JPH10248588A - 発酵法によるｌ−セリンの製造法 - Google Patents
発酵法によるｌ−セリンの製造法Info
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- JPH10248588A JPH10248588A JP9060658A JP6065897A JPH10248588A JP H10248588 A JPH10248588 A JP H10248588A JP 9060658 A JP9060658 A JP 9060658A JP 6065897 A JP6065897 A JP 6065897A JP H10248588 A JPH10248588 A JP H10248588A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】医薬品・化学品・化粧品分野で使用されるアミ
ノ酸混合物を製造するために用いられているＬ−セリン
を糖より直接発酵でき培養液中に高収率でＬ−セリンを
蓄積させ、工業的に実施するのに有利なＬ−セリンの製
造方法を提供する。 【解決手段】Ｌ−セリン分解能が欠失し、かつアザセリ
ン耐性またはβ−（２−チエニル）−ＤＬ−アラニン耐
性のコリネ型細菌を採取することによりＬ−セリン生産
菌を得る。また該新規Ｌ−セリン生産菌株を培養し、培
地中に生成蓄積せしめたＬ−セリンを採取する発酵法に
よるＬ−セリンの製造法。
ノ酸混合物を製造するために用いられているＬ−セリン
を糖より直接発酵でき培養液中に高収率でＬ−セリンを
蓄積させ、工業的に実施するのに有利なＬ−セリンの製
造方法を提供する。 【解決手段】Ｌ−セリン分解能が欠失し、かつアザセリ
ン耐性またはβ−（２−チエニル）−ＤＬ−アラニン耐
性のコリネ型細菌を採取することによりＬ−セリン生産
菌を得る。また該新規Ｌ−セリン生産菌株を培養し、培
地中に生成蓄積せしめたＬ−セリンを採取する発酵法に
よるＬ−セリンの製造法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は医薬品・化学品・化
粧品分野で使用されるアミノ酸混合物を製造するために
用いられている、Ｌ−セリンの製造法に関するものであ
る。
粧品分野で使用されるアミノ酸混合物を製造するために
用いられている、Ｌ−セリンの製造法に関するものであ
る。
【０００２】
【従来の技術】従来発酵法によるＬ−セリン製造法とし
ては、グリシン及び糖からＬ−セリンに変換できる菌株
を使用して、３０ｇ／ｌのグリシンを有する培地で最高
１４ｇ／ｌのＬ−セリンを製造することができる。変換
収率は４６％に相当する(Kubota K. Agricultural Biol
ogical Chemistry, 49, 7〜12, 1985)。 また、グリシ
ンとメタノールからＬ−セリンを変換できる菌株を使用
して、１００ｇ／ｌのグリシンから５３ｇ／ｌのＬ−セ
リンが生産できる(T. Yashida et. al. Journalof Ferm
entation and Bioengineering, Vol. 79, No.2, 181-18
3.1995)。また、ノカルディアを使用する方法では、セ
リンハイドロキサメイトやアザセリン等の耐性菌を育種
することによりＬ−セリン生産能が改善されることが知
られている（特許公告公報５７−１２３５）。しかし、
これらの方法はＬ−セリンの前駆体であるグリシンを使
用しなければならず、操作が煩雑でコスト的にも不利で
あった。
ては、グリシン及び糖からＬ−セリンに変換できる菌株
を使用して、３０ｇ／ｌのグリシンを有する培地で最高
１４ｇ／ｌのＬ−セリンを製造することができる。変換
収率は４６％に相当する(Kubota K. Agricultural Biol
ogical Chemistry, 49, 7〜12, 1985)。 また、グリシ
ンとメタノールからＬ−セリンを変換できる菌株を使用
して、１００ｇ／ｌのグリシンから５３ｇ／ｌのＬ−セ
リンが生産できる(T. Yashida et. al. Journalof Ferm
entation and Bioengineering, Vol. 79, No.2, 181-18
3.1995)。また、ノカルディアを使用する方法では、セ
リンハイドロキサメイトやアザセリン等の耐性菌を育種
することによりＬ−セリン生産能が改善されることが知
られている（特許公告公報５７−１２３５）。しかし、
これらの方法はＬ−セリンの前駆体であるグリシンを使
用しなければならず、操作が煩雑でコスト的にも不利で
あった。
【０００３】Ｌ−セリンを糖より直接発酵でき、かつ培
