CN102443612A - 一种d-天冬氨酸及l-丙氨酸的生产工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种D-天冬氨酸及L-丙氨酸的生产工艺。该工艺是以DL-天冬氨酸铵为底物，利用富含L-天冬氨酸-β-脱羧酶的发酵液转化反应，生产D-天冬氨酸和L-丙氨酸，反应过程中不断流加DL-天冬氨酸控制反应体系的pH值，底物浓度也可增加一倍，最终体系中的D-天冬氨酸浓度可达50%；先通过离心回收结晶析出的L-丙氨酸，然后用H2SO4调等电点使D-天冬氨酸结晶析出，再利用钙盐沉淀法提取出母液中溶解L-丙氨酸，收集母液循环进行等电点与钙盐沉淀结合法提取。该工艺采用流加底物的方式，产物D-天冬氨酸和L-丙氨酸浓度高，生产过程中的酸、碱的用量减少了一半，提取工艺简便，收率高，极大地降低了成本。
Description
技术领域
本发明涉及D-天冬氨酸及L-丙氨酸的生产工艺，属于生物工程领域。
背景技术
D-天冬氨酸制备技术主要有化学法和酶法：
化学不对称拆分法（特公昭52-54190），工艺复杂，产物D-天冬氨酸光学纯度低，无工业化价值。
酶法生产D-天冬氨酸技术中，有不对称降解法（昭56-20753），其利用假丝酵母降解掉DL-天冬氨酸中的L-天冬氨酸而获得D-天冬氨酸；L-天冬氨酸-α-脱羧酶法（CN1242054A），利用基因工程技术构建L-天冬氨酸-α-脱羧酶法产生菌，从DL-天冬氨酸同时制备D-天冬氨酸和β-丙氨酸；还有利用天冬氨酸酶和富马酸酶联合作用从DL-天冬氨酸中同时制备D-天冬氨酸和L-苹果酸（平1-285193）。上述方法或者酶活力很低，或者工艺复杂。
目前L-丙氨酸是由L-天冬氨酸-β-脱羧酶催化L-天冬氨酸脱羧反应生产而成（平2-79909、平2-242690），产L-天冬氨酸-β-脱羧酶的菌种自然界中很常见，主要有假单胞菌属、无色杆菌属、诺卡氏菌属等。培养这些微生物，利用其产生的L-天冬氨酸-β-脱羧酶作用DL-天冬氨酸或其盐，可同时产生两种有广泛用途的化合物—D-天冬氨酸和L-丙氨酸。
D-天冬氨酸作为一种重要的手型化合物，主要用于合成药物的前体和中间体，包括用于合成N-甲基-D-天冬氨酸、阿扑西林、治疗病毒感染的药物D-天冬氨酸-β-羟胺，还参与合成一些抗生素的侧链，作为β-内酰胺抗生素的侧链能提高抗生素的活性等，并且在食品工业中作为合成新型食品添加剂和防腐剂的原料。L-丙氨酸作为蛋白质氨基酸，在蛋白质输液中广泛应用，L-丙氨酸还被用作维生素B6合成的主要原料以及左氧氟沙星原料L-氨基丙醇的原料。
至今只有专利特公昭50-100289、昭53-1831、昭57-39791、昭57-132882和CN1155716C中提及用L-天冬氨酸-β-脱羧酶生产D-天冬氨酸和L-丙氨酸。专利特公昭50-100289、昭53-1831、昭57-39791、昭57-132882侧重研究固定化方法和L-丙氨酸的生产，在提及的生产D-天冬氨酸过程中需要添加昂贵的辅酶磷酸吡哆醛和金属离子Co2+，造成生产成本很高。南京工业大学的专利CN1155716C，培养假单胞菌高产L-天冬氨酸-β-脱羧酶，利用游离细胞法转化D-天冬氨酸或其盐生产D-天冬氨酸和L-丙氨酸。该方法侧重菌种的培养，底物浓度低，辅助原料消耗大，转化反应和提取过程有待进一步优化。
发明内容
本发明是对上述现有技术的改进，从而提供一种高效、低成本、环保节能的D-天冬氨酸和L-丙氨酸生产工艺。
本发明以DL-天冬氨酸铵为底物，直接加入高产L-天冬氨酸-β-脱羧酶活力的发酵液在45-50℃下进行酶促反应，反应过程中不断流加DL-天冬氨酸控制反应体系的pH5.5-7.0，分离反应产物，得到高纯度的D-天冬氨酸和L-丙氨酸。
本发明所用的发酵液为假单胞菌属、无色杆菌属、诺卡氏菌属等菌种培养而得，其 L-天冬氨酸-β-脱羧酶的活性大于2000μmol·ml-1·h-1。
