含天冬氨酸酶的菌体；
（2）将步骤（1）中得到的含天冬氨酸酶的菌体进行活化，得到活化后的酶原；
（3）将富马酸和水混合，然后加入氨水混匀后得到混合液，向混合液中加入碳酸氢铵混合后，调节pH为6-7，加入步骤（2）制备的酶原，进行酶反应，反应结束分离收集天冬氨酸。
上述步骤（1）中所述的大肠杆菌ATCC 8739，所述的大肠杆菌为商业购买得到。
上述步骤（1）中所述的培养基成分包括：葡萄糖4%、酵母粉0.5%、胰蛋白胨0.5%、尿素1%、磷酸氢二钾0.3%、硫酸镁0.5%、氯化锌0.1%、氯化钠0.1%。
上述步骤（2）中所述的活化具体步骤为：将含天冬氨酸酶的菌体涂布于平板，验证无杂菌后，转接斜面培养基培养，备用；
所述的斜面培养基成分包括：葡萄糖1%、酵母粉0.5%、胰蛋白胨1%、氯化钠0.5%、琼脂2%、pH值为7.0。
上述步骤（3）中所述的富马酸、氨水和水的质量比为10：11-13：77-79；优选为10:12:78。
所述的富马酸为含量99%的粉剂；所述的氨水的质量分数为20%。
本发明在实施过程中发现富马酸和氨水的质量比会明显影响反应效率，当富马酸、氨水和水比例低于10：11：79时，反应进行不完全，转化率较低；而当富马酸、氨水和水比例超过10：13：77时，会生成较多的副产物。
本发明在实施过程中发现在步骤（3）的混合液中加入碳酸氢铵可明显降低反应过程中中间产物生成，所述的碳酸氢铵与步骤（3）所述混合液的质量比为10-25g:1kg；
优选地，所述的碳酸氢铵与步骤（3）所述混合液的质量比为15-20g:1kg。
所述的酶原的加入量为混合液质量的4-6%；
优选地，所述的酶原的加入量为混合液质量的5%。
作为一些优选地实施方案，所述的混合液中还含有二价金属盐，所述的二价金属盐选自硝酸钙、硝酸镁、硝酸铜和硝酸锰中的至少一种；
优选地，所述的硝酸钙与步骤（3）所述混合液的摩尔质量比为0.5-2.0mmol:1kg；优选为1-1.5mmol:1kg；再优选为1mmol:1kg。
所述的硝酸镁与步骤（3）所述混合液的摩尔质量比为0.5-2.0mmol:1kg；优选为1-1.5mmol:1kg；再优选为1mmol:1kg。
所述的硝酸铜与步骤（3）所述混合液的摩尔质量比为0.5-2.0mmol:1kg；优选为1-1.5mmol:1kg；再优选为1mmol:1kg。
所述的硝酸锰与步骤（3）所述混合液的摩尔质量比为0.5-2.0mmol:1kg；优选为1-1.5mmol:1kg；再优选为1mmol:1kg。
优选地，所述的二价金属盐为硝酸钙和硝酸镁的混合物；两者的质量比为1-2:1；优选为1:1。
本发明在实施过程中意外地发现，在混合液中加入二价金属离子可提高酶的热稳定性，提高反应效率，进而提高天冬氨酸生成量。
优选地，上述步骤（3）中所述的pH值为6.5，实施过程中发现pH值会明显影响反应效率，pH值大于7或pH值小于6天冬氨酸生成量明显降低。
作为一个优选地实施方案，所述的肥料用天冬氨酸的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）将大肠杆菌于培养基中发酵培养，发酵液离心，得到含天冬氨酸酶的菌体，所述的培养基成分包括：葡萄糖4%、酵母粉0.5%、胰蛋白胨0.5%、尿素1%、磷酸氢二钾0.3%、硫酸镁0.5%、氯化锌0.1%、氯化钠0.1%；
（2）将步骤（1）中得到的含天冬氨酸酶的菌体涂布于平板，验证无杂菌后，转接斜面培养基培养，备用；
所述的斜面培养基成分包括：葡萄糖1%、酵母粉0.5%、胰蛋白胨1%、氯化钠0.5%、琼脂2%、pH值为7.0；
（3）将富马酸和水混合，然后加入氨水混匀后得到混合液，向混合液中加入碳酸氢铵（与混合液的质量比为15g:1kg）、硝酸钙（与混合液的摩尔质量比为1mmol:1kg）和硝酸镁（与混合液的摩尔质量比为1mmol:1kg）混合后，调节pH为6.5，加入步骤（2）制备的酶原，进行酶反应8小时，反应结束分离收集天冬氨酸；
所述的富马酸、氨水和水的质量比为10：12：78，所述的酶原的加入量为混合液质量的5%。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
（1）本发明在实施过程中发现富马酸和氨水的质量比会明显影响反应效率，当富马酸、氨水和水比例低于10：11：79时，反应进行不完全，转化率较低；而当富马酸、氨水和水比例超过10：13：77时，会生成较多的副产物，而控制富马酸、氨水和水的质量比为10：11-13：77-79，能够明显提高反应的转化率，反应8小时后天冬氨酸生成量可达到320g/L以上。
（2）本发明在实施过程中发现在步骤（3）的混合液中加入碳酸氢铵可明显降低反应过程中中间产物生成，碳酸氢铵与步骤（3）所述混合液的质量比为10-25g:1kg时，天冬氨酸的生成含量可达340g/L以上；
（3）本发明在实施过程中意外地发现，在混合液中加入二价金属离子可提高酶的热稳定性，提高反应效率，进而提高天冬氨酸生成量。
（4）本发明提供的制备方法天冬氨酸生成量高，产物分离简单，反应过程稳定，对环境污染小。
具体实施方式
以下非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述内容仅仅是对本发明要求保护的范围的示例性说明，本领域技术人员可以根 据所公开的内容对本发明做出多种改变和修饰，而其也应当属于本发明要求保护的范围之中。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
下面以具体实施例的方式对本发明作进一步的说明。本发明实施例中所使用的各种化学试剂如无特殊说明均通过常规商业途径获得。
以下实施例中使用的大肠杆菌为大肠杆菌ATCC 8739，购自上海宝录生物科技有限公司。
实施例1一种肥料用天冬氨酸的制备方法
具体包括以下步骤：
（1）将大肠杆菌于培养基中发酵培养，发酵液离心，得到含天冬氨酸酶的菌体，所述的培养基成分包括：葡萄糖4%、酵母粉0.5%、胰蛋白胨0.5%、尿素1%、磷酸氢二钾0.3%、硫酸镁0.5%、氯化锌0.1%、氯化钠0.1%；
（2）将步骤（1）中得到的含天冬氨酸酶的菌体涂布于平板，验证无杂菌后，转接斜面培养基培养，备用；
所述的斜面培养基成分包括：葡萄糖1%、酵母粉0.5%、胰蛋白胨1%、氯化钠0.5%、琼脂2%、pH值为7.0；
（3）将富马酸和水混合，然后加入氨水混匀后，补水至1kg，得到混合液（富马酸、氨水和水的质量比为10：11：79），向混合液中加入10g碳酸氢铵混合后，调节pH为6，加入步骤（2）制备的酶原30g，25℃进行酶反应8小时，反应结束分离收集天冬氨酸。
实施例2一种肥料用天冬氨酸的制备方法
具体包括以下步骤：
（1）将大肠杆菌于培养基中发酵培养，发酵液离心，得到含天冬氨酸酶的菌体，所述的培养基成分包括：葡萄糖4%、酵母粉0.5%、胰蛋白胨0.5%、尿素1%、磷酸氢二钾0.3%、硫酸镁0.5%、氯化锌0.1%、氯化钠0.1%；
（2）将步骤（1）中得到的含天冬氨酸酶的菌体涂布于平板，验证无杂菌后，转接斜面培养基培养，备用；
所述的斜面培养基成分包括：葡萄糖1%、酵母粉0.5%、胰蛋白胨1%、氯化钠0.5%、琼脂2%、pH值为7.0；
（3）将富马酸和水混合，然后加入氨水混匀后，补水至1kg，得到混合液（富马酸、氨水和水的质量比为10：12：78），向混合液中加入10g碳酸氢铵混合后，调节pH为6，加入步骤（2）制备的酶原50g，25℃进行酶反应8小时，反应结束分离收集天冬氨酸。
实施例3一种肥料用天冬氨酸的制备方法
具体包括以下步骤：
（1）将大肠杆菌于培养基中发酵培养，发酵液离心，得到含天冬氨酸酶的菌体，所述的培养基成分包括：葡萄糖4%、酵母粉0.5%、胰蛋白胨0.5%、尿素1%、磷酸氢二钾0.3%、硫酸镁0.5%、氯化锌0.1%、氯化钠0.1%；
（2）将步骤（1）中得到的含天冬氨酸酶的菌体涂布于平板，验证无杂菌后，转接斜面培养基培养，备用；
所述的斜面培养基成分包括：葡萄糖1%、酵母粉0.5%、胰蛋白胨1%、氯化钠0.5%、琼脂2%、pH值为7.0；