地にＬ−セリンの前駆体を添加する必要のない菌株とし
て、Ｄ−セリン、α−メチル−セリン、ｏ−メチルセリ
ン、イソセリン、セリンハイドロキサメイト、３−クロ
ロアラニンに耐性なコリネバクテリウム グルタミカム
が知られているが、そのＬ−セリン蓄積は０．８ｇ／ｌ
ときわめて低いものであり（農芸化学会誌、第４８巻、
第３号、ｐ２０１−２０８、１９７４）、工業的にＬ−
セリンの直接発酵を行うには更なる菌株の改良が望まれ
ている。
地にＬ−セリンの前駆体を添加する必要のない菌株とし
て、Ｄ−セリン、α−メチル−セリン、ｏ−メチルセリ
ン、イソセリン、セリンハイドロキサメイト、３−クロ
ロアラニンに耐性なコリネバクテリウム グルタミカム
が知られているが、そのＬ−セリン蓄積は０．８ｇ／ｌ
ときわめて低いものであり（農芸化学会誌、第４８巻、
第３号、ｐ２０１−２０８、１９７４）、工業的にＬ−
セリンの直接発酵を行うには更なる菌株の改良が望まれ
ている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、培養液中に
糖からＬ−セリンを直接高蓄積させ、工業的に実施する
のに有利なＬ−セリンの製造方法を提供するものであ
る。
糖からＬ−セリンを直接高蓄積させ、工業的に実施する
のに有利なＬ−セリンの製造方法を提供するものであ
る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上述の課
題を解決すべくＬ−セリンの製造法について鋭意研究を
重ねた結果、コリネ型細菌に属し、Ｌ−セリン生成能を
有する菌株（特にＬ−セリン分解能が欠失した菌株が望
ましい）を親株としアザセリンまたはβ−（２−チエニ
ル）−ＤＬ−アラニンに耐性を示す変異株を採取し発酵
を行えば、培養液中のＬ−セリン蓄積が飛躍的に向上す
ることを見いだし、この知見に基づいて本発明を完成す
るに至った。
題を解決すべくＬ−セリンの製造法について鋭意研究を
重ねた結果、コリネ型細菌に属し、Ｌ−セリン生成能を
有する菌株（特にＬ−セリン分解能が欠失した菌株が望
ましい）を親株としアザセリンまたはβ−（２−チエニ
ル）−ＤＬ−アラニンに耐性を示す変異株を採取し発酵
を行えば、培養液中のＬ−セリン蓄積が飛躍的に向上す
ることを見いだし、この知見に基づいて本発明を完成す
るに至った。
【０００６】すなわち本発明は、アザセリンまたはβ−
（２−チエニル）−ＤＬ−アラニンに耐性を有するコリ
ネ型細菌のＬ−セリン生産菌、もしくは新規Ｌ−セリン
生産菌株ブレビバクテリウム フラバム ＡＪ１３３２
４（ＦＥＲＭ Ｐ−１６１２８）もしくはブレビバクテ
リウム フラバム ＡＪ１３３２５（ＦＥＲＭ Ｐ−１
６１２９）を培養し、培地中にＬ-セリンを生成蓄積せ
しめ、これを採取することを特徴とする発酵法によるＬ
−セリンの製造法である。
（２−チエニル）−ＤＬ−アラニンに耐性を有するコリ
ネ型細菌のＬ−セリン生産菌、もしくは新規Ｌ−セリン
生産菌株ブレビバクテリウム フラバム ＡＪ１３３２
４（ＦＥＲＭ Ｐ−１６１２８）もしくはブレビバクテ
リウム フラバム ＡＪ１３３２５（ＦＥＲＭ Ｐ−１
６１２９）を培養し、培地中にＬ-セリンを生成蓄積せ
しめ、これを採取することを特徴とする発酵法によるＬ
−セリンの製造法である。
【０００７】
【０００８】本発明において用いられる微生物は、コリ
ネ型細菌を親株として人工的に変異、誘導された、Ｌ−
セリン生産能を有し、Ｌ−セリン分解能が欠失し、アザ
セリンまたはβ−（２−チエニル）−ＤＬ−アラニン耐
性を有する菌株であれば何れでも使用することができ
る。尚、本発明においてコリネ型細菌とは、バージーズ
・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオ
ロジー(Bergey's Manualof Determinative Bacteriolog
y) 第８版599頁（1974)に定義されている一群の微生物
であり、好気性、グラム陽性、非抗酸性、胞子形成能を
有しない桿菌であり、コリネバクテリウム属細菌、およ
び従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コ
リネバクテリウム属細菌として統合されたブレビバクテ
リウム属細菌、さらにコリネバクテリウム属細菌と非常
に近縁なブレビバクテリウム属およびミクロバクテリウ
ム属細菌を含む。
ネ型細菌を親株として人工的に変異、誘導された、Ｌ−
セリン生産能を有し、Ｌ−セリン分解能が欠失し、アザ
セリンまたはβ−（２−チエニル）−ＤＬ−アラニン耐
性を有する菌株であれば何れでも使用することができ
る。尚、本発明においてコリネ型細菌とは、バージーズ