本发明采用流加DL-天冬氨酸来调节反应体系的pH5.5-7.0，DL-天冬氨酸同时也作为底物参与反应，这样可以显著提高反应底物的浓度，提高生产效率。DL-天冬氨酸铵中的L-天冬氨酸铵进行脱羧反应后，生成的CO2不会立即释放出来，而是与NH4 +结合生成NH4HCO3，反应体系的pH升高。加入DL-天冬氨酸后，DL-天冬氨酸与NH4HCO3反应生成DL-天冬氨酸铵，同时释放CO2，生成的DL-天冬氨酸铵作为底物循环参与反应。按起始底物DL-天冬氨酸铵浓度30-50%（以DL-天冬氨酸计算）计算，流加一倍量的DL-天冬氨酸，则最终加入DL-天冬氨酸总量可达60-100%。反应完成，体系中的D-天冬氨酸浓度最高可达50%，L-丙氨酸一部分以结晶形式从溶液析出。
本发明采用等电点与钙盐沉淀结合法分离法反应体系的D-天冬氨酸和L-丙氨酸，钙盐沉淀法钙的来源于CaO或Ca(OH)2。先通过离心回收结晶析出的L-丙氨酸，然后对离心的母液进行超滤、活性炭脱色，用H2SO4调等电点pH2.7-2.9使D-天冬氨酸结晶析出，再利用钙盐沉淀法除去母液中的SO4 2-，过滤掉钙盐沉淀、浓缩提取出母液中溶解L-丙氨酸。
本发明对钙盐沉淀法分离L-丙氨酸后的母液循环进行等电点与钙盐沉淀结合法提取其中的D-天冬氨酸和L-丙氨酸。用H2SO4调等电点，只能使85%左右的D-天冬氨酸结晶析出，残留15%左右D-天冬氨酸的母液接着进行钙盐沉淀法提取L-丙氨酸。钙盐沉淀提取、浓缩后的母液中，含有高浓度的D-天冬氨酸和L-丙氨酸，所以必须进行回收提取以提高收率。对母液循环进行等电点与钙盐沉淀结合法提取，避免了母液的排放，提高了收率，减少了母液排放的处理成本。
和现有技术相比，本发明具有如下技术优势：
本发明采用流加底物DL-天冬氨酸来控制反应体系的pH值，可使底物浓度比起始时增加一倍，浓度可达60-100%，比专利CN1155716C报道的底物浓度高出很多。因为一半的底物是直接流加DL-天冬氨酸，而不是其铵盐，所以氨水的使用量减少了一半，相应的随后调节等电点所用的H2SO4量也减少了一半。产物浓度高，酸、碱用量减半，从而显著地降低了生产成本。
本发明采用采用钙盐沉淀法除去母液中的SO4 2-，从而可以浓缩结晶出母液中的L-丙氨酸，提取后的母液循环进行等电点与钙盐沉淀结合法提取，同时浓缩也可以部分回收母液中因钙盐沉淀法而产生的氨。工艺简单易行，不排放母液，避免使用离子交换树脂产生的大量的酸碱废水对环保处理的压力，收率高，环保节能。
附图说明
为了更好地说明本发明的技术特点，图1本发明的工艺流程图。
具体实施方式
下面通过实施例来进一步描述本发明的技术方案，对于本领域的普通技术人员而言，下列实施例不构成对本发明的保护范围的限制。
实施例1
取酶活力为2240μmol·ml-1·h-1发酵液2000L加入DL-天冬氨酸铵1692kg，加水配成5000L的反应液，其中DL-天冬氨酸含量为30%，45℃反应48h，控制pH5.5持续流加DL-天冬氨酸1525kg。反应液中D-天冬氨酸浓度约为30%，并有少量L-丙氨酸晶体析出。
将反应液用1000转的三足式离心机离心，并用少量水洗涤，收集结晶干燥得L-丙氨酸324 Kg，滤液冷却到30℃，过管式超滤膜，滤液用0.5%的活性炭脱色并过滤，滤液用H2SO4调pH2.8，冷却到25℃，离心洗涤干燥后得D-天冬氨酸1388kg。余下的母液加入350kg氧化钙（CaO）,板框过滤除去CaSO4，接着加入碳酸氢铵50kg,板框过滤除去少量的CaCO3，收集滤液，真空浓缩，离心干燥得L-丙氨酸578kg，收集提取后的母液。
D-天冬氨酸：［α］D 20=-25.3°（c=10，6N HCL），Mp=270（分解）；L-丙氨酸： ［α］D 20=+14.4°（c=10，6N HCL），Mp=297（分解）。
实施例2
取酶活力为2490μmol·ml-1·h-1发酵液2000L加入DL-天冬氨酸铵2256kg，加水配成5000L的反应液，其中DL-天冬氨酸含量约40%，48℃反应65h，控制pH6.0持续流加DL-天冬氨酸1987kg。反应液中D-天冬氨酸浓度为约40%，并有少量L-丙氨酸晶体析出。
将反应液用1000转的三足式离心机离心，并用少量水洗涤，收集结晶干燥得L-丙氨酸682 Kg，滤液冷却到30℃，过管式超滤膜，滤液用0.5%的活性炭脱色并过滤，滤液用H2SO4调pH2.9，冷却到25℃，离心洗涤干燥后得D-天冬氨酸1734kg。余下的母液加入450kg氧化钙（CaO）,板框过滤除去CaSO4，接着加入碳酸氢铵70kg,板框过滤除去少量的CaCO3，收集滤液，真空浓缩，离心干燥得L-丙氨酸465kg，收集提取后的母液。
