CN108531525A - 一种l-天冬氨酸的酶法转化制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种L‑天冬氨酸的酶法转化制备方法，步骤如下：将具有天冬氨酸酶活性的菌株于培养基中发酵培养，得含天冬氨酸酶的湿菌体；将湿菌体加入固定化混合物中，混合后滴加到氯化钙溶液中，形成固定化细胞；其中，固定化混合物包括纳米二氧化硅、海藻酸钠和戊二醛；将固定化细胞加入转化液中进行酶促反应，再通过等电点结晶法分离得L‑天冬氨酸。本发明采用L‑天冬氨酸的特定菌株，在发酵培养基中培养以高效表达L‑天冬氨酸酶，并利用纳米二氧化硅、海藻酸钠和戊二醛作为固定化混合物来固定化天冬氨酸酶，使酶法合成L‑天冬氨酸具有较高的催化速率和转化率；此外，酶法合成反应还具有条件温和、酶立体选择性强的优点。

Description

一种L-天冬氨酸的酶法转化制备方法
技术领域
本发明涉及L-天冬氨酸的制备领域，尤其涉及一种L-天冬氨酸的酶法转化制备方法。
背景技术
L-天冬氨酸是一种重要的酸性氨基酸，具有改善心肌功能的生理功能。L-天冬氨酸可用于医药领域，具有非常广泛的应用前景。
天冬氨酸酶(E.C.4.3.1.1)是一种重要的工业用酶，大肠杆菌的天冬氨酸酶由四个相同亚基构成，每个亚基由477个氨基酸残基组成。目前为止，以富马酸和氨为原料，并通过固定化L-天冬氨酸酶催化生产L-天冬氨酸的报道很多，但却尚未有利用纳米二氧化硅、海藻酸钠和戊二醛固定化天冬氨酸酶以进一步制备得到L-天冬氨酸的报道。
据此，目前急需一种利用纳米二氧化硅、海藻酸钠和戊二醛作为固定化混合物以固定化天冬氨酸酶，从而进一步制备L-天冬氨酸的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种利用纳米二氧化硅、海藻酸钠和戊二醛作为固定化混合物的L-天冬氨酸的酶法转化制备方法。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
一种L-天冬氨酸的酶法转化制备方法，包括如下步骤：
(1)将具有天冬氨酸酶活性的菌株于培养基中发酵培养，发酵液离心后，得含天冬氨酸酶的湿菌体；
(2)将上述含天冬氨酸酶的湿菌体加入到固定化混合物中混合；混合后，滴加到氯化钙溶液中，形成固定化细胞；其中，固定化混合物包括：纳米二氧化硅、海藻酸钠和戊二醛；
(3)将上述固定化细胞加入转化液中，在35-50℃，pH 6-11的条件下进行酶促反应，再通过等电点结晶法分离得到L-天冬氨酸；其中，转化液包括富马酸和氨，以及乙酸乙酯、乙酸丁酯、辛醇、正己醇中的一种。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中具有天冬氨酸酶活性的菌株选自大肠杆菌ATCC15489、枯草芽孢杆菌CGMCC NO:1.1628、施氏假单胞菌CGMCC NO:1.202、铜绿假单胞菌CGMCC NO：1.1129中的一种。
作为本发明的优选方式之一，所述大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、施氏假单胞菌、铜绿假单胞菌均直接购自国内外市场。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中培养基成分包括：10-45g/L碳源物质、5-45g/L氮源物质、1.2g/L柠檬酸、1.0g/L硫酸铵、3.0g/L K2HPO4、1.0g/L MgSO4、0.06g/L CaCl2、0.002g/L CoCl2、0.0001g/L MnC4H6O4·4H2O。
作为本发明的优选方式之一，所述碳源物质采用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖中的一种或多种。
作为本发明的优选方式之一，所述氮源物质采用牛肉膏、酵母膏、玉米浆、蛋白胨、豆饼水解液、花生饼粉、黄豆饼粉中的一种或多种。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中纳米二氧化硅、海藻酸钠和戊二醛的具体浓度为：纳米二氧化硅0.05-0.1g/L、海藻酸钠10-30g/L、戊二醛5-10g/L。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中富马酸的浓度为50-350g/L。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中氨的浓度为5-60g/L。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中乙酸乙酯、乙酸丁酯、辛醇、正己醇的浓度为0.001g/L-5.0g/L。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中通过等电点结晶法分离得到L-天冬氨酸的具体步骤为：将酶促反应后的转化液于4000-6000r/min转速下离心15-20min，去除菌体细胞；加热转化液，采用活性碳脱色，树脂吸附，滤膜抽滤，调至pH 2-4，静置析出沉淀，真空抽滤，烘干得L-天冬氨酸粗品；采用水喷洒洗涤，真空抽滤，烘干得L-天冬氨酸精品。
本发明相比现有技术的优点在于：本发明采用L-天冬氨酸的特定菌株在发酵培养基中培养，高效表达L-天冬氨酸酶；接着，利用纳米二氧化硅、海藻酸钠和戊二醛作为固定化混合物以固定化天冬氨酸酶，并进一步酶法合成L-天冬氨酸，具有较高的催化速率和转化率，其中的富马酸摩尔转化率更是达到99％以上；另外，酶法合成L-天冬氨酸还具有反应条件温和，酶立体选择性强，催化效率高，成本低，工艺流程简单等优点，适合工业化生产。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例的一种L-天冬氨酸的酶法转化制备方法，包括如下步骤：
(1)将1000mL大肠杆菌ATCC15489在培养基(10g/L葡萄糖、5g/L牛肉膏、1.2g/L柠檬酸、1.0g/L硫酸铵、3.0g/L K2HPO4、1.0g/L MgSO4、0.06g/L CaCl2、0.002g/L CoCl2、0.0001g/L MnC4H6O4·4H2O)中培养发酵，发酵液离心得到15g湿菌体；
(2)将上述湿菌体加入到固定化混合物(含0.05g/L纳米二氧化硅、10g/L海藻酸钠、5g/L戊二醛)中混合，混合后，滴加到氯化钙溶液中形成固定化细胞；
(3)将上述固定化细胞加入到500mL转化液(含50g/L富马酸、5g/L氨和0.001g/L乙酸乙酯)中，在pH 6，35℃的条件下酶促反应12h，反应结束后，L-天冬氨酸摩尔转化率为99％；
(4)将酶促反应后的转化液于4000r/min转速下离心15min，去除菌体细胞；加热转化液，采用活性碳脱色，树脂吸附，滤膜抽滤，调至pH 2，静置析出沉淀，真空抽滤，烘干得L-天冬氨酸粗品；采用水喷洒洗涤，真空抽滤，烘干得L-天冬氨酸精品，纯度为99.9％。
实施例2
本实施例的一种L-天冬氨酸的酶法转化制备方法，包括如下步骤：
(1)将1000mL大肠杆菌ATCC15489在培养基(45g/L麦芽糖、45g/L酵母膏、1.2g/L柠檬酸、1.0g/L硫酸铵、3.0g/L K2HPO4、1.0g/L MgSO4、0.06g/L CaCl2、0.002g/L CoCl2、0.0001g/L MnC4H6O4·4H2O)中培养发酵，发酵液离心得到14g湿菌体；
(2)将上述湿菌体加入到固定化混合物(含0.1g/L纳米二氧化硅、30g/L海藻酸钠、10g/L戊二醛)中混合，混合后，滴加到氯化钙溶液中形成固定化细胞；
(3)将上述固定化细胞加入到500mL转化液(含350g/L富马酸、60g/L氨和5.0g/L乙酸乙酯)中，在pH 11，50℃的条件下酶促反应12h，反应结束后，L-天冬氨酸摩尔转化率为99％；
(4)将酶促反应后的转化液于6000r/min转速下离心20min，去除菌体细胞；加热转化液，采用活性碳脱色，树脂吸附，滤膜抽滤，调至pH 4，静置析出沉淀，真空抽滤，烘干得L-天冬氨酸粗品；采用水喷洒洗涤，真空抽滤，烘干得L-天冬氨酸精品，纯度为99.9％。
实施例3
本实施例的一种L-天冬氨酸的酶法转化制备方法，包括如下步骤：
(1)将1000mL大肠杆菌ATCC15489在培养基(30g/L蔗糖、30g/L玉米浆、1.2g/L柠檬酸、1.0g/L硫酸铵、3.0g/L K2HPO4、1.0g/L MgSO4、0.06g/L CaCl2、0.002g/L CoCl2、0.0001g/L MnC4H6O4·4H2O)中培养发酵，发酵液离心得到14g湿菌体；
