JPH0249716B2 - Hatsukohobitaminb12noseiho - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、プロピオニバクテリウム
（Propionibacterium）属に属するビタミンB₁₂生
産菌を培地に培養して、菌体内に蓄積するビタミ
ンB₁₂を採取するビタミンB₁₂の製法に関し、と
くに、特定の炭素源を含有する培地を用いて上記
培養を行なうことによつて、顕著に改善された生
産量でビタミンB₁₂で取得できる改善方法に関す
る。

更に詳しくは、本発明は、プロピオニバクテリ
ウム属に属するビタミンB₁₂生産菌を培地に培養
し、菌体内に蓄積するビタミンB₁₂を採取する醗
酵法ビタミンB₁₂の製法に於いて、炭素源として
フラクトースを含有する培地で該ビタミンB₁₂生
産菌を培養することを特徴とする醗酵法ビタミン
B₁₂の製法に関する。

従来、ビタミンB₁₂生産菌たとえばプロピオニ
バクテリウム属に属するビタミンB₁₂生産菌を培
地中で培養して、菌体内に蓄積するビタミンB₁₂
を採取するビタミンB₁₂の製法は知られている
（例えば、米国特許2951017（1960））。

本発明者等は、プロピオニバクテリウム属に属
するビタミンB₁₂生産菌を利用して、ビタミン
B₁₂を製造する醗酵法ビタミンB₁₂の製法につい
て検討を進めてきた。

その結果、プロピオニバクテリウム属に属する
ビタミンB₁₂生産菌による醗酵法ビタミンB₁₂の
製造に際して、プロピオニバクテリウム属に属す
るビタミンB₁₂生産菌資化利用困難な廃糖蜜を、
加水分解処理して得られる廃糖蜜の加水分解生成
物が、プロピオニバクテリウム属に属するビタミ
ンB₁₂生産菌のビタミンB₁₂の菌体内蓄積量をた
とえば、約２倍もしくはそれ以上にも顕著に増大
させる炭素源として有用であることを発見した。

更に、研究を進めた結果、廃糖蜜の加水分解物
中に含有されるフラクトースが、上記ビタミン
B₁₂の蓄積の増大に関与していること、更に、該
加水分解物に共存するグルコースの共存によつて
上記増大効果が妨害されないことを発見した。更
に又、該加水分解物に代えて、フラクトースが利
用でき且つ該フラクトースの一部とくにはほゞ半
量までの範囲の量をより安価なグルコースで代換
しても該フラクトースの上記増大効果が妨害され
ないことを発見した。

更に、工業廃物である安価且つ入手容易な上記
廃糖蜜を、加水分解処理して得られる廃糖蜜加水
分解生成物が、フラクトース及びグルコース以外
に更に共存含有している何等かの他成分が、これ
らフラクトース及びグルコースと協同的に作用す
るためと推測しているが、より好ましい結果を示
し、醗酵法ビタミンB₁₂生産コストの約1/3を占
める炭素源として安価且つ入手容易な工業廃物か
らの加水分解処理物が利用できる利点と相俟つ
て、本発明方法の工業的価値を一層高めることを
知つた。

従つて、本発明の目的は、改善された醗酵法ビ
タミンB₁₂の製造を提供するにある。

本発明の上記目的及び多くの他の目的ならびに
利点は、以下の記載から一層明らかとなるであろ
う。

本発明方法によれば、炭素源としてフラクトー
スを含有する培地に於て、プロピオニバクテリウ
ム属に属するビタミンB₁₂生産菌を培養し、菌体
内に蓄積するビタミンB₁₂を採取する。

廃糖蜜は、製糖工業の副産物であつて、製糖原
料である列えばサトウキビ、テンサイ汁などを濃
縮し、砂糖の晶出採取を繰返して、母液中の非糖
性有機物、転化糖、塩類などの含量が増加すると
ともに粘度が高まり、砂糖が経済的に晶出採出で
きなくなつた時に残つたシロツプ状の黒褐色副産
物である。本発明に於ては、このような廃糖蜜を
加水分解した加水分解生成物、任意の製法で得ら
れたフラクトース、更には該フラクトースの一部
好ましくは約50重量％までの範囲の量を、より安
価なグルコースで代換したフラクトース及びグル
コース混合物などを、炭素源として利用すること
ができる。

上記廃糖蜜の加水分解は、例えば塩酸、硫酸の
如き無機酸を、該廃糖蜜シロツプ状液もしくはそ
の水性稀釈液に、液のPHが約１〜約４になるよう
に添加し、温度約60゜〜約120℃で加水分解処理す
ることにより行うことができる。処理時間は適宜
に選択できるが、例え約10〜約30分の如き処理時
間を例示することができる。

あるいはまた転化酵素インベルターゼを使用し
て行うこともできる。例えば酵素インベルターゼ
を該廃糖蜜重量に対して約0.05〜約0.5％になる
よう添加し、PH約３〜約６、温度約20〜約60℃で
転化処理することにより行うことができる。処理
時間は適宜選択できるが、例えば約２〜約24hrの
如き処理時間を例示することができる。

本発明方法に於ては、炭素源として上記例示の
如きフラクトース含有培地を用いるほかは、それ
自体公知の培地、培養条件で実施できる。培地と
しては、炭素源、窒素源を含有し、所望により、
更にミネラル類、ビタミン類、ビタミンB₁₂構成
成分などを含有する培地を利用することができ
る。該炭素源としては、上述の如きフラクトース
もしくはフラクトース含有炭素源を利用するが、
更に他の炭素源を含有して差支えない。このよう
な他の炭素源としては、例えば、グルコース、マ
ンノース、ガラクトースの如き他の糖質類、例え
ば乳酸、酒石酸の如き有機酸類、例えば、グリセ
リンの如きアルコール類などを例示することがで
きる。これら他の炭素源は単独でも複数種適宜に
組み合わせてでも利用することができる。

又、窒素源の例としては、たとえば、アンモニ
ア塩類、硝酸塩類などの如き無機窒素化合物；た
とえば、ペプトン、酵母エキス、カゼイン、肉エ
キス、コーン、ステープ、リカー、サングロス、
尿素、大豆粕、魚粕、醗酵廃棄物、等を例示する
ことができる。

更に、５，６―ジメチルベンズイミダゾールの
如きビタミンB₁₂構成成分、リン酸塩類、マグネ
シウム塩類、カリウム塩類、カルシウム塩類、マ
ンガン塩類、コバルト塩類、鉄塩類、亜鉛塩類、
モリブデン塩類、銅塩類、アルミニウム塩類、パ
ントテン酸の如きビタミン類などの如きミネラル
類乃至ビタミン類、ビタミンB₁₂構成成分類など
を例示することができる。

培養は好ましくは嫌気性条件下に行うことがで
き、培養方式としては、例えば静置培養方式、
N₂ガスやCO₂ガスによる通気撹拌培養方式など
の培養方式を好ましく例示できる。培養温度とし
ては約25゜〜約37℃の温度条件、培養PHとしては
約４〜約8.5、より好ましくは約５〜約7.5、更に
は約６〜約７程度のPH条件を例示することができ
る。培養PHは、適時に例えば、炭酸ナトリウム、
水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア
水などの如きアルカリ類を培養系に添加して、上
記例示PH範囲に系のPHを調整して行うのがよい。
日数としては約３〜約10日程度の日数を例示する
ことができる。