D-天冬氨酸：［α］D 20=-25.2°（c=10，6N HCL），Mp=272（分解）；L-丙氨酸： ［α］D 20=+14.6°（c=10，6N HCL），Mp=297（分解）。
实施例3
取酶活力为2160μmol·ml-1·h-1发酵液2000L加入DL-天冬氨酸铵2538Kg，加水配成5000L的反应液，其中DL-天冬氨酸含量约45%，50℃反应72h，控制pH6.2持续流加DL-天冬氨酸2300kg。反应液中D-天冬氨酸浓度为约45%，并有少量L-丙氨酸晶体析出。
将反应液用1000转的三足式离心机离心，并用少量水洗涤，收集结晶干燥得L-丙氨酸826 kg，滤液冷却到30℃，过管式超滤膜，滤液用0.5%的活性炭脱色并过滤，滤液用H2SO4调pH2.8，冷却到25℃，离心洗涤干燥后得D-天冬氨酸1956kg。余下的母液加入660kg氢氧化钙（Ca（OH）2）,板框过滤除去CaSO4，接着加入碳酸氢铵100kg,板框过滤除去少量的CaCO3，收集滤液，真空浓缩，离心干燥得L-丙氨酸537kg，收集提取后的母液。
D-天冬氨酸：［α］D 20=-25.1°（c=10，6N HCL），Mp=271（分解）；L-丙氨酸： ［α］D 20=+14.5°（c=10，6N HCL），Mp=298（分解）。
实施例4
将上述实施例1、2、3中收集提取后的母液约3000L，用0.5%的活性炭脱色并过滤，滤液用H2SO4调pH2.8，冷却到25℃，离心洗涤干燥后得D-天冬氨酸593kg。余下的母液加入180kg氧化钙（CaO）,板框过滤除去CaSO4，接着加入碳酸氢铵35kg,板框过滤除去少量的CaCO3，收集滤液，真空浓缩，离心干燥得L-丙氨酸292kg，收集提取后的母液。
D-天冬氨酸：［α］D 20=-25.0°（c=10，6N HCL），Mp=270（分解）；L-丙氨酸： ［α］D 20=+14.4°（c=10，6N HCL），Mp=297（分解）。
Claims (8)
1.一种D-天冬氨酸及L-丙氨酸的生产工艺，其特征在于以DL-天冬氨酸铵为底物，利用富含L-天冬氨酸-β-脱羧酶的发酵液转化反应，生产D-天冬氨酸和L-丙氨酸，反应过程中不断流加DL-天冬氨酸控制反应体系的pH值，底物浓度也可增加一倍；反应完成，体系中的D-天冬氨酸浓度最高可达50%，L-丙氨酸一部分以结晶形式从溶液析出；先通过离心回收结晶析出的L-丙氨酸，然后对离心的母液进行超滤、活性炭脱色，用H2SO4调节等电点使D-天冬氨酸结晶析出，再利用钙盐沉淀法除去母液中的SO4 2-，过滤掉钙盐沉淀、浓缩提取出母液中溶解L-丙氨酸，收集母液循环进行等电点与钙盐沉淀结合法提取。
2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于反应体系的温度控制在45-50℃。
3.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于发酵液中L-天冬氨酸-β-脱羧酶的活性大于2000μmol·ml-1·h-1。
4.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于通过连续流加底物DL-天冬氨酸来调节反应体系的pH5.5-7.0。
5.根据权利要求1和4所述的工艺，其特征在于初始反应体系中DL-天冬氨酸铵浓度为30-50%（以DL-天冬氨酸计算），通过流加，最终加入反应体系DL-天冬氨酸浓度可达60-100%。
6.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于等电点法分离D-天冬氨酸和钙盐沉淀法提取L-丙氨酸相结合。
7.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于对钙盐沉淀法提取L-丙氨酸后的母液，循环进行等电点与钙盐沉淀结合法提取其中的D-天冬氨酸和L-丙氨酸。
8.根据权利要求6所述的工艺，其特征在于调等电点使用H2SO4，不限定其浓度；钙盐沉淀法中钙来源于CaO或Ca(OH)2。
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