(2)将上述湿菌体加入到固定化混合物(含0.1g/L纳米二氧化硅、30g/L海藻酸钠、10g/L戊二醛)中混合，混合后，滴加到氯化钙溶液中形成固定化细胞；
(3)将上述固定化细胞加入到500mL转化液(含350g/L富马酸、60g/L氨和0.005g/L乙酸乙酯)中，在pH 7.5，45℃的条件下酶促反应12h，反应结束后，L-天冬氨酸摩尔转化率为99％；
(4)将酶促反应后的转化液于6000r/min转速下离心20min，去除菌体细胞；加热转化液，采用活性碳脱色，树脂吸附，滤膜抽滤，调至pH 2.8，静置析出沉淀，真空抽滤，烘干得L-天冬氨酸粗品198.6g；采用水喷洒洗涤，真空抽滤，烘干得L-天冬氨酸精品192.5g，纯度为99.9％。
实施例4
本实施例的一种L-天冬氨酸的酶法转化制备方法，包括如下步骤：
(1)将1000mL铜绿假单胞菌CGMCC NO：1.1129在培养基(20g/L果糖、20g/L蛋白胨、1.2g/L柠檬酸、1.0g/L硫酸铵、3.0g/L K2HPO4、1.0g/L MgSO4、0.06g/L CaCl2、0.002g/LCoCl2、0.0001g/L MnC4H6O4·4H2O)中培养发酵，发酵液离心得到15g湿菌体；
(2)将上述湿菌体加入到固定化混合物(含0.05g/L纳米二氧化硅、10g/L海藻酸钠、5g/L戊二醛)中混合，混合后滴加到氯化钙溶液中形成固定化细胞；
(3)将上述固定化细胞加入到500mL转化液(含175g/L富马酸、30g/L氨和0.0025g/L的乙酸丁酯)中，在pH 7.5，45℃酶促反应12h，反应结束后，L-天冬氨酸摩尔转化率为98％；
(4)将酶促反应后的转化液于5000r/min转速下离心18min，去除菌体细胞；加热转化液，采用活性碳脱色，树脂吸附，滤膜抽滤，调至pH 3.0，静置析出沉淀，真空抽滤，烘干得L-天冬氨酸粗品98.3g；采用水喷洒洗涤，真空抽滤，烘干得L-天冬氨酸精品94.7g，纯度为99.9％。
实施例5
本实施例的一种L-天冬氨酸的酶法转化制备方法，包括如下步骤：
(1)将1000mL施氏假单胞菌CGMCC NO:1.202在培养基(25g/L葡萄糖、25g/L豆饼水解液、1.2g/L柠檬酸、1.0g/L硫酸铵、3.0g/L K2HPO4、1.0g/L MgSO4、0.06g/L CaCl2、0.002g/L CoCl2、0.0001g/L MnC4H6O4·4H2O)中培养发酵，发酵液离心得到湿菌体20g；
(2)将上述湿菌体加入到固定化混合物(含0.1g/L纳米二氧化硅、20g/L海藻酸钠、5g/L戊二醛)中混合，混合后滴加到氯化钙溶液中形成固定化细胞；
(3)将上述固定化细胞加入到500mL转化液(含350g/L富马酸、60g/L氨和0.005g/L的辛醇)中，在pH 7.5，45℃酶促反应12h，反应结束后，L-天冬氨酸摩尔转化率为97％；
(4)将酶促反应后的转化液于4000r/min转速下离心15min，去除菌体细胞；加热转化液，采用活性碳脱色，树脂吸附，滤膜抽滤，调至pH 2.7，静置析出沉淀，真空抽滤，烘干得L-天冬氨酸粗品196.4g；采用水喷洒洗涤，真空抽滤，烘干得L-天冬氨酸精品189.5g，纯度为99.9％。
实施例6
本实施例的一种L-天冬氨酸的酶法转化制备方法，包括如下步骤：
(1)将1000mL枯草芽孢杆菌CGMCC NO:1.1628在培养基(40g/L麦芽糖、40g/L花生饼粉、1.2g/L柠檬酸、1.0g/L硫酸铵、3.0g/L K2HPO4、1.0g/L MgSO4、0.06g/L CaCl2、0.002g/L CoCl2、0.0001g/L MnC4H6O4·4H2O)中培养发酵，发酵液离心得到15g湿菌体；
(2)将上述湿菌体中加入到固定化混合物(含0.05g/L纳米二氧化硅、15g/L海藻酸钠、10g/L戊二醛)中混合，混合后滴加到氯化钙溶液中形成固定化细胞；
(3)将上述固定化细胞加入到500mL转化液(含175g/L富马酸、30g/L氨和0.005g/L的正己醇)中，在pH 7.5，45℃酶促反应12h，反应结束后，L-天冬氨酸摩尔转化率为99％；
