WO2004011660A1 - ユビキノン−１０含有溶液の製造方法 - Google Patents

ユビキノン−１０含有溶液の製造方法 Download PDF

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WO2004011660A1
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ubiquinone
culture
solution
concentration
temperature
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PCT/JP2003/009459
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Inventor
Hideki Murata
Hiroyuki Yonemitsu
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/66—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing the quinoid structure

Definitions

  • the present invention relates to a method for separating and purifying ubiquinone 10 from a culture containing ubiquinone 10, a processed product of the culture, or a crudely purified product of ubiquinone 10.
  • Ubiquinone-10 widely exists in animal and plant tissues and microbial cells, and plays an important role as an essential component of the terminal electron transport system. Its pharmacological action is effective for congestive heart failure and coronary insufficiency, muscular dystrophy due to malnutrition, etc., and is a valuable substance as a pharmaceutical.
  • a method for producing ubiquinone-10 a method is generally used in which a microorganism having a high content of ubiquinone-10 is extracted from a culture obtained by culturing the microorganism.
  • an extraction method using an organic solvent or the like is conventionally known (for example, Japanese Patent Application No. 11-178595). Further, as a method for purifying ubiquinone 10 from the extract, a method using silylation gel or activated alumina (Japanese Patent Application Laid-Open No. 63-91360, Japanese Patent Publication No. 160953, etc.) is known.
  • the extract obtained by the above extraction method contains a large amount of ubiquinone-10 analogs in addition to ubiquinone-10, and it is necessary to directly purify high-purity ubiquinone-10 from the extract by crystallization. It is difficult.
  • silica gel or activated alumina when the extract containing a large amount of ubiquinone 10 analog is used, ubiquinone 10 cannot be efficiently separated and purified.
  • silica gel and activated alumina are expensive, which leads to high costs in industrial-scale production.
  • An object of the present invention is to provide a method for inexpensively separating and purifying high-purity ubiquinone-10 from a culture containing ubiquinone-10, a processed product of the culture, or a crude product of ubiquinone-10. To provide.
  • the present invention relates to the following (1) to (6).
  • step [2] of the method according to claim 1 To the insoluble matter obtained in step [2] of the method according to claim 1, a methanol solution is added again to a concentration of 50 to 100 v / v%, and the temperature is 0 ° C or more and 30 ° C or less. 2. The method according to (1) above, wherein the step of separating and obtaining the insoluble matter after the step (a) is repeated at least once, and then the step [3] and subsequent steps according to claim 1 are performed.
  • microorganism capable of producing ubiquinone-1 10 is a microorganism selected from the group consisting of basidiomycetes, fungi, yeast, and bacteria.
  • the processed product of the culture is a concentrate of a culture of a microorganism, a dried product of the culture, a cell obtained by separating from the culture, a dried product of the cell, lyophilization of the cell.
  • a method for producing crystals of ubiquinone-110 comprising crystallizing crystals of ubiquinone-110 from the solution containing ubiquinone-110 obtained by the method of (1) or (2).
  • the microorganism having the ability to produce ubiquinone-10 used in the method of the present invention may be any microorganism as long as it has the ability.
  • it is known as a microorganism that produces ubiquinone-10.
  • Basidiomycetes, fungi, yeast, and bacteria can be mentioned.
  • basidiomycetes are of the genus Ustilago
  • fungi are of the genus Aspergillus, Exo asidiumfes Geotrichum, Moimscus, Paecilomyces, SporotrichumB Genus Aureobasidium, Brettanomyces, Bullera, Candida, Cryptococcus, Leucosporidium, Oosporidium, Rhodotorula ula Rhodospor genus, Schizosaccharomyces obo Sporobolomyces, Torulopsis ⁇ Trem And Sporidiobolus
  • bacteria include Acetobacter, Agrobacteriu, Corynebacterium, Erythrobacter, Flavobacterium, Methylobacter, Microcyclus, Paracoccus, Phyllobacteriu,
  • Microorganisms belonging to the genus Protaminobacter s Pseudomonas, the genus Rhizobium, the genus Rhodobacter and the genus Xantomonas can be mentioned.
  • Microorganisms belonging to the genus Escherichia in which ubiquinone synthase has been enriched by techniques such as genetic recