CN1671852A - 含有辅酶q10的溶液的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种含有辅酶Q10的溶液的制备方法,包括以下步骤:[1]向有生产辅酶Q10能力的微生物在培养基中培养得到的培养物,该培养物的处理物,或辅酶Q10的粗纯化物中,加入甲醇溶液至浓度为50~100v/v%,温度保持在0℃以上、30℃以下的步骤;[2]从步骤[1]得到的溶液中分离获得不溶物的步骤;[3]向步骤[2]得到的不溶物中加入85~100v/v%的浓度的甲醇溶液,保持温度在高于30℃、80℃以下的步骤;和[4]除去步骤[3]得到的溶液中的不溶物的步骤。
Description
技术领域
本发明涉及从含有辅酶Q10的培养物、该培养物的处理物,或辅酶Q10的粗纯化物中分离纯化辅酶Q10的方法。
背景技术
辅酶Q10广泛存在于动植物的组织、微生物的细胞内,作为末端电子传递系统的必要成分,发挥着重要的作用。另外,其药理作用为对充血性心力衰竭和冠心病、营养不良引起的肌营养障碍等有效,且作为药品也是价值高的物质。
作为辅酶Q10的制备方法,一般为从培养辅酶Q10含有率高的微生物而得到的培养物中提取的方法。
作为从该培养物中纯化辅酶Q10的方法,已知的方法一直以来都是使用有机溶剂等的提取法(特开平11-178595号等)。此外,作为从该提取液中纯化辅酶Q10的方法,已知的方法是使用硅胶或活性氧化铝的方法(特开昭63-91360号、特开平41-160953号等)。
但是,通过上述提取方法得到的提取液,除辅酶Q10外还含有大量的辅酶Q10类似物,难以从该提取液中直接通过结晶法得到高纯度的辅酶Q10纯化物。
通过使用硅胶或活性氧化铝的方法,使用含有大量辅酶Q10类似物的该提取液时,不能高效地分离纯化辅酶Q10。另外,硅胶或活性氧化铝价格高,在工业规模生产时还存在成本高的问题。
发明内容
本发明的目的是提供从含有辅酶Q10的培养物、该培养物的处理物、或辅酶Q10的粗提取物中经济地分离纯化高纯度的辅酶Q10的方法。
本发明涉及以下(1)~(6)项。
(1)包括以下步骤的含有辅酶Q10的溶液的制备方法。
[1]向有生产辅酶Q10能力的微生物在培养基中培养得到的培养物、该培养物的处理物、或辅酶Q10的粗纯化物中,加入甲醇溶液至浓度为50~100v/v%,温度保持在0℃以上、30℃以下的步骤;
[2]从步骤[1]得到的溶液中分离获得不溶物的步骤;
[3]向步骤[2]得到的不溶物中加入85~100v/v%的浓度的甲醇溶液,保持温度在高于30℃、80℃以下的步骤;和
[4]除去步骤[3]得到的溶液中的不溶物的步骤。
(2)如上述(1)所述的方法,其特征在于,向权利要求1中所述的方法的步骤[2]得到的不溶物中再次加入甲醇溶液至浓度为50~100v/v%,保持温度在0~30℃后,分离获得不溶物的步骤重复一次以上,然后进行权利要求1所述的步骤[3]以后的步骤。
(3)如上述(1)或(2)所述的方法,有生产辅酶Q10能力的微生物选自担子菌、真菌、酵母和细菌。
(4)如上述(1)或(2)所述的方法,其特征在于,培养物的处理物为从微生物的培养物的浓缩物、该培养物的干燥物、从该培养物中分离得到的菌体、该菌体的干燥物、该菌体的冻干物、洗涤该菌体得到的洗净菌体、该洗净菌体的干燥物或该洗净菌体的冻干物。