本発明方法に於ては、プロピオニバクテリウム
属に属するビタミンB₁₂生産菌を利用する。

このようなビタミンB₁₂生産菌としては、例え
ば、プロピオニバクテリウム・シヤーマニー
（Propionibacterium shermanii）IFO12391株
〔Institute for Fermentation，OSAKA，
Japan；自由分譲公知菌〕；プロピオニバクテリ
ウム・フロイデンライヒ（Propionibacterium
freudenreichii）IFO12424株〔Insititute for
Fermentaion，OSAKA，Japan；自由分譲公知
菌〕などを例示することができる。上記例示菌株
は、夫々、上記した寄託機関に、上記した寄託番
号で寄託されている公知自由分譲菌である。又、
他のビタミンB₁₂生産菌として沈降速度の向上し
たプロピオニバクテリウム・シマーマニー
NOC11011菌株〔FERMBP―85；Fermentation
Research Institute，Agncy of Industrial
Sience and Technology，Japan；ブタペスト条
に基づく国際寄託菌〕、更に、プロピオン酸耐性
を賦与されたビタミンB₁₂生産菌プロピオニバク
テリウムシヤーマニイNOC11012〔FERM BP―
86；Fermentation Research Institute Agency
of Industrial Sience and Technology，
Japan；ブタペスト条約に基づく国際寄託菌〕、
プロピオン酸耐性を賦与されたビタミンB₁₂生産
菌プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ
NOC11013〔FERM BP―87；Fermentation
Research Institue Agency of Industrial
Sience and Technology，Japan；ブタペスト条
約に基づく国際寄託菌〕などを利用することがで
きる。

上記プロピオニバクテリウム・シヤーマニー
NOC11011菌株の菌学的性質は、培養系を静置し
た際の菌体の沈降速度が親菌株プロピオニバクテ
リウム・シヤーマニーIFO12391株より速いとい
う以外は、該親菌株について公知のそれらと同一
である。又、上記プロピオニバクテリウム・シヤ
ーマニNOC11012菌株の菌学的性質は、プロピオ
ン酸耐性がより大であるという以外は、その親菌
株であるプロピオニバクテリウム・シヤーマニー
IFO12391株について公知のそれらと同一である。
更に、上記プロピオニバクテリウム・フロイデン
ライヒNOC11013菌株の菌学的性質は、プロピオ
ン酸耐性がより大であるという以外は、その親菌
株であるプロピオニバクテリウム・フロイデンテ
イヒIFO12424株について公知のそれらと同一で
ある。そして、これら親菌株の菌学的性質は公知
であり、例えば、Bergy′s Manual of
Determinative Bacteriology，第８版に記載さ
れている。

尚、上記プロピオニバクテリウム・シヤーマニ
ーNOC11011の製法については同一出願人の同日
付出願に係わる特願昭57−29063号（特開昭58−
146292号）（発明の名称：醗酵法ビタミンB₁₂の
製造方法）の参考例１に例示されており、又、上
記プロピオニバクテリウム・シヤーマニー
NOC11012及びプロピオニバクテリウム・フロイ
デンテイヒNOC11013に代表されるプロピオン酸
耐性菌株の製法は、同一出願人の同日付出願に係
わる特願昭57−29065号（特開昭58−149695号）
（発明の名称：醗酵法ビタミンB₁₂の製法及びそ
の生産菌）に詳しく開示されている。

本発明方法によれば、プロピオニバクテリウム
（Propionibacterium）属に属するビタミンB₁₂生
産菌を培地に培養し、菌体内に蓄積するビタミン
B₁₂を採取する醗酵法ビタミンB₁₂の製法に於て、
炭素源としてフラクトースを含有する培地で該ビ
タミンB₁₂生産菌を培養することによつて、顕著
に増大された生産量でビタミンB₁₂を生産させる
ことができる。