・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオ
ロジー(Bergey's Manualof Determinative Bacteriolog
y) 第８版599頁（1974)に定義されている一群の微生物
であり、好気性、グラム陽性、非抗酸性、胞子形成能を
有しない桿菌であり、コリネバクテリウム属細菌、およ
び従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コ
リネバクテリウム属細菌として統合されたブレビバクテ
リウム属細菌、さらにコリネバクテリウム属細菌と非常
に近縁なブレビバクテリウム属およびミクロバクテリウ
ム属細菌を含む。
【０００９】当該微生物の採取は、例えば次のようにし
て行うことができる。すなわち親株としてブレビバクテ
リウム フラバム ＡＴＣＣ１４０６７を通常の方法で
変異処理（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグ
アニジン等）に付して、Ｌ−セリン分解能を欠失した変
異株を得、さらにこの変異株を親株としてアザセリンま
たはβ−（２−チエニル）−ＤＬ−アラニン耐性菌を採
取する。このような方法により得られた変異株の中にＬ
−セリンを高濃度で蓄積する菌株が得られる。
て行うことができる。すなわち親株としてブレビバクテ
リウム フラバム ＡＴＣＣ１４０６７を通常の方法で
変異処理（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグ
アニジン等）に付して、Ｌ−セリン分解能を欠失した変
異株を得、さらにこの変異株を親株としてアザセリンま
たはβ−（２−チエニル）−ＤＬ−アラニン耐性菌を採
取する。このような方法により得られた変異株の中にＬ
−セリンを高濃度で蓄積する菌株が得られる。
【００１０】本発明の菌株を用いてＬ−セリンを生産す
るには次のような方法が用いられる。使用する培地とし
ては、炭素源、窒素源、無機塩類、及び必要に応じてア
ミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を適宜含有する通
常の液体培地が使用される。炭素源としては、グルコー
ス、シュークロース、フラクトース、ガラクトース等の
糖類、これら糖類を含有する澱粉糖化液、甘藷糖蜜、甜
菜糖蜜、ハイテストモラセス、更には酢酸等の有機酸、
エタノール等のアルコール類、グリセリン等も使用され
る。窒素源としてはアンモニアガス、アンモニア水、ア
ンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用
される有機窒素源、例えば油粕類、大豆加水分解液、カ
ゼイン分解物、その他のアミノ酸、コーンスティープリ
カー、酵母または酵母エキス、ペプトン等のペプチド類
等が使用される。無機イオンとしてはリン酸イオン、マ
グネシウムイオン、カルシウムイオン、鉄イオン、マン
ガンイオン等が適宜添加される。また本発明の微生物に
アミノ酸等の要求性物質がある場合には、その要求物質
を添加しなければならない。
るには次のような方法が用いられる。使用する培地とし
ては、炭素源、窒素源、無機塩類、及び必要に応じてア
ミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を適宜含有する通
常の液体培地が使用される。炭素源としては、グルコー
ス、シュークロース、フラクトース、ガラクトース等の
糖類、これら糖類を含有する澱粉糖化液、甘藷糖蜜、甜
菜糖蜜、ハイテストモラセス、更には酢酸等の有機酸、
エタノール等のアルコール類、グリセリン等も使用され
る。窒素源としてはアンモニアガス、アンモニア水、ア
ンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用
される有機窒素源、例えば油粕類、大豆加水分解液、カ
ゼイン分解物、その他のアミノ酸、コーンスティープリ
カー、酵母または酵母エキス、ペプトン等のペプチド類
等が使用される。無機イオンとしてはリン酸イオン、マ
グネシウムイオン、カルシウムイオン、鉄イオン、マン
ガンイオン等が適宜添加される。また本発明の微生物に
アミノ酸等の要求性物質がある場合には、その要求物質
を添加しなければならない。
【００１１】微生物の培養は通常ｐＨ５〜８、温度２５
〜４０℃の範囲で好気的条件下で行われる。培養液のｐ
Ｈは、無機あるいは有機の酸、アルカリ性物質、更には
尿素、炭酸カルシウム、アンモニアガスなどによって上
記範囲内の予め定められた値に調節する。
〜４０℃の範囲で好気的条件下で行われる。培養液のｐ
Ｈは、無機あるいは有機の酸、アルカリ性物質、更には