（3）将富马酸和水混合，然后加入氨水混匀后，补水至1kg，得到混合液（富马酸、氨水和水的质量比为10：13：77），向混合液中加入10g碳酸氢铵混合后，调节pH为6，加入步骤（2）制备的酶原60g，25℃进行酶反应8小时，反应结束分离收集天冬氨酸。
对比例1
与实施例2的区别在于，步骤（2）富马酸、氨水和水的体积比为10：10：80，其他步骤与操作与实施例2相同。
对比例2
与实施例2的区别在于，步骤（2）富马酸、氨水和水的体积比为10：14：76，其他步骤与操作与实施例2相同。
效果验证：
实施例1-3和对比例1-2中所述的制备方法制备得到天冬氨酸的含量，每个实施例步骤（3）平均进行3次，求平均值，保留小数点后1位。
检测方法：根据NY/T1975-2010中规定的检测，检测结果见下表1。
表1
根据表1的检测数据可以看出，本发明通过控制富马酸和氨水的质量比会明显影响反应效率，当富马酸、氨水和水比例为10:10:80时，反应进行不完全，天冬氨酸生成量较低；而当富马酸、氨水和水比例为10:14:76时，会生成较多副产物，天冬氨酸生成量也较低，而控制富马酸、氨水和水的体积比为10:11-13:77-79，能够明显提高反应效率，反应8小时后天冬氨酸生成量可达到320g/L以上，尤其是实施例2天冬氨酸生成量可达到330g/L以上。
实施例4一种肥料用天冬氨酸的制备方法
具体包括以下步骤：
（1）将大肠杆菌于培养基中发酵培养，发酵液离心，得到含天冬氨酸酶的菌体，所述的培养基成分包括：葡萄糖4%、酵母粉0.5%、胰蛋白胨0.5%、尿素1%、磷酸氢二钾0.3%、硫酸镁0.5%、氯化锌0.1%、氯化钠0.1%；
（2）将步骤（1）中得到的含天冬氨酸酶的菌体涂布于平板，验证无杂菌后，转接斜面培养基培养，备用；
所述的斜面培养基成分包括：葡萄糖1%、酵母粉0.5%、胰蛋白胨1%、氯化钠0.5%、琼脂2%、pH值为7.0；
（3）将富马酸和水混合，然后加入氨水混匀后，补水至1kg，得到混合液（富马酸、氨水和水的质量比为10：12：78），向混合液中加入10g碳酸氢铵混合后，调节pH为7，加入步骤（2）制备的酶原50g，25℃进行酶反应8小时，反应结束分离收集天冬氨酸。
实施例5一种肥料用天冬氨酸的制备方法
具体包括以下步骤：
（1）将大肠杆菌于培养基中发酵培养，发酵液离心，得到含天冬氨酸酶的菌体，所述的培养基成分包括：葡萄糖4%、酵母粉0.5%、胰蛋白胨0.5%、尿素1%、磷酸氢二钾0.3%、硫酸镁0.5%、氯化锌0.1%、氯化钠0.1%；
（2）将步骤（1）中得到的含天冬氨酸酶的菌体涂布于平板，验证无杂菌后，转接斜面培养基培养，备用；
所述的斜面培养基成分包括：葡萄糖1%、酵母粉0.5%、胰蛋白胨1%、氯化钠0.5%、琼脂2%、pH值为7.0；
（3）将富马酸和水混合，然后加入氨水混匀后，补水至1kg，得到混合液（富马酸、氨水和水的质量比为10：12：78），向混合液中加入20g碳酸氢铵混合后，调节pH为6.5，加入步骤（2）制备的酶原50g，25℃进行酶反应8小时，反应结束分离收集天冬氨酸。
对比例3
与实施例5的区别在于，步骤（3）的pH值为5，其他步骤与操作与实施例5相同。
对比例4
与实施例5的区别在于，步骤（3）的pH值为8，其他步骤与操作与实施例5相同。
效果验证：
实施例4-5和对比例3-4中所述的制备方法制备得到天冬氨酸的含量，每个实施例步骤（3）平均进行3次，求平均值，保留小数点后1位。
检测方法：根据NY/T1975-2010中规定的检测，检测结果见下表2。
表2
根据表2的检测数据可以看出，本发明通过控制pH值会明显影响反应效率，pH值大于7或pH值小于6反应效率明显降低。
实施例6一种肥料用天冬氨酸的制备方法
具体包括以下步骤：
（1）将大肠杆菌于培养基中发酵培养，发酵液离心，得到含天冬氨酸酶的菌体，所述的培养基成分包括：葡萄糖4%、酵母粉0.5%、胰蛋白胨0.5%、尿素1%、磷酸氢二钾0.3%、硫酸镁0.5%、氯化锌0.1%、氯化钠0.1%；
（2）将步骤（1）中得到的含天冬氨酸酶的菌体涂布于平板，验证无杂菌后，转接斜面培养基培养，备用；