ビタミンB₁₂の採取は、培養ブロスを例えば遠
心分離処理して菌体を分離採取し、該菌体からビ
タミンB₁₂を分離採取することにより行うことが
できる。

該ビタミンB₁₂の菌体からの分離採取、更には
精製は、種々の手段で行うことができる。

例えば、補酵素型ビタミンB₁₂（５，６―ジメ
チルベンズイミダゾールコバルドエンザイム）の
形で、菌体内から分離する場合には、採取した菌
体、もしくは菌体細胞膜を例えば磨砕の如き物理
的手段や超音波手段で破砕した菌体破砕物を、メ
タノール、エタノール、イソプロパノールなどの
如きアルコール類がピリジンなどの如き溶剤を用
いて、暗所で抽出することにより、菌体から抽出
分離することができる。又、ヒドロキソコバラミ
ンの形で菌体から抽出分離する場合には、上述の
ようにして得られる補酵素型ビタミンB₁₂の抽出
液に光を当てることにより、ヒドロキソコバラミ
ンの形に転化させることができる。更にシアノコ
バラミンの形で菌体から抽出分離する場合には、
上述の如き溶媒とシアン塩たとえば、KCN、
NaCNなどの共存下に抽出することにより、シア
ノコバミランの形で抽出分離することができる。

又、他の態様によれば、菌体の細胞膜を上述の
ようにして破砕した菌体破砕物液、或は又菌体も
しくはその破砕物を上記例示の如き抽出溶媒で抽
出した抽出液などの如き挾雑成分を含むビタミン
B₁₂含有液を、吸着剤を用いて吸着―溶出処理す
ることにより一挙に精製分離することもできる。
この態様においては、同一出願人の先願発明に係
わる手段を利用することができる。

例えば、同一出願人の出願に係わる特願昭55−
167375号（特開昭57−91739号）に開示された提
案に従つて、例えば、前述の如き菌体もしくは菌
体破砕物の溶媒抽出液や菌体破砕物液の如き挾雑
成分を含むビタミンB₁₂含有液を、ジビニルベン
ゼン、スチンもしくはその官能性誘導体、例え
ば、メチルスチレン、エチルスチレン、ジメチル
スチレン、プロピルスチレンなどのC₁〜C₆アル
キル基を有するアルキル置換誘導体の如き官能性
誘導体、及び下記式 但し式中、Ｒは炭素―炭素間二重結合を有する
C₅〜C₁₀の不飽和アルキル残基を示し、ｎは２又
は３である、 で表わされる芳香族多価カルボン酸不飽和アルキ
ルエステル、例えば、１，２，４―ベンゼントリ
カルボン酸ナリイソプロペニルエステル、テレフ
タル酸ジイソプロペニルエステルの如きジ―もし
くはトリ―C₃〜C₁₀アルケニルエステル類、より
導かれた共重合体樹脂であつて且つ表面積が約
700m²／ｇ以上の樹脂と接触させて、該樹脂にビ
タミンB₁₂を吸着させ、該吸着されたビタミン
B₁₂を溶出剤により溶出させて活性溶出分画を取
得する態様で行うことができる。上記吸着及び溶
出はバツチ方式でもカラム・クロマトグラフイー
方式でも行うとができる。吸着は、例えばPH約５
〜約８、より好ましくは約７前後のPH条件及び例
えば約10゜〜約30℃の如き温度条件で行うことが
できる。又、吸着処理後、所望により洗条処理を
施し、溶出処理を行つて活性溶出分画を得ること
ができる。

上記洗条処理としては、例ええば水、低濃度の
含水アルコール類たとえば５％メタノール水、２
％エタノール水、１％イソプロパノール水による
洗条処理を例示できる。

又、上記溶出剤としては、普通の溶出剤が利用
でき、例えば、低級アルコール類、酸類、アルカ
リ類及び塩類よりなる群からえらばれた溶出剤を
含有する水性溶液を例示することができる。この
ような溶出剤の具体例としては、たとえば、メタ
ノール、エタノール、イソプロパノールの如き低
級アルコール類；たとえば、りん酸、酢酸、ホウ
酸、塩酸の如き酸類；たとえば、水酸化ナトリウ
ム、リン酸―アンモニウム、りん酸二アンモニウ
ム、水酸化アンモニウムの如きアルカリ類；たと
えば、炭酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、りん酸
ナトリウム、りん酸カリウムの如き塩類；を例示
することができる。このような溶出剤の種類は、
挾雑成分の種類及び量、吸着剤樹脂の種類などに
よつても、適宜に選択できるが、低級アルコール
類の水溶液の利用が好ましく、例えば、25〜50％
メタノール、15〜40％エタノール、６〜20％イソ
プロパノール等の如きアルコール含量約50％以下
の含水アルコール類の利用が例示できる。溶出操
作も室温で行うことができ、とくに加温もしくは
冷却の必要はないが望むならば行つてもよい。例
えば約30〜約67℃の如き操作温度を例示すること
ができる。

