JP3840538B2 - Ｄ‐タガトースの製造方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物を用いてＤ‐プシコースからＤ‐タガトースを効率よく製造するための新規な方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、自然界ではわずかしか生成されない希少糖類、例えばＤ‐プシコース、Ｄ‐タガトース、Ｄ‐アロース、Ｄ‐タリトール、Ｄ‐アリトールなどが機能性素材又は天然活性物質として注目を浴びるようになってきている。そして、これらのうち、Ｄ‐プシコースやＤ‐タガトースなどの一部のものは、化学的に合成され［「カーボハイドレート・リサーチ（Ｃａｒｂｏｈｙｄ．Ｒｅｓ．）」，第７０巻，第２０９ページ（１９７９）］、市販されている。
しかしながら、これまで知られている化学的な合成法は煩雑であり、非常に生産効率が低く、しかも高純度の製品を得ることが困難なため、大量生産には不適当でコスト高になるのを免れない。
【０００３】
他方、化学的な合成法に代る製造方法として、バイオテクノロジーを利用する方法、例えば、Ｄ‐タガトース‐３‐エピメラーゼを固定化したバイオリアクターを用い、Ｄ‐フルクトースを原料としてＤ‐プシコースを製造する方法が提案され［「ジャーナル・オブ・バイオサイエンス・アンド・バイオエンジニアリング（Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．）」，第９０巻，第４５３ページ（２０００）］実用化段階に入っている。このようなバイオテクノロジーを利用した生物学的な方法は、酵素特有の高い基質特異性により高純度の目的物を得ることができるので有利であり、種々の希少糖類の製造にも応用されている。
【０００４】
ところで、これまでＤ‐タガトースの生物学的な方法については、例えばアースロバクター・グロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）の菌体を用いる方法［「アプライド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）」，第４８巻，第１０５５ページ（１９８４）］や、酢酸菌の菌体を用いる方法［「プロセスバイオケミストリー（Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．）」，第３６巻、第９７１ページ（２００１）］、これらの微生物が生産する酵素すなわちＬ‐アラビノースイソメラーゼを固定化したバイオリアクターを用いる方法［「バイオテクノロジー・レターズ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．）」，第２３巻，第１８５ページ（２００１）及び「アプライド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）」，第４６巻，第１０５５ページ（１９８４）］などが提案されているが、まだ十分満足できる生産効率で得ることはできなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような事情のもとで、高純度のＤ‐タガトースを効率よく安価に製造しうる生物的な方法を提供することを目的としてなされたものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、Ｄ‐タガトースを得るための生物学的な方法について種々研究を重ねた結果、リゾプス属に属する微生物の中に、Ｄ‐プシコースを消化することなく、これをＤ‐タガトースに効率よく転換する微生物が存在すること、及びこれをＤ‐プシコースの存在下で培養すれば高純度のＤ‐タガトースが生産されることを見出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、リゾプス・アセトイヌス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ａｃｅｔｏｉｎｕｓ）又はリゾプス・オリゴスポラス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓ）を、Ｄ‐プシコースの存在下において培養したのち、培養液中よりＤ‐タガトースを取得することを特徴とするＤ‐タガトースの製造方法を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明方法において用いる、リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、リゾプス・アセトイヌス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ａｃｅｔｏｉｎｕｓ）、リゾプス・オリゴスポラス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓ）は、接合菌類接合菌亜門（Ｚｙｇｏｍｉｃｏｔｉｎａ）、ケカビ目クモノスカビ属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）に属するもので、Ｄ‐プシコースをＤ‐タガトースに転化する能力を有し、かつＤ‐プシコースを消化しないものである。
【０００９】
本発明方法においては、まず上記のリゾプス属微生物の胞子を発芽可能な炭素源例えばＤ‐グルコース、窒素源、無機塩などを含有する培地を用いて培養する。この培地としては、微酸性ないし中性の液体培地を用いるのが好ましい。そして、２０〜３５℃において、１〜２日間通気撹拌などの好気的条件下で培養し、胞子を発芽させ菌体としたのちＤ‐プシコースを無菌的に培養系に添加する。Ｄ‐プシコースの添加濃度は５〜１２ｇ／リットルにするのが好ましい。このようにして、Ｄ‐プシコースの追加後に培養をさらに２〜１３日間継続することによって添加されたＤ‐プシコースが効率的にＤ‐タガトースに転化される。
【００１０】