尿素、炭酸カルシウム、アンモニアガスなどによって上
記範囲内の予め定められた値に調節する。
【００１２】発酵液からＬ−セリンを採取するには、例
えば菌体を分離除去し、イオン交換樹脂処理あるいは濃
縮冷却晶析法、膜分離法、その他公知の方法を組み合わ
せることにより行なわれる。不純物を除くためには常法
の活性炭吸着法及び再結法を用いて精製してもよい。
えば菌体を分離除去し、イオン交換樹脂処理あるいは濃
縮冷却晶析法、膜分離法、その他公知の方法を組み合わ
せることにより行なわれる。不純物を除くためには常法
の活性炭吸着法及び再結法を用いて精製してもよい。
【００１３】
【実施例１】
【００１４】新規Ｌ−セリン生産菌ブレビバクテリウム
フラバム ＡＪ１３３２４の構築
フラバム ＡＪ１３３２４の構築
【００１５】ブレビバクテリウム フラバム ＡＪ１３
３２４は野生型株ブレビバクテリウム フラバム ＡＴ
ＣＣ １４０６７から得られたＬ−セリンの分解能が欠
失したブレビバクテリウム フラバム ＴＯＥ１から構
築された。
３２４は野生型株ブレビバクテリウム フラバム ＡＴ
ＣＣ １４０６７から得られたＬ−セリンの分解能が欠
失したブレビバクテリウム フラバム ＴＯＥ１から構
築された。
【００１６】変異株を得るためには、ブイヨン培地（魚
肉エキス１ｇ、ポリペプトン１ｇ、酵母エキス０．５
ｇ、食塩０．５ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．０に調整した
培地）で一昼夜増殖させた菌体を、１００ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し（１ｍｌ当り１０9−１０
10個の菌体を含む）、これに２００μｇ／ｍｌ濃度とな
るようにＮＧ（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロ
ソグアニジン）を加えて３０℃で３０分間保持した。こ
のようにしてＮＧ処理した菌体を同緩衝液で充分洗浄し
た。
肉エキス１ｇ、ポリペプトン１ｇ、酵母エキス０．５
ｇ、食塩０．５ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．０に調整した
培地）で一昼夜増殖させた菌体を、１００ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し（１ｍｌ当り１０9−１０
10個の菌体を含む）、これに２００μｇ／ｍｌ濃度とな
るようにＮＧ（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロ
ソグアニジン）を加えて３０℃で３０分間保持した。こ
のようにしてＮＧ処理した菌体を同緩衝液で充分洗浄し
た。
【００１７】ＮＧ処理した菌体からＬ−セリン分解能の
ない菌株を選択するためには、洗浄したブレビバクテリ
ウム フラバム ＡＴＣＣ １４０６７のＮＧ菌体をブ
イヨン寒天培地に塗布し、３０℃、２４時間培養してコ
ロニーを形成させた。次にブイヨン寒天培地のコロニー
を原版にして、最小培地と選択用最小培地にレプリカを
行い、最小培地で生育し選択用最小培地で生育しない菌
株を探した。。最小培地は純水１Ｌ当たりグルコース２
０ｇ、硫酸アンモニウム１ｇ、リン酸２水素カリウム１
ｇ、尿素２．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物０．４
ｇ、硫酸鉄（ＩＩ）・７水和物０．０１ｇ、硫酸マンガ
ン・４〜５水和物０．０１ｇ、ビオチン５０μｇ、塩酸
チアミン２００μｇ、ニコチン酸アミド２００μｇ、寒
天２．０ｇを含有する培地で、選択用最小培地は、純粋
１Ｌ当たり硫酸アンモニウム１ｇ、リン酸２水素カリウ
ム１ｇ、尿素２．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物
０．４ｇ、硫酸鉄（ＩＩ）・７水和物０．０１ｇ、硫酸
マンガン・４〜５水和物０．０１ｇ、ビオチン５０μ
ｇ、塩酸チアミン２００μｇ、ニコチン酸アミド２００
μｇ、Ｌ−セリン０．５ｇ、寒天２．０ｇを含有する培
地であった。このような方法で得られた変異株の中に
は、Ｌ−セリンの分解能がない菌株が多く見いだされ、
その１株としてブレビバクテリウム フラバム ＴＯＥ
１を取得した。
ない菌株を選択するためには、洗浄したブレビバクテリ
ウム フラバム ＡＴＣＣ １４０６７のＮＧ菌体をブ
イヨン寒天培地に塗布し、３０℃、２４時間培養してコ
ロニーを形成させた。次にブイヨン寒天培地のコロニー
を原版にして、最小培地と選択用最小培地にレプリカを
行い、最小培地で生育し選択用最小培地で生育しない菌
株を探した。。最小培地は純水１Ｌ当たりグルコース２
０ｇ、硫酸アンモニウム１ｇ、リン酸２水素カリウム１
ｇ、尿素２．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物０．４
ｇ、硫酸鉄（ＩＩ）・７水和物０．０１ｇ、硫酸マンガ
ン・４〜５水和物０．０１ｇ、ビオチン５０μｇ、塩酸
チアミン２００μｇ、ニコチン酸アミド２００μｇ、寒
天２．０ｇを含有する培地で、選択用最小培地は、純粋
１Ｌ当たり硫酸アンモニウム１ｇ、リン酸２水素カリウ
ム１ｇ、尿素２．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物
０．４ｇ、硫酸鉄（ＩＩ）・７水和物０．０１ｇ、硫酸
マンガン・４〜５水和物０．０１ｇ、ビオチン５０μ
ｇ、塩酸チアミン２００μｇ、ニコチン酸アミド２００
μｇ、Ｌ−セリン０．５ｇ、寒天２．０ｇを含有する培
地であった。このような方法で得られた変異株の中に
は、Ｌ−セリンの分解能がない菌株が多く見いだされ、
その１株としてブレビバクテリウム フラバム ＴＯＥ
１を取得した。
【００１８】ブレビバクテリウム フラバム ＴＯＥ１
を親株にして、ＮＧ処理した菌株からアザセリン耐性株
を選択するためには、洗浄したブレビバクテリウム フ
ラバム ＴＯＥ１のＮＧ処理菌体を選択用最小培地に接
種した。選択用最小培地は純水１Ｌ当たりグルコース２
０ｇ、硫酸アンモニウム１ｇ、リン酸２水素カリウム１
ｇ、尿素２．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物０．４
ｇ、硫酸鉄（ＩＩ）・７水和物０．０１ｇ、硫酸マンガ
ン・４〜５水和物０．０１ｇ、ビオチン５０μｇ、塩酸
チアミン２００μｇ、ニコチン酸アミド２００μｇ、ア
ザセリン２００μｇを含有する培地で、ＮＧ処理変異株
は３０℃で５〜１０日間培養された。このようにして得
られた菌液をブイヨン寒天培地に塗布し、３０℃、２４
時間培養しコロニーを形成させた。このような方法でア
ザセリンに耐性な菌株を取得した。得られた変異株の中
には、高収率で著量のＬ−セリンを蓄積する菌株が多く
見いだされ、その１株としてブレビバクテリウム フラ
バム ＡＪ１３３２４を取得した。本菌株は２００μｇ
／Ｌのアザセリン存在下で生育可能であることを確認し
た。また本菌株は工業技術院生命工学工業技術研究所に
寄託番号ＦＥＲＭＰ−１６１２８として寄託されてい
る。
を親株にして、ＮＧ処理した菌株からアザセリン耐性株
を選択するためには、洗浄したブレビバクテリウム フ
ラバム ＴＯＥ１のＮＧ処理菌体を選択用最小培地に接
種した。選択用最小培地は純水１Ｌ当たりグルコース２
０ｇ、硫酸アンモニウム１ｇ、リン酸２水素カリウム１
ｇ、尿素２．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物０．４
ｇ、硫酸鉄（ＩＩ）・７水和物０．０１ｇ、硫酸マンガ
ン・４〜５水和物０．０１ｇ、ビオチン５０μｇ、塩酸
チアミン２００μｇ、ニコチン酸アミド２００μｇ、ア
ザセリン２００μｇを含有する培地で、ＮＧ処理変異株
は３０℃で５〜１０日間培養された。このようにして得
られた菌液をブイヨン寒天培地に塗布し、３０℃、２４
時間培養しコロニーを形成させた。このような方法でア
ザセリンに耐性な菌株を取得した。得られた変異株の中
には、高収率で著量のＬ−セリンを蓄積する菌株が多く
見いだされ、その１株としてブレビバクテリウム フラ
バム ＡＪ１３３２４を取得した。本菌株は２００μｇ
／Ｌのアザセリン存在下で生育可能であることを確認し
た。また本菌株は工業技術院生命工学工業技術研究所に
寄託番号ＦＥＲＭＰ−１６１２８として寄託されてい
る。
【００１９】
【実施例２】
【００２０】新規Ｌ−セリン生産菌ブレビバクテリウム
フラバム ＡＪ１３３２５の構築
フラバム ＡＪ１３３２５の構築
【００２１】ブレビバクテリウム フラバム ＡＪ１３
３２５は野生型株ブレビバクテリウム フラバム ＡＴ
ＣＣ １４０６７から得られたＬ−セリンの分解能が欠
失したブレビバクテリウム フラバム ＴＯＥ１から構
築された。
３２５は野生型株ブレビバクテリウム フラバム ＡＴ
ＣＣ １４０６７から得られたＬ−セリンの分解能が欠
失したブレビバクテリウム フラバム ＴＯＥ１から構
築された。
【００２２】ブレビバクテリウム フラバム ＴＯＥ１
を親株にして、ＮＧ処理した菌株からβ−（２−チエニ
ル）−ＤＬ−アラニン耐性株を選択するためには、洗浄
したブレビバクテリウム フラバム ＴＯＥ１のＮＧ処
理菌体を選択用最小培地に接種した。選択用最小培地は
純水１Ｌ当たりグルコース２０ｇ、硫酸アンモニウム１