(5)辅酶Q10的结晶的制备方法,其特征在于,使辅酶Q10的结晶从上述(1)或(2)所述的方法中得到的含有辅酶Q10的溶液中结晶析出。
(6)如上述(5)所述的方法,辅酶Q10的结晶为90.0%以上纯度的结晶。
本发明方法中使用的有生产辅酶Q10能力的微生物,只要是有此能力的微生物,任何微生物均可。例如,可以举出作为有生产辅酶Q10能力的微生物的担子菌、真菌、酵母和细菌。更具体的说,可举出属于作为担子菌的黑粉菌属,作为真菌的曲霉菌属、外担子菌属、地霉属、红曲霉属、拟青霉属、侧孢霉属和Tilletiopsis属、作为酵母菌的短柄霉属、酒香酵母属、布氏弹孢酵母属、假丝酵母属、隐球酵母属、担子菌白冬孢酵母属、卵孢菌母属、红酵母属、Rhodosporium属、裂殖糖酵母属、掷孢酵母属、球拟酵母属、银耳属、丝孢酵母属和锁掷酵母属、作为细菌的醋杆菌属、土壤杆菌属、棒状杆菌属、红色杆菌属、黄杆菌属、甲基杆菌属、微环菌属、副球菌属、叶杆菌属、鱼精蛋白杆菌属、假单胞菌属、根瘤菌属、红细菌属和黄单胞菌属(Xantomonas)的微生物等。
另外,通过基因重组等的方法,也可以在本发明的方法中使用辅酶Q合成酶被强化的属于埃希氏菌属的微生物和该酶被强化的具有上述的有生产辅酶Q10能力的微生物。
作为用于培养上述微生物的培养基,只要含有该微生物可利用的碳源、氮源、无机盐类等、可有效地进行该微生物的培养的培养基,天然培养基、合成培养基均可使用。
作为碳源,只要是该微生物可利用的碳源即可,可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖、含有它们的糖蜜、淀粉或淀粉水解物等的碳水化合物、醋酸、丙酸等的有机酸、乙醇、丙醇等的醇类等。
作为氮源,可以使用氨、氯化铵、硫酸铵、醋酸铵、磷酸铵等的无机酸或有机酸的铵盐、其它含氮化合物、以及胨、肉提取物、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、大豆粕和大豆粕水解物、各种发酵菌体和各种发酵菌体消化物等。
作为无机盐,可以使用磷酸二氢钾、磷酸一氢钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。
培养须在振荡培养或深部通气搅拌培养等的有氧条件下进行。培养温度可为15~40℃,培养时间通常为16小时~14天。培养中的pH值优选保持在3.0~9.0。pH的调节可以使用无机或有机酸、碱性溶液、尿素、碳酸钙、氨等进行。
培养结束得到的培养物可以直接用于本发明的纯化方法,该培养物的处理物也可以用于本发明的纯化方法。
作为该培养物的处理物,可列举出该培养物的浓缩物、该培养物的干燥物、从该培养物中分离得到的菌体、该菌体的干燥物、该菌体的冻干物、洗涤该菌体得到的洗净菌体、该洗净菌体的干燥物或该洗净菌体的冻干物等。
作为上述洗净菌体,为用基本上不溶解辅酶Q10的溶剂洗净的菌体,例如可列举出用该溶剂洗涤1~10次,优选为2~7次,更优选为3~5次而得到的菌体。
作为上述洗涤所用的溶剂,优选使用水。
再者,在本发明中,基本上不溶解辅酶Q10也是指在辅酶Q10的工业纯化法中具有可允许的程度的辅酶Q10的溶解性,具体指辅酶Q10的溶解度在0.05%以下,更优选为0.02%以下,进一步优选为0.01%以下。
微生物的菌体可以通过将培养物过滤、离心分离、膜分离等的分离操作,优选为通过离心分离操作而获得。过滤操作可以采用Natsche漏斗,压滤机,提篮式离心机等。