このようにして溶出した活性溶出分画を取得
し、所望により、濃縮、再結晶化などを行うこと
ができる。

又例えば、同一出願人の出願に係わる特願昭55
−167374号に開示された提案に従つて、前述の如
き挾雑成分を含むビタミンB₁₂含有液を、最多頻
度細孔径〔「多孔材料」31〜73頁（近藤連一著、
昭和48年９月５日技報堂発行）に記載される測定
及び決定方法により得られる値〕が約200Å以上
で、好ましくは約250Å以上、たとえば約200〜約
1200Åで、且つ細孔容積が0.6ml／ｇを超える、
たとえば0.6ml／ｇを超え約1.2ml／ｇ程度の範囲
の、ジビニルベンゼン／スチレン系共重合体樹脂
と接触させて、該銃脂にビタミンB₁₂を吸着さ
せ、該吸着されたビタミンB₁₂を溶出剤により溶
出させて活性溶出分画を取得する態様で行うこと
もできる。

この際、利用できる市場で入手可能な該樹脂の
例としては、ダイヤイオンHP―10、HP―20、
HP―30、HP―40、HP―50（商品名：三菱化成
社製品）などを例示することができる。このよう
な樹脂は、ジビニルベンゼンとスチレンもしくは
その官能性誘導体、たとえば前記例示の如きスチ
レンの官能性誘導体、との共重合反応によつて製
造することもできる。

吸着及び溶出操作及び条件は前記提案について
説明したと同様な操作及び条件で行うことができ
る。吸着後、所望により行う洗条処理、溶出処理
の操作及び条件についても、前記提案について説
明したと同様な操作及び条件で行うことができ
る。

本発明方法の実施に際しては、上述のようにし
て菌体からビタミンB₁₂を採取、更に所望により
精製することができる。精製手段としては、他の
公知手段も利用でき、例えば、フエノール抽出手
段、活性炭により吸着手段、高分子樹脂による吸
着手段、あるいはカラムクロマトグラフイー手段
などを適宜組み合わせて行うことができる。

以下、実施例により、本発明方法実施の数例に
ついて更に詳しく説明する。

実施例 １ 廃糖蜜（含水率50％）100ｇを水１に溶かし、
塩酸でPH２に調整し、100℃で30分間加熱加水分
解した。分解液１に対してコーンスチープリカ
ー40ｇ、NH₄NO₃3ｇ、KH₂PO₄0.4ｇ、
Na₂HPO₄・12H₂O1.5ｇ、MgSO₄・7H₂O0.5ｇ、
Co（NO₃）₂・6H₂O15mg、ZnSO₄・7H₂O10mg、
MnSO₄・4H₂O5mg、CuSO₄.5H₂O50μｇ、
（NH₄）₆Mo₇O₂₄・4H₂O10μｇ、パントテン酸カ
ルシウム５mg、５，６−ジメチルベンズイミダゾ
ール10mgおよびCaCO₃10ｇを含む培地PH７に調
整し500ml容量の三角フラスコに200ml入れ120℃
で10分間加圧蒸気殺菌した。

上記培地にProp.shermaniiIFO12391を植菌し
30℃で７日間静置培養した。なお、培養中のPHは
１日１回20％Na₂CO₃を用いて７付近に間欠調整
した。

B₁₂の定量は以下のようにして行つた。すなわ
ち、培養液0.3mlに酢酸バツフアー（PH4.7）4.5ml
とKCN1ｇ／液１mlとを加え85℃以上で15分間
煮沸し、菌体内のB₁₂を温水抽出すると同時に安
定なCN型にかえる。これをB₁₂要求菌である
Lactobacillus leichmannii ATCC7830を用い、
シアノコバラミンを基準として微生物定量した。