本発明方法においては、また糸状菌の培養に使用される一般的な培地で培養した菌体そのものを用いて行うこともできる。例えば、麦芽エキス培地あるいはポテトデキストロース培地などで２０〜３５℃にて３〜７日間培養して得られた菌体に、ｐＨ４〜７のリン酸緩衝液又は酢酸緩衝液などに溶解したＤ‐プシコース溶液を添加して２０〜３５℃で１〜５日間撹拌インキュベートすることによってＤ‐タガトースを得ることができる。この際のＤ‐プシコース溶液の濃度としては、８〜５０ｇ／リットルの範囲が好ましい。
【００１１】
このようにして得られたＤ‐タガトースは、例えば活性炭処理法による脱色、各種の陽イオン及び陰イオン交換樹脂による脱塩処理法などで精製し、濃縮してシラップとして収得することができる。所望ならば、これを種々のイオン交換体を用いる液体クロマトグラフィー、例えばダウケミカル社製の商品名ダウエックス５０Ｗ−Ｘ２などによるカラムクロマトグラフィー、日立製作所製の商品名ＧＬ−６１１カラムを装着した高速液体クロマトグラフィーなどによりさらに精製したのち、濃縮、結晶化し高純度の製品とすることができる。
【００１２】
本発明方法によると、Ｄ‐タガトースは原料のＤ‐プシコースに対し約２５ｗ／ｗ％以上の高収率で得られるので、工業的製造法として好適であり、これにより医薬品工業あるいは食品工業をはじめとする各種産業における原料もしくは中間体としてＤ‐タガトースを大量かつ安価に供給することができる。
【００１３】
【実施例】
次に、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定されるものではない。
【００１４】
実施例１
まず、グルコース２ｇ／リットル、硫酸アンモニウム２ｇ／リットル、リン酸二カリウム１ｇ／リットル、硫酸マグネシウム０．５ｇ／リットル、ＫＣｌ０．５ｇ／リットル、硫酸第二鉄１０ｍｇ／リットルよりなる培地を１Ｍ−ＮａＯＨによりｐＨ６．０に調整し、その５０ｍｌを５００ｍｌ三角フラスコに分注し、オートクレーブ滅菌した。この培地にリゾプス・オリザエＹＰＦ−６１Ａ株［アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）登録番号ＭＹＡ−２４８３］の胞子を１０⁴／ｍｌになるよう接種し、３０℃で１日間培養した。そののち、発芽した菌体を含む培養系にＤ‐プシコースを１２ｇ／リットルになるよう無菌的に添加し、同一の条件下で培養を８日間継続した。
【００１５】
培養後、培養液から菌体をろ去し、ろ液を常法に従い活性炭で処理して脱色した。次いで陽イオン交換樹脂［三菱化学製、商品名「ダイヤイオンＳＫ１Ｂ（Ｈ型）」］及び陰イオン交換樹脂［オルガノ社製、商品名「アンバーライトＩＲＡ−４１１（ＣＯ₃型）」］で脱塩処理したのち、減圧濃縮を行い、Ｄ‐プシコース及び少量の無機イオンを不純物として含む糖濃度約２９．４質量％のシラップを得た。次に陽イオン交換樹脂［ダウケミカル社製、商品名「ダウエックス５０Ｗ−Ｘ２（Ｃａ型）」］を用い、一次交換水を溶出液としてカラムクロマトグラフィーを行い、Ｄ‐タガトースを分離、精製した。その溶出位置は、標準物質としての試薬Ｄ‐プシコースとは異なり、試薬Ｄ‐タガトースと同一の３７．１分であった。この溶出液を高速液体クロマトグラフィーで分析したところ、標準物質としての試薬Ｄ‐プシコースの溶出位置とは異なり、試薬Ｄ‐タガトースと同一の溶出位置２３．０分であった。この操作により３．０ｇ／リットルのＤ‐タガトースが得られた。
この際の高速液体クロマトグラフィー分析は、ＧＬ−Ｃ６１１カラム（日立製作所製）及び８８０Ｐｕ（日本分光社製）を用い、溶離液０．０１ｍＭ−ＮａＯＨ、温度６０℃、流速１ｍｌ／ｍｉｎの条件下、検出器（島津製作所製、商品名「ＲＩＤ−６Ａ」）で行った。
【００１６】
実施例２
グルコース３０ｇ／リットル、ポリペプトン５ｇ／リットル、酵母エキス２ｇ／リットル、リン酸二カリウム１ｇ／リットル、硫酸マグネシウム０．５ｇ／リットルよりなる培地を２Ｍ−ＨＣｌでｐＨ５．０に調整し、その１００ｍｌを５００ｍｌ三角フラスコに分注し、オートクレーブ滅菌した。このものにリゾプス・アセトイヌスＨＵＴ１２１９株の胞子（財団法人発酵研究所より購入）を一白金耳量接種し、３０℃で４日間培養した。次いで培養菌体をろ別して回収し、蒸留水で洗浄した。次に、Ｄ‐プシコースを１０ｇ／リットルになるように５０ｍＭ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した溶液１００ｍｌを３００ｍｌ容三角フラスコに分注し、これに培養菌体１ｇ（湿重量）を添加した。このものを、３０℃で４６時間振とうしつつインキュベートし反応させた。
【００１７】
反応終了後、菌体をろ去し、実施例１と同様に脱塩、精製を行いＤ‐タガトースを得た。このものを高速液体クロマトグラフィー（島津製作所製ＬＣ−１０ＡＤ、カラム；島津製作所製ＳＣＲ−１０１Ｐ、溶出液；蒸留水，温度８０℃、流速；１ｍｌ／ｍｉｎ、検出器；島津製作所製ＲＩＤ−１０Ａ）により分析したところ、標準物質としての試薬Ｄ‐プシコースの溶出位置とは異なる、試薬Ｄ‐タガトースと同一の１３．７分が得られた。この培養菌体によるＤ‐プシコースの転化反応により１．５ｇ／リットルのＤ‐タガトースが得られた。
【００１８】
以上の結果から明らかなように、Ｄ‐プシコースからの転換生成物を異なるカラムを使用した高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果は、標準物質としての試薬Ｄ‐タガトースの値とよく一致し、得られた製品は、Ｄ‐タガトースであることが確認された。
【００１９】
【発明の効果】
本発明方法によると、Ｄ‐プシコースを原料として、効率よく高純度のＤ‐タガトースを簡単に得ることができる。

Claims (1)

1. リゾプス・オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、リゾプス・アセトイヌス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ａｃｅｔｏｉｎｕｓ）又はリゾプス・オリゴスポラス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓ）を、Ｄ‐プシコースの存在下において培養したのち、培養液中よりＤ‐タガトースを取得することを特徴とするＤ‐タガトースの製造方法。