ｇ、リン酸２水素カリウム１ｇ、尿素２．５ｇ、硫酸マ
グネシウム・７水和物０．４ｇ、硫酸鉄（ＩＩ）・７水
和物０．０１ｇ、硫酸マンガン・４〜５水和物０．０１
ｇ、ビオチン５０μｇ、塩酸チアミン２００μｇ、ニコ
チン酸アミド２００μｇ、β−（２−チエニル）−ＤＬ
−アラニン２００μｇを含有する培地で、ＮＧ処理変異
株は３０℃で５〜１０日間培養された。このようにして
得られた菌液をブイヨン寒天培地に塗布し、３０℃、２
４時間培養しコロニーを形成させた。このような方法で
β−（２−チエニル）−ＤＬ−アラニンに耐性な菌株を
取得した。得られた変異株の中には、高収率で著量のＬ
−セリンを蓄積する菌株が多く見いだされ、その１株と
してブレビバクテリウム フラバム ＡＪ１３３２５を
取得した。本菌株は２００μｇ／Ｌのβ−（２−チエニ
ル）−ＤＬ−アラニン存在下で生育可能であることを確
認した。また本菌株は工業技術院生命工学工業技術研究
所にＦＥＲＭ Ｐ−１６１２９として寄託されている。
を親株にして、ＮＧ処理した菌株からβ−（２−チエニ
ル）−ＤＬ−アラニン耐性株を選択するためには、洗浄
したブレビバクテリウム フラバム ＴＯＥ１のＮＧ処
理菌体を選択用最小培地に接種した。選択用最小培地は
純水１Ｌ当たりグルコース２０ｇ、硫酸アンモニウム１
ｇ、リン酸２水素カリウム１ｇ、尿素２．５ｇ、硫酸マ
グネシウム・７水和物０．４ｇ、硫酸鉄（ＩＩ）・７水
和物０．０１ｇ、硫酸マンガン・４〜５水和物０．０１
ｇ、ビオチン５０μｇ、塩酸チアミン２００μｇ、ニコ
チン酸アミド２００μｇ、β−（２−チエニル）−ＤＬ
−アラニン２００μｇを含有する培地で、ＮＧ処理変異
株は３０℃で５〜１０日間培養された。このようにして
得られた菌液をブイヨン寒天培地に塗布し、３０℃、２
４時間培養しコロニーを形成させた。このような方法で
β−（２−チエニル）−ＤＬ−アラニンに耐性な菌株を
取得した。得られた変異株の中には、高収率で著量のＬ
−セリンを蓄積する菌株が多く見いだされ、その１株と
してブレビバクテリウム フラバム ＡＪ１３３２５を
取得した。本菌株は２００μｇ／Ｌのβ−（２−チエニ
ル）−ＤＬ−アラニン存在下で生育可能であることを確
認した。また本菌株は工業技術院生命工学工業技術研究
所にＦＥＲＭ Ｐ−１６１２９として寄託されている。
【００２３】
【実施例３】
【００２４】新規Ｌ−セリン生産菌ブレビバクテリウム
フラバム ＡＪ１３３２４及びＡＪ１３３２５による
Ｌ−セリンの生産
フラバム ＡＪ１３３２４及びＡＪ１３３２５による
Ｌ−セリンの生産
【００２５】ブレビバクテリウム フラバム ＡＪ１３
３２４及びＡＪ１３３２５をブイヨン寒天培地で３０
℃、２４時間培養し、次いで表１の組成の接種用培地５
０ｍｌを含有する５００ｍｌ振とうフラスコの中に白金
耳で接種した。対照として親株であるブレビバクテリウ
ム フラブム ＡＴＣＣ１４０６７およびＴＯＥ１を同
様に接種した。接種用培地は水酸化ナトリウムでｐＨ
５．５に調整し、１１５℃、１５分間オートクレーブ殺
菌した後使用した。
３２４及びＡＪ１３３２５をブイヨン寒天培地で３０
℃、２４時間培養し、次いで表１の組成の接種用培地５
０ｍｌを含有する５００ｍｌ振とうフラスコの中に白金
耳で接種した。対照として親株であるブレビバクテリウ
ム フラブム ＡＴＣＣ１４０６７およびＴＯＥ１を同
様に接種した。接種用培地は水酸化ナトリウムでｐＨ
５．５に調整し、１１５℃、１５分間オートクレーブ殺
菌した後使用した。
【００２６】
【表１】
【００２７】フラスコに菌体を接種後、３０℃で１８時
間振とう培養し、この培養液１．０ｍｌを表２の組成の
発酵培地２０ｍｌを含有する５００ｍｌ振とうフラスコ
中に移した。培地は水酸化カリウムでｐＨ７．０に調整
後１１５℃、１５分間オートクレーブ殺菌した。殺菌冷
却後、１８０℃、３時間乾熱殺菌した炭酸カルシウム５
ｇ／ｌ添加した。
間振とう培養し、この培養液１．０ｍｌを表２の組成の
発酵培地２０ｍｌを含有する５００ｍｌ振とうフラスコ
中に移した。培地は水酸化カリウムでｐＨ７．０に調整
後１１５℃、１５分間オートクレーブ殺菌した。殺菌冷
却後、１８０℃、３時間乾熱殺菌した炭酸カルシウム５
ｇ／ｌ添加した。
【００２８】
【表２】
【００２９】生産物であるＬ−セリンの測定は、高速液
体クロマトグラフィー（日立Ｌ−８５００アミノ酸分析
装置）によって行われた。その結果、ブレビバクテリウ
ムフラバム ＡＪ１３３２４及びＡＪ１３３２５はＬ−
セリンをそれぞれ１５、２ｇ／Ｌ、１４、３ｇ／Ｌ培地
中に蓄積した。一方、対照として培養したブレビバクテ
リウム フラブム ＡＴＣＣ１４０６７およびＴＯＥ１
のＬ−セリン蓄積量はそれぞれ０ｇ／ｌ、０、５ｇ／ｌ
であった。