上述培养物及培养物的处理物也可以冻结保存,必要时融解使用。
通过本发明方法,可以从上述培养物,该培养物的处理物中纯化辅酶Q10,除此之外还可以从辅酶Q10的粗纯化物中纯化辅酶Q10。
作为辅酶Q10粗纯化物,可以列举出含有较多辅酶Q10类似物的含有辅酶Q10的溶液、干燥物、冻干物或结晶析出物等,而这些物质的获得方法可以为任何方法,例如,根据以往的方法使用有机溶剂从具有生产辅酶Q10能力的微生物培养而得到的培养物中萃取辅酶Q10的方法、干燥或冻干该提取液的方法,及使由该粗提取方法得到的提取液结晶析出的方法等。
作为含有较多辅酶Q10类似物的含有辅酶Q10的溶液,可以列举出相对于95重量份的辅酶Q10,含有辅酶Q10类似物在5重量份以上的含有辅酶Q10的溶液。
作为辅酶Q10类似物,可以列举出3-脱甲氧基辅酶Q10等的辅酶Q10结构类似物和红极毛杆菌烯(spheroidene)等的类胡萝卜素类等。
作为本发明方法所用的甲醇溶液,可以列举出甲醇和甲醇水溶液。另外,也可列举出向甲醇中添加其它有机溶剂而得到的甲醇溶液,只要能够实现本发明的目的的溶液,即可作为在本发明方法中所用的甲醇溶液。
在由上述方法得到的微生物的培养物或该培养物的处理物,或辅酶Q10的粗提取物中加入甲醇溶液至浓度为50~100v/v%,通过保持温度为0℃以上、30℃以下,可以得到辅酶Q10含量高的不溶物。上述甲醇溶液的浓度和温度,只要是甲醇溶液在此浓度和温度下基本不溶解辅酶Q10的组合,就可以是任何浓度和温度的组合。例如,作为甲醇溶液,使用甲醇或甲醇水溶液时,可列举出浓度为50~100v/v%,温度为0~30℃;更优选浓度为70~100v/v%,温度为10~20℃;进一步优选浓度为80~100v/v%,温度为20℃的组合。
作为在上述浓度和温度下保持含有培养物等的溶液的方法,例如可以列举出用搅拌器搅拌30分钟~10小时,优选为1~5小时,更优选为1~2小时的方法。通过该方法,可以将该培养物中含有的辅酶Q10以外的辅酶Q10类似物从甲醇溶液中提取出来,可以得到含有辅酶Q10的不溶物。
上述步骤得到的含有辅酶Q10的不溶物可通过过滤、离心分离、膜分离等的分离操作与溶液分离。过滤可采用Nutsche漏斗,压滤机,提篮式离心机等进行。
向通过上述一系列步骤得到的不溶物中再次加入甲醇溶液至浓度为50~100v/v%,并重复上述一系列操作一次以上,例如通过重复数次,也可以获得目的浓度的含有辅酶Q10的不溶物。
向通过上述一系列步骤得到的含有辅酶Q10不溶物中加入浓度为85~100v/v%的甲醇溶液,通过保持温度为高于30℃、80℃以下,可以得到含有辅酶Q10的甲醇溶液。
向上述不溶物中加入的甲醇溶液的浓度和温度,只要是使用的甲醇溶液在该浓度和温度下,溶解在上述步骤分离中获得的不溶物中含有的辅酶Q10,而且基本上不溶解辅酶Q10以外的夹杂物的浓度和温度,就可以是任何浓度和温度的组合。具体可例举出,甲醇溶液的浓度85~100v/v%,温度为高于30℃、80℃以下;更优选浓度为90~100v/v%,温度为50~70℃;进一步优选浓度为95~100v/v%,温度为60~70℃的组合。
作为在上述浓度和温度下保持甲醇溶液的方法,可以列举出,例如,用搅拌器搅拌30分钟~10小时,优选为1~5小时,更优选为1~2小时的方法。通过该方法,可以获得含有辅酶Q10的甲醇溶液。
通过从上述步骤得到的含有辅酶Q10的甲醇溶液中除去不溶物,可以分离获得含有辅酶Q10的溶液。作为除去不溶物的方法,可列举以通过过滤、离心分离、膜分离等的分离操作与溶液分离的操作。过滤可以采用Natsche漏斗,压滤机,提篮式离心机等进行。
采用析晶法等方法使辅酶Q10的结晶从上述步骤得到的含有辅酶Q10的溶液中结晶析出,可以获得辅酶Q10的结晶。
作为本发明方法所用的析晶方法,只要是能够从本方明方法得到的含有辅酶Q10的溶液中使辅酶Q10结晶析出的方法,任何方法均可,例如可例举出浓缩析晶法、冷却析晶法和这些方法的组合。结晶条件只要可以使辅酶Q10的结晶析出,任何条件均可,该条件只要是本领域技术人员,无需试错即可设定。作为冷却析晶法中的析晶条件,可列举出将上述步骤得到的含有辅酶Q10的溶液用1~30小时、优选2~20小时、更优选5~15小时冷却至0~30℃、优选10~25℃、更优选15~20℃。
将由上述析晶方法析出的结晶通过过滤,离心分离,膜分离与溶液分离后,通过干燥可以得到辅酶Q10的结晶。向得到的结晶中加入甲醇溶液至浓度为85~100v/v%,保持温度高于30℃低于80℃,使该结晶溶解后,将上述结晶方法重复一次以上,例如数次,可以提高该结晶的纯度。
作为本发明方法得到的辅酶Q10结晶,可以列举出辅酶Q10的纯度在90.0%以上、优选95.0%以上、更优选97.0%以上、再优选99.0%以上的辅酶Q10的结晶。
附图说明
图1表示辅酶Q10对于甲醇溶液的溶解度图。图中表明了甲醇水溶液的温度为●70℃、△50℃、◆30℃、20℃时,辅酶Q10的溶解度。
具体实施方式
以下所示为本发明的实施例,但本发明并不仅限于这些实施例。
实施例1 从辅酶Q10与辅酶Q10类似物的混合物中有效率地除去辅酶Q10类似物的方法
将具有下述表1所述成分的组成的培养基调整到pH9.0,添加1%的碳酸钙后,在装有121℃下灭菌10分钟的1.8L培养基的3L发酵罐中接种生产辅酶Q10的类球红细菌(Rhodobacter Sphaeroides)ATCC21286,并在28℃、搅拌转数为450rpm条件下培养8天。表中的痕量元素是指含有88mg/L的四硼酸钠(硼砂、Na2B4O7·10H2O)、37mg/L的钼酸铵[(NH4)6Mo7O24·4H2O]、8.8mg/L的硫酸锌(ZnSO4)、270mg/L的硫酸铜(CuSO4·5H2O)、7.2mg/L的氯化锰(MnCl2·4H2O)和970mg/L的氯化铁(FeCl3·6H2O)的溶液。
表1
组成物 | 浓度 |
糖蜜葡萄糖玉米浆硫酸铵磷酸二氢钠磷酸一氢钠硫酸镁七水合物硫酸亚铁七水合物硫胺素烟酸痕量元素 | 4.0%2.7%4.0%0.8%0.05%0.05%0.025%3.0mg/L8.0mg/L8.0mg/L1.0mL/L |
培养结束后,向0.3ml的培养物中添加20%的铁氰化钾[K3Fe(CN)6]溶液1μl、2-丁醇0.3ml和玻璃珠0.3ml,通过使用Mulitibeadsshocker MB2000(安井器械社制)振荡30分钟使菌体破碎,完全提取出辅酶Q10和辅酶Q10类似物。将该破碎提取液以15000rpm离心分离10分钟得到的上清液进行HPLC分析的结果,3-脱甲氧基辅酶Q10相对于辅酶Q10的比例为1%。
