一种D-天冬氨酸及L-丙氨酸的生产工艺
技术领域
本发明涉及D-天冬氨酸及L-丙氨酸的生产工艺,属于生物工程领域。
背景技术
D-天冬氨酸制备技术主要有化学法和酶法:
化学不对称拆分法(特公昭52-54190),工艺复杂,产物D-天冬氨酸光学纯度低,无工业化价值。
酶法生产D-天冬氨酸技术中,有不对称降解法(昭56-20753),其利用假丝酵母降解掉DL-天冬氨酸中的L-天冬氨酸而获得D-天冬氨酸;L-天冬氨酸-α-脱羧酶法(CN1242054A),利用基因工程技术构建L-天冬氨酸-α-脱羧酶法产生菌,从DL-天冬氨酸同时制备D-天冬氨酸和β-丙氨酸;还有利用天冬氨酸酶和富马酸酶联合作用从DL-天冬氨酸中同时制备D-天冬氨酸和L-苹果酸(平1-285193)。上述方法或者酶活力很低,或者工艺复杂。
目前L-丙氨酸是由L-天冬氨酸-β-脱羧酶催化L-天冬氨酸脱羧反应生产而成(平2-79909、平2-242690),产L-天冬氨酸-β-脱羧酶的菌种自然界中很常见,主要有假单胞菌属、无色杆菌属、诺卡氏菌属等。培养这些微生物,利用其产生的L-天冬氨酸-β-脱羧酶作用DL-天冬氨酸或其盐,可同时产生两种有广泛用途的化合物—D-天冬氨酸和L-丙氨酸。
D-天冬氨酸作为一种重要的手型化合物,主要用于合成药物的前体和中间体,包括用于合成N-甲基-D-天冬氨酸、阿扑西林、治疗病毒感染的药物D-天冬氨酸-β-羟胺,还参与合成一些抗生素的侧链,作为β-内酰胺抗生素的侧链能提高抗生素的活性等,并且在食品工业中作为合成新型食品添加剂和防腐剂的原料。L-丙氨酸作为蛋白质氨基酸,在蛋白质输液中广泛应用,L-丙氨酸还被用作维生素B6合成的主要原料以及左氧氟沙星原料L-氨基丙醇的原料。
至今只有专利特公昭50-100289、昭53-1831、昭57-39791、昭57-132882和CN1155716C中提及用L-天冬氨酸-β-脱羧酶生产D-天冬氨酸和L-丙氨酸。专利特公昭50-100289、昭53-1831、昭57-39791、昭57-132882侧重研究固定化方法和L-丙氨酸的生产,在提及的生产D-天冬氨酸过程中需要添加昂贵的辅酶磷酸吡哆醛和金属离子Co2+,造成生产成本很高。南京工业大学的专利CN1155716C,培养假单胞菌高产L-天冬氨酸-β-脱羧酶,利用游离细胞法转化D-天冬氨酸或其盐生产D-天冬氨酸和L-丙氨酸。该方法侧重菌种的培养,底物浓度低,辅助原料消耗大,转化反应和提取过程有待进一步优化。
发明内容
本发明是对上述现有技术的改进,从而提供一种高效、低成本、环保节能的D-天冬氨酸和L-丙氨酸生产工艺。
本发明以DL-天冬氨酸铵为底物,直接加入高产L-天冬氨酸-β-脱羧酶活力的发酵液在45-50℃下进行酶促反应,反应过程中不断流加DL-天冬氨酸控制反应体系的pH5.5-7.0,分离反应产物,得到高纯度的D-天冬氨酸和L-丙氨酸。
本发明所用的发酵液为假单胞菌属、无色杆菌属、诺卡氏菌属等菌种培养而得,其 L-天冬氨酸-β-脱羧酶的活性大于2000μmol·ml-1·h-1。
本发明采用流加DL-天冬氨酸来调节反应体系的pH5.5-7.0,DL-天冬氨酸同时也作为底物参与反应,这样可以显著提高反应底物的浓度,提高生产效率。DL-天冬氨酸铵中的L-天冬氨酸铵进行脱羧反应后,生成的CO2不会立即释放出来,而是与NH4 +结合生成NH4HCO3,反应体系的pH升高。加入DL-天冬氨酸后,DL-天冬氨酸与NH4HCO3反应生成DL-天冬氨酸铵,同时释放CO2,生成的DL-天冬氨酸铵作为底物循环参与反应。按起始底物DL-天冬氨酸铵浓度30-50%(以DL-天冬氨酸计算)计算,流加一倍量的DL-天冬氨酸,则最终加入DL-天冬氨酸总量可达60-100%。反应完成,体系中的D-天冬氨酸浓度最高可达50%,L-丙氨酸一部分以结晶形式从溶液析出。
本发明采用等电点与钙盐沉淀结合法分离法反应体系的D-天冬氨酸和L-丙氨酸,钙盐沉淀法钙的来源于CaO或Ca(OH)2。先通过离心回收结晶析出的L-丙氨酸,然后对离心的母液进行超滤、活性炭脱色,用H2SO4调等电点pH2.7-2.9使D-天冬氨酸结晶析出,再利用钙盐沉淀法除去母液中的SO4 2-,过滤掉钙盐沉淀、浓缩提取出母液中溶解L-丙氨酸。
本发明对钙盐沉淀法分离L-丙氨酸后的母液循环进行等电点与钙盐沉淀结合法提取其中的D-天冬氨酸和L-丙氨酸。用H2SO4调等电点,只能使85%左右的D-天冬氨酸结晶析出,残留15%左右D-天冬氨酸的母液接着进行钙盐沉淀法提取L-丙氨酸。钙盐沉淀提取、浓缩后的母液中,含有高浓度的D-天冬氨酸和L-丙氨酸,所以必须进行回收提取以提高收率。对母液循环进行等电点与钙盐沉淀结合法提取,避免了母液的排放,提高了收率,减少了母液排放的处理成本。
和现有技术相比,本发明具有如下技术优势:
本发明采用流加底物DL-天冬氨酸来控制反应体系的pH值,可使底物浓度比起始时增加一倍,浓度可达60-100%,比专利CN1155716C报道的底物浓度高出很多。因为一半的底物是直接流加DL-天冬氨酸,而不是其铵盐,所以氨水的使用量减少了一半,相应的随后调节等电点所用的H2SO4量也减少了一半。产物浓度高,酸、碱用量减半,从而显著地降低了生产成本。
本发明采用采用钙盐沉淀法除去母液中的SO4 2-,从而可以浓缩结晶出母液中的L-丙氨酸,提取后的母液循环进行等电点与钙盐沉淀结合法提取,同时浓缩也可以部分回收母液中因钙盐沉淀法而产生的氨。工艺简单易行,不排放母液,避免使用离子交换树脂产生的大量的酸碱废水对环保处理的压力,收率高,环保节能。
附图说明
为了更好地说明本发明的技术特点,图1本发明的工艺流程图。
具体实施方式
下面通过实施例来进一步描述本发明的技术方案,对于本领域的普通技术人员而言,下列实施例不构成对本发明的保护范围的限制。
实施例1
取酶活力为2240μmol·ml-1·h-1发酵液2000L加入DL-天冬氨酸铵1692kg,加水配成5000L的反应液,其中DL-天冬氨酸含量为30%,45℃反应48h,控制pH5.5持续流加DL-天冬氨酸1525kg。反应液中D-天冬氨酸浓度约为30%,并有少量L-丙氨酸晶体析出。
将反应液用1000转的三足式离心机离心,并用少量水洗涤,收集结晶干燥得L-丙氨酸324 Kg,滤液冷却到30℃,过管式超滤膜,滤液用0.5%的活性炭脱色并过滤,滤液用H2SO4调pH2.8,冷却到25℃,离心洗涤干燥后得D-天冬氨酸1388kg。余下的母液加入350kg氧化钙(CaO),板框过滤除去CaSO4,接着加入碳酸氢铵50kg,板框过滤除去少量的CaCO3,收集滤液,真空浓缩,离心干燥得L-丙氨酸578kg,收集提取后的母液。
D-天冬氨酸:[α]D 20=-25.3°(c=10,6N HCL),Mp=270(分解);L-丙氨酸: [α]D 20=+14.4°(c=10,6N HCL),Mp=297(分解)。
实施例2
取酶活力为2490μmol·ml-1·h-1发酵液2000L加入DL-天冬氨酸铵2256kg,加水配成5000L的反应液,其中DL-天冬氨酸含量约40%,48℃反应65h,控制pH6.0持续流加DL-天冬氨酸1987kg。反应液中D-天冬氨酸浓度为约40%,并有少量L-丙氨酸晶体析出。
将反应液用1000转的三足式离心机离心,并用少量水洗涤,收集结晶干燥得L-丙氨酸682 Kg,滤液冷却到30℃,过管式超滤膜,滤液用0.5%的活性炭脱色并过滤,滤液用H2SO4调pH2.9,冷却到25℃,离心洗涤干燥后得D-天冬氨酸1734kg。余下的母液加入450kg氧化钙(CaO),板框过滤除去CaSO4,接着加入碳酸氢铵70kg,板框过滤除去少量的CaCO3,收集滤液,真空浓缩,离心干燥得L-丙氨酸465kg,收集提取后的母液。
D-天冬氨酸:[α]D 20=-25.2°(c=10,6N HCL),Mp=272(分解);L-丙氨酸: [α]D 20=+14.6°(c=10,6N HCL),Mp=297(分解)。
实施例3
取酶活力为2160μmol·ml-1·h-1发酵液2000L加入DL-天冬氨酸铵2538Kg,加水配成5000L的反应液,其中DL-天冬氨酸含量约45%,50℃反应72h,控制pH6.2持续流加DL-天冬氨酸2300kg。反应液中D-天冬氨酸浓度为约45%,并有少量L-丙氨酸晶体析出。
将反应液用1000转的三足式离心机离心,并用少量水洗涤,收集结晶干燥得L-丙氨酸826 kg,滤液冷却到30℃,过管式超滤膜,滤液用0.5%的活性炭脱色并过滤,滤液用H2SO4调pH2.8,冷却到25℃,离心洗涤干燥后得D-天冬氨酸1956kg。余下的母液加入660kg氢氧化钙(Ca(OH)2),板框过滤除去CaSO4,接着加入碳酸氢铵100kg,板框过滤除去少量的CaCO3,收集滤液,真空浓缩,离心干燥得L-丙氨酸537kg,收集提取后的母液。
D-天冬氨酸:[α]D 20=-25.1°(c=10,6N HCL),Mp=271(分解);L-丙氨酸: [α]D 20=+14.5°(c=10,6N HCL),Mp=298(分解)。
实施例4
将上述实施例1、2、3中收集提取后的母液约3000L,用0.5%的活性炭脱色并过滤,滤液用H2SO4调pH2.8,冷却到25℃,离心洗涤干燥后得D-天冬氨酸593kg。余下的母液加入180kg氧化钙(CaO),板框过滤除去CaSO4,接着加入碳酸氢铵35kg,板框过滤除去少量的CaCO3,收集滤液,真空浓缩,离心干燥得L-丙氨酸292kg,收集提取后的母液。
D-天冬氨酸:[α]D 20=-25.0°(c=10,6N HCL),Mp=270(分解);L-丙氨酸: [α]D 20=+14.4°(c=10,6N HCL),Mp=297(分解)。