体クロマトグラフィー（日立Ｌ−８５００アミノ酸分析
装置）によって行われた。その結果、ブレビバクテリウ
ムフラバム ＡＪ１３３２４及びＡＪ１３３２５はＬ−
セリンをそれぞれ１５、２ｇ／Ｌ、１４、３ｇ／Ｌ培地
中に蓄積した。一方、対照として培養したブレビバクテ
リウム フラブム ＡＴＣＣ１４０６７およびＴＯＥ１
のＬ−セリン蓄積量はそれぞれ０ｇ／ｌ、０、５ｇ／ｌ
であった。
【００３０】ブレビバクテリウム フラバム ＡＪ１３
３２４の培養液は遠心分離後、定法によりカチオン交換
樹脂による脱塩処理を行い、その後カチオン交換樹脂及
びアニオン交換樹脂によるクロマト分離を用いて副生物
を除き、晶析処理による精製を行い、９９％以上の純度
のＬ−セリン結晶をブロスからの収率５５％で得た。
３２４の培養液は遠心分離後、定法によりカチオン交換
樹脂による脱塩処理を行い、その後カチオン交換樹脂及
びアニオン交換樹脂によるクロマト分離を用いて副生物
を除き、晶析処理による精製を行い、９９％以上の純度
のＬ−セリン結晶をブロスからの収率５５％で得た。
【００３１】
【発明の効果】上記のようにＬ−セリン分解能を欠出
し、アザセリンまたはβ−（２−チエニル）−ＤＬ−ア
ラニンに耐性のコリネ型細菌を用いれば、直接糖から高
蓄積でＬ−セリンが製造可能となる。
し、アザセリンまたはβ−（２−チエニル）−ＤＬ−ア
ラニンに耐性のコリネ型細菌を用いれば、直接糖から高
蓄積でＬ−セリンが製造可能となる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 15/01 Ｃ１２Ｒ 1:13）
Claims (4)
- 【請求項１】アザセリンまたはβ−（２−チエニル）−
ＤＬ−アラニンに耐性を示し、かつＬ−セリン分解能を
欠失しＬ−セリンを生産するコリネ型細菌。 - 【請求項２】アザセリンに耐性を示し、かつＬ−セリン
分解能を欠失した新規Ｌ−セリン生産菌株ブレビバクテ
リウム フラバム ＡＪ１３３２４（ＦＥＲＭＰ−１６
１２８）。 - 【請求項３】β−（２−チエニル）−ＤＬ−アラニンに
耐性を示し、かつＬ−セリンの分解能を欠失した新規Ｌ
−セリン生産菌株ブレビバクテリウム フラバム ＡＪ
１３３２５（ＦＥＲＭ Ｐ−１６１２９）。 - 【請求項４】請求項１ないし請求項３記載のＬ−セリン
生産菌株を培養し、培地中に生成蓄積せしめたＬ−セリ
ンを採取することを特徴とする発酵法によるＬ−セリン
の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9060658A JPH10248588A (ja) | 1997-03-14 | 1997-03-14 | 発酵法によるｌ−セリンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9060658A JPH10248588A (ja) | 1997-03-14 | 1997-03-14 | 発酵法によるｌ−セリンの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10248588A true JPH10248588A (ja) | 1998-09-22 |
Family
ID=13148666
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9060658A Pending JPH10248588A (ja) | 1997-03-14 | 1997-03-14 | 発酵法によるｌ−セリンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10248588A (ja) |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001072701A (ja) * | 1999-06-29 | 2001-03-21 | Ajinomoto Co Inc | タピオカ澱粉の製造方法及びアミノ酸の発酵生産方法 |
| US6258573B1 (en) * | 1998-01-12 | 2001-07-10 | Ajinomoto Co., Inc. | Method of producing L-serine by fermentation |
| WO2002097086A1 (fr) * | 2001-05-29 | 2002-12-05 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Micro-organismes utiles a echelle industrielle |