另一方面,培养结束后,将通过离心分离培养物收集菌体得到的80g湿菌体用水洗涤3次,得到洗净菌体。向该洗净菌体中加入10、20、40或60℃的100v/v%的甲醇500ml,搅拌1小时后,离心分离得到沉淀物。所得沉淀物中的3-脱甲氧基辅酶Q10(3-dmUBD)相对于辅酶Q10的比例用高效液相色谱法分析的结果如表2所示。
表2
温度℃ | 3-dmUBD的比例(%) |
10 | 0.03 |
20 | 0.05 |
40 | 0.71 |
60 | 0.61 |
由上述结果可以确认,通过使用本发明方法可以高效地从含有辅酶Q10和辅酶Q10类似物的溶液中除去辅酶Q10类似物。
实施例2 辅酶Q10相对于甲醇溶液的溶解度
使用辅酶Q10标准品(和光纯药社制),考察相对于甲醇水溶液的辅酶Q10的溶解度与溶液的浓度和温度之间的关系。结果如图1所示。
辅酶Q10的溶解度与甲醇浓度与甲醇水溶液温度成比例的增加。
实施例3 从辅酶Q10生产菌的菌体中纯化辅酶Q10
将采用与实施例1同样的方法得到的80g类球红细菌ATCC 21286的湿菌体用水洗涤3次,得到洗净菌体。向该洗净菌体中加入作为提取溶剂的甲醇500ml,在20℃下搅拌1小时后,离心分离,除去含有大量夹杂物的甲醇溶液相。对得到的沉淀物重复上述甲醇提取操作2次。
接着,再次加入甲醇,在60℃下搅拌1小时后,通过过滤得到提取液。该提取液中相对于含有1重量份的3-脱甲氧基辅酶Q10,含有99重量份的辅酶Q10。
通过将该提取液用5小时以上冷却至20℃,使辅酶Q10析出,得到辅酶Q10的粗结晶。在40℃的甲醇中溶解该结晶至浓度为0.5g/L后,通过用5小时冷却至20℃,得到辅酶Q10的结晶。该结晶的纯度为99.5%。
实施例4 从辅酶Q10生产菌的干燥菌体中纯化辅酶Q10
向采用与实施例1同样的方法得到的培养物离心分离而得到的80g湿菌体中添加水,使其恢复浆状后,通过喷雾干燥得到干燥菌体(水分含量为2.0w/w%)。向该干燥菌体中加入作为提取溶剂的500ml甲醇,在20℃下搅拌1小时后,离心分离,除去甲醇溶液相。对得到的沉淀物重复上述甲醇提取操作2次。
接着,再次加入甲醇,在60℃下搅拌1小时后,通过过滤得到提取液。该提取液中,相对于含有1重量份的3-脱甲氧基辅酶Q10,含有99重量份的辅酶Q10。
通过将该提取液用5小时以上冷却至20℃,使辅酶Q10析出,得到辅酶Q10的粗结晶。在40℃的甲醇中溶解该结晶至浓度为0.5g/L后,通过用5小时冷却至20℃,得到辅酶Q10的结晶。该结晶的纯度为99.5%。
实施例5 由辅酶Q10生产菌的培养物中纯化辅酶Q10
在采用与实施例1同样的方法得到的培养物0.5L中加入0.5L甲醇,在20℃下搅拌1小时后,离心分离,除去甲醇溶液相。对所得的沉淀物重复上述甲醇提取操作3次。
然后,再次加入甲醇,在60℃下搅拌1小时后,通过过滤得到提取液。该提取液中,相对于含有1重量份的3-脱甲氧基辅酶Q10,含有99重量份的辅酶Q10。
通过将该提取液用5小时以上冷却至20℃,使辅酶Q10析出,得到辅酶Q10的粗结晶。在40℃的甲醇中溶解该结晶至浓度为0.5g/L后,通过用5小时以上冷却至20℃,得到辅酶Q10的结晶。该结晶的纯度为99.5%。
实施例6 使用甲醇水溶液纯化辅酶Q10
将采用与实施例1同样的方法得到的培养物离心分离而得到的80g湿菌体用水洗涤,得到洗净菌体。向该菌体中添加80v/v%的甲醇水溶液,在20℃下搅拌1小时后,离心分离,除去甲醇溶液相。对得到的沉淀物重复上述甲醇提取操作5次。