所述的斜面培养基成分包括：葡萄糖1%、酵母粉0.5%、胰蛋白胨1%、氯化钠0.5%、琼脂2%、pH值为7.0；
（3）将富马酸和水混合，然后加入氨水混匀后，补水至1kg，得到混合液（富马酸、氨水和水的质量比为10：12：78），向混合液中加入15g碳酸氢铵混合后，调节pH为6.5，加入步骤（2）制备的酶原50g，25℃进行酶反应8小时，反应结束分离收集天冬氨酸。
实施例7一种肥料用天冬氨酸的制备方法
具体包括以下步骤：
（1）将大肠杆菌于培养基中发酵培养，发酵液离心，得到含天冬氨酸酶的菌体，所述的培养基成分包括：葡萄糖4%、酵母粉0.5%、胰蛋白胨0.5%、尿素1%、磷酸氢二钾0.3%、硫酸镁0.5%、氯化锌0.1%、氯化钠0.1%；
（2）将步骤（1）中得到的含天冬氨酸酶的菌体涂布于平板，验证无杂菌后，转接斜面培养基培养，备用；
所述的斜面培养基成分包括：葡萄糖1%、酵母粉0.5%、胰蛋白胨1%、氯化钠0.5%、琼脂2%、pH值为7.0；
（3）将富马酸和水混合，然后加入氨水混匀后，补水至1kg，得到混合液（富马酸、氨水和水的质量比为10：12：78），向混合液中加入20g碳酸氢铵混合后，调节pH为6.5，加入步骤（2）制备的酶原50g，25℃进行酶反应8小时，反应结束分离收集天冬氨酸。
实施例8一种肥料用天冬氨酸的制备方法
具体包括以下步骤：
（1）将大肠杆菌于培养基中发酵培养，发酵液离心，得到含天冬氨酸酶的菌体，所述的培养基成分包括：葡萄糖4%、酵母粉0.5%、胰蛋白胨0.5%、尿素1%、磷酸氢二钾0.3%、硫酸镁0.5%、氯化锌0.1%、氯化钠0.1%；
（2）将步骤（1）中得到的含天冬氨酸酶的菌体涂布于平板，验证无杂菌后，转接斜面培养基培养，备用；
所述的斜面培养基成分包括：葡萄糖1%、酵母粉0.5%、胰蛋白胨1%、氯化钠0.5%、琼脂2%、pH值为7.0；
（3）将富马酸和水混合，然后加入氨水混匀后，补水至1kg，得到混合液（富马酸、氨水和水的质量比为10：12：78），向混合液中加入25g碳酸氢铵混合后，调节pH为6.5，加入步骤（2）制备的酶原50g，25℃进行酶反应8小时，反应结束分离收集天冬氨酸。
对比例5
与实施例6的区别在于，碳酸氢铵的加入量为5g，其他步骤与操作与实施例6相同。
对比例6
与实施例6的区别在于，碳酸氢铵的加入量为30g，其他步骤与操作与实施例6相同。
效果验证
实施例6-8和对比例5-6中所述的制备方法制备得到天冬氨酸的含量，每个实施例步骤（3）平均进行3次，求平均值，保留小数点后1位。
检测方法：根据NY/T1975-2010中规定的检测，检测结果见下表3。
表3
根据表3的检测数据可以看出，本发明在步骤（3）的混合液中加入碳酸氢铵可明显降低反应过程中中间产物生成，碳酸氢铵与步骤（3）所述混合液的质量比为10-25g:1kg时，天冬氨酸的生成含量可达330g/L以上。
实施例9一种肥料用天冬氨酸的制备方法
具体包括以下步骤：
（1）将大肠杆菌于培养基中发酵培养，发酵液离心，得到含天冬氨酸酶的菌体，所述的培养基成分包括：葡萄糖4%、酵母粉0.5%、胰蛋白胨0.5%、尿素1%、磷酸氢二钾0.3%、硫酸镁0.5%、氯化锌0.1%、氯化钠0.1%；
（2）将步骤（1）中得到的含天冬氨酸酶的菌体涂布于平板，验证无杂菌后，转接斜面培养基培养，备用；
所述的斜面培养基成分包括：葡萄糖1%、酵母粉0.5%、胰蛋白胨1%、氯化钠0.5%、琼脂2%、pH值为7.0；
（3）将富马酸和水混合，然后加入氨水混匀后，补水至1kg，得到混合液（富马酸、氨水和水的质量比为10：12：78），向混合液中加入15g碳酸氢铵、1mmol硝酸钙和1mmol硝酸镁混合后，调节pH为6.5，加入步骤（2）制备的酶原50g，进行酶反应8小时，反应结束分离收集天冬氨酸。
实施例10
与实施例9的区别在于，仅添加2.0mmol硝酸钙，其他步骤与操作与实施例9相同。
实施例11
与实施例9的区别在于，仅添加2.0mmol硝酸镁，其他步骤与操作与实施例9相同。