| WO2003072783A1 (fr) * | 2002-02-28 | 2003-09-04 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Procede de fabrication d'acide n-acetylneuraminique |
| WO2009088049A1 (ja) | 2008-01-10 | 2009-07-16 | Ajinomoto Co., Inc. | 発酵法による目的物質の製造法 |
| WO2015005406A1 (ja) | 2013-07-09 | 2015-01-15 | 味の素株式会社 | 有用物質の製造方法 |
| WO2015050234A1 (ja) | 2013-10-02 | 2015-04-09 | 味の素株式会社 | アンモニア制御装置およびアンモニア制御方法 |
| WO2015060391A1 (ja) | 2013-10-23 | 2015-04-30 | 味の素株式会社 | 目的物質の製造法 |
| EP3385389A1 (en) | 2017-04-03 | 2018-10-10 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing l-amino acid from fructose |
| WO2020071538A1 (en) | 2018-10-05 | 2020-04-09 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing target substance by bacterial fermentation |
-
1997
- 1997-03-14 JP JP9060658A patent/JPH10248588A/ja active Pending
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6258573B1 (en) * | 1998-01-12 | 2001-07-10 | Ajinomoto Co., Inc. | Method of producing L-serine by fermentation |
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| US7329514B2 (en) | 2002-02-28 | 2008-02-12 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for producing n-acetylneuraminic acid |
| EP2749652A2 (en) | 2008-01-10 | 2014-07-02 | Ajinomoto Co., Inc. | A method for producing a target substance by fermentation |
| WO2009088049A1 (ja) | 2008-01-10 | 2009-07-16 | Ajinomoto Co., Inc. | 発酵法による目的物質の製造法 |
| WO2015005406A1 (ja) | 2013-07-09 | 2015-01-15 | 味の素株式会社 | 有用物質の製造方法 |
| EP3521433A1 (en) | 2013-07-09 | 2019-08-07 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for producing l-glutamic acid |
| WO2015050234A1 (ja) | 2013-10-02 | 2015-04-09 | 味の素株式会社 | アンモニア制御装置およびアンモニア制御方法 |
| WO2015060391A1 (ja) | 2013-10-23 | 2015-04-30 | 味の素株式会社 | 目的物質の製造法 |
| EP3385389A1 (en) | 2017-04-03 | 2018-10-10 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing l-amino acid from fructose |
| WO2020071538A1 (en) | 2018-10-05 | 2020-04-09 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing target substance by bacterial fermentation |
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