(4)将酶促反应后的转化液于6000r/min转速下离心20min，去除菌体细胞；加热转化液，采用活性碳脱色，树脂吸附，滤膜抽滤，调至pH 2.7，静置析出沉淀，真空抽滤，烘干得L-天冬氨酸粗品99.7g；采用水喷洒洗涤，真空抽滤，烘干得L-天冬氨酸精品95.8g，纯度为99.9％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种L-天冬氨酸的酶法转化制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将具有天冬氨酸酶活性的菌株于培养基中发酵培养，发酵液离心后，得含天冬氨酸酶的湿菌体；
(2)将上述含天冬氨酸酶的湿菌体加入到固定化混合物中混合；混合后，滴加到氯化钙溶液中，形成固定化细胞；其中，固定化混合物包括：纳米二氧化硅、海藻酸钠和戊二醛；
(3)将上述固定化细胞加入转化液中，在35-50℃，pH 6-11的条件下进行酶促反应，再通过等电点结晶法分离得到L-天冬氨酸；其中，转化液包括富马酸和氨，以及乙酸乙酯、乙酸丁酯、辛醇、正己醇中的一种。
2.根据权利要求1所述的L-天冬氨酸的酶法转化制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中具有天冬氨酸酶活性的菌株选自大肠杆菌ATCC15489、枯草芽孢杆菌CGMCC NO:1.1628、施氏假单胞菌CGMCC NO:1.202、铜绿假单胞菌CGMCC NO：1.1129中的一种。
3.根据权利要求1所述的L-天冬氨酸的酶法转化制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中培养基成分包括：10-45g/L碳源物质、5-45g/L氮源物质、1.2g/L柠檬酸、1.0g/L硫酸铵、3.0g/L K2HPO4、1.0g/L MgSO4、0.06g/L CaCl2、0.002g/L CoCl2、0.0001g/L MnC4H6O4·4H2O。
4.根据权利要求3所述的L-天冬氨酸的酶法转化制备方法，其特征在于，所述碳源物质采用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖中的一种或多种。
5.根据权利要求3所述的L-天冬氨酸的酶法转化制备方法，其特征在于，所述氮源物质采用牛肉膏、酵母膏、玉米浆、蛋白胨、豆饼水解液、花生饼粉、黄豆饼粉中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的L-天冬氨酸的酶法转化制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中纳米二氧化硅、海藻酸钠和戊二醛的具体浓度为：纳米二氧化硅0.05-0.1g/L、海藻酸钠10-30g/L、戊二醛5-10g/L。
7.根据权利要求1所述的L-天冬氨酸的酶法转化制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中富马酸的浓度为50-350g/L。
8.根据权利要求1所述的L-天冬氨酸的酶法转化制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中氨的浓度为5-60g/L。
9.根据权利要求1所述的L-天冬氨酸的酶法转化制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中乙酸乙酯、乙酸丁酯、辛醇、正己醇的浓度为0.001g/L-5.0g/L。
10.根据权利要求1所述的L-天冬氨酸的酶法转化制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中通过等电点结晶法分离得到L-天冬氨酸的具体步骤为：将酶促反应后的转化液于4000-6000r/min转速下离心15-20min，去除菌体细胞；加热转化液，采用活性碳脱色，树脂吸附，滤膜抽滤，调至pH 2-4，静置析出沉淀，真空抽滤，烘干得L-天冬氨酸粗品；采用水喷洒洗涤，真空抽滤，烘干得L-天冬氨酸精品。
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