将实施例6、实施例9-11中公开的制备方法分别在25℃、37℃和98℃条件下反应所述制备方法制备得到天冬氨酸的含量，每个实施例步骤（3）平均进行3次，求平均值，保留小数点后1位。
检测方法：根据NY/T1975-2010中规定的检测，检测结果见下表4。
表4
根据上表4的检测数据可以看出，在混合液中加入二价金属离子可提高酶的热稳定性，提高了天冬氨酸的生成含量。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (7)

1.一种肥料用天冬氨酸的制备方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
（1）将大肠杆菌于培养基中发酵培养，发酵液离心，得到含天冬氨酸酶的菌体；
（2）将步骤（1）中得到的含天冬氨酸酶的菌体进行活化，得到活化后的酶原；
（3）将富马酸和水混合，然后加入氨水混匀后得到混合液，向混合液中加入碳酸氢铵和二价金属盐混合后，调节pH为6-7，加入步骤（2）制备的酶原，进行酶反应，反应结束分离收集天冬氨酸；
步骤（3）中所述的富马酸、氨水和水的质量比为10:11-13:77-79；
所述的碳酸氢铵与步骤（3）所述混合液的质量比为10-25g:1kg；
所述的二价金属盐为硝酸钙和硝酸镁的混合物，两者的质量比为1-2:1；所述的硝酸钙与步骤（3）所述混合液的摩尔质量比为0.5-2.0mmol:1kg；所述的硝酸镁与步骤（3）所述混合液的摩尔质量比为0.5-2.0mmol:1kg。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的培养基成分包括：葡萄糖4%、酵母粉0.5%、胰蛋白胨0.5%、尿素1%、磷酸氢二钾0.3%、硫酸镁0.5%、氯化锌0.1%、氯化钠0.1%。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的活化具体步骤为：将含天冬氨酸酶的菌体涂布于平板，验证无杂菌后，转接斜面培养基培养，备用；
所述的斜面培养基成分包括：葡萄糖1%、酵母粉0.5%、胰蛋白胨1%、氯化钠0.5%、琼脂2%、pH值为7.0。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的富马酸、氨水和水的质量比为10:12:78。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的富马酸为含量99%的粉剂；所述的氨水的质量分数为20%。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的酶原的加入量为混合液质量的4-6%。
7.一种肥料用天冬氨酸的制备方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
（1）将大肠杆菌于培养基中发酵培养，发酵液离心，得到含天冬氨酸酶的菌体，所述的培养基成分包括：葡萄糖4%、酵母粉0.5%、胰蛋白胨0.5%、尿素1%、磷酸氢二钾0.3%、硫酸镁0.5%、氯化锌0.1%、氯化钠0.1%；
（2）将步骤（1）中得到的含天冬氨酸酶的菌体涂布于平板，验证无杂菌后，转接斜面培养基培养，备用；
所述的斜面培养基成分包括：葡萄糖1%、酵母粉0.5%、胰蛋白胨1%、氯化钠0.5%、琼脂2%、pH值为7.0；
（3）将富马酸和水混合，然后加入氨水混匀后得到混合液，向混合液中加入碳酸氢铵、硝酸钙和硝酸镁混合后，调节pH为6.5，加入步骤（2）制备的酶原，进行酶反应8小时，反应结束分离收集天冬氨酸；
所述的富马酸、氨水和水的质量比为10：12：78，所述的酶原的加入量为混合液质量的5%；
所述的碳酸氢铵与混合液的质量比为15g:1kg；所述的硝酸钙与混合液的摩尔质量比为1mmol:1kg；所述的硝酸镁与混合液的摩尔质量比为1mmol:1kg。
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