培養７日目のB₁₂生産量を求めたところ21mg／
であつた。

比較例 １ 実施例１に示した廃糖蜜100ｇの代りにグルコ
ース50ｇを水１に溶かし、他同様の培地成分を
同量加えProp.shermaniiIFO12391を植菌し７日
間静置培養を行つた。培養７日目のB₁₂生産量を
求めたところ10mg／であつた。

実施例 ２ 実施例１に示した廃糖蜜100ｇの代りにフラク
トース50ｇを水１に溶かし、他同様の培地成分
を同量加えProp.shermaniiIFO12391を植菌し７
日間静置培養を行つた。培養７日目のB₁₂生産量
を求めたところ24mg／であつた。

実施例 ３ 廃糖蜜（含水率50％）100ｇを水１に溶かし、
塩酸でPH２に調整し、100℃で30分間加熱加水分
解した。分解液１に対してコーンスチープリカ
ー40ｇ、NH₄NO₃3ｇ、KH₂PO₄0.4ｇ、
Na₂HPO₄・12H₂O1.5ｇ、MgSO₄・7H₂O0.5ｇ、
Co（NO₃）₂・6H₂O15mg、ZnSO₄・7H₂O10mg、
MnSO₄・4H₂O5mg、CuSO₄.5H₂O50μｇ、
（NH₄）₆MO₇O₂₄・4H₂O10μｇ、パントテン酸カ
ルシウム５mg、５，６−ジメチルベンズイミダゾ
ール10mgおよびCaCO₃10ｇを含む培地をPH７に
調整し500ml容量の三角フラスコに200mlに入れ
120℃で10分間加圧蒸気殺菌した。

上記培地にProp.freudenreiciiIFO12424を植菌
し30℃で７日間静置培養した。なお、培養中のPH
は１日１回20％Na₂CO₃を用いて７付近に間欠調
整した。

B₁₂の定量は以下のようにして行つた。すなわ
ち、培養液0.3mlに酢酸バツフアー（PH4.7）4.5ml
とKCN1ｇ／液１mlとを加え85℃以上で15分間
煮沸し、菌体内のB₁₂を温水抽出すると同時に安
定なCN型にかえる。これをB₁₂要求菌である
Lactobacillus leichmannii ATCC7830を用い、
シアノコバラミンを基準として微生物定量した。

培養７日目のB₁₂生産量を求めたところ15mg／
であつた。

比較例 ２ 実施例３に示した廃糖蜜100ｇの代りにグルコ
ース50ｇを水１に溶かし、他同様の培地成分を
同量加えProp.freudenreichiiIFO12424を植菌し
７日間静置培養を行つた。培養７日目のB₁₂生産
量を求めたところ７mg／であつた。

実施例 ４ 実施例３に示した廃糖蜜100ｇの代りにフラク
トース50ｇを水１に溶かし、他同様の培地成分
を同量加えProp.freudenreichiiIFO12424を植菌
し７日間静置培養を行つた。培養７日目のB₁₂生
産量を求めたところ17mg／であつた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ プロピオニバクテリウム（Propionibact−
   erium）属に属するビタミンB₁₂生産菌を培地に
   培養し、菌体内に著積するビタミンB₁₂を採取す
   る醗酵法ビタミンB₁₂の製法に於て、炭素源とし
   てフラクトースを含有する培地で該ビタミンB₁₂
   生産菌を培養することを特徴とする醗酵法ビタミ
   ンB₁₂の製法。 ２ 該炭素源として該フラクトースのほかにグル
   コースを含有する培地で培養することを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項記載の製法。 ３ 該炭素源としてフラクトース及びグルコース
   を含有する廃糖蜜の加水分解生成物を含有する培
   地で培養することを特徴とする特許請求の範囲第
   １項もしくは第２項記載の製法。