接着,添加95v/v%的甲醇溶液,在60℃下搅拌1小时后,通过过滤得到提取液。该提取液中,相对于含有1重量份的3-脱甲氧基辅酶Q10,含有99重量份的辅酶Q10。
通过将该提取液用5小时以上冷却至20℃,使辅酶Q10析出,得到辅酶Q10的粗结晶。然后,在40℃的甲醇中溶解该结晶至浓度为0.5g/L后,通过用5小时以上冷却至20℃,得到辅酶Q10的结晶。该结晶的纯度为99.5%。
实施例7 从辅酶Q10的粗纯化物中纯化辅酶Q10
将采用与实施例1同样的方法制得的培养物离心分离而得到的湿菌体参照常规方法使用2-丁醇提取出辅酶Q10,参照常规方法使该提取液中的辅酶Q10吸附和解吸于合成吸附树脂,通过使得到的含辅酶Q10的级分浓缩结晶,得到纯度为82.9%的辅酶Q10粗纯化物。向该粗纯化物中添加80v/v%的含水甲醇溶液,在20℃下搅拌1小时后,离心分离,除去甲醇溶液相。对得到的沉淀物重复上述甲醇提取操作5次。
接着,添加95v/v%的甲醇溶液,在60℃下搅拌1小时后,通过过滤得到提取液。该提取液中,相对于含有1重量份的3-脱甲氧基辅酶Q10,含有99重量份的辅酶Q10。
通过将该提取液用5小时以上冷却至20℃,使辅酶Q10析出,得到辅酶Q10的粗结晶。然后,在40℃的甲醇中溶解该结晶至浓度为0.5g/L后,通过用5小时以上冷却至20℃,得到辅酶Q10的结晶。该结晶的纯度为99.5%。
工业实用性
通过本发明方法,可以经济地从有生产辅酶Q10能力的微生物的培养物、该培养物的处理物或辅酶Q10粗纯化物中纯化出高纯度的辅酶Q10。
Claims (6)
1.含有辅酶Q10的溶液的制备方法,包括以下步骤:
[1]向有生产辅酶Q10能力的微生物在培养基中培养得到的培养物、该培养物的处理物或辅酶Q10的粗纯化物中,加入甲醇溶液至浓度为50~100v/v%,温度保持在0℃以上、30℃以下的步骤;
[2]从步骤[1]得到的溶液中分离获得不溶物的步骤;
[3]向步骤[2]得到的不溶物中加入85~100v/v%的浓度的甲醇溶液,保持温度在高于30℃、80℃以下的步骤;和
[4]除去步骤[3]得到的溶液中的不溶物的步骤。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,向权利要求1中所述的方法的步骤[2]得到的不溶物中再次加入甲醇溶液至浓度为50~100v/v%,保持温度在0℃以上、30℃以下后,分离获得不溶物的步骤重复一次以上,然后进行权利要求1所述的步骤[3]以后的步骤。
3.如权利要求1或2所述的方法,有生产辅酶Q10能力的微生物选自担子菌、真菌、酵母和细菌。
4.如权利要求1或2所述的方法,其特征在于,培养物的处理物为从微生物的培养物的浓缩物、该培养物的干燥物、从该培养物中分离得到的菌体、该菌体的干燥物、该菌体的冻干物、洗涤该菌体得到的洗净菌体、该洗净菌体的干燥物或该洗净菌体的冻干物。
5.辅酶Q10的结晶的制备方法,其特征在于,使辅酶Q10的结晶从权利要求1或2所述的方法中得到的含有辅酶Q10的溶液中结晶析出。
6.如权利要求5所述的方法,辅酶Q10的结晶为90.0%以上纯度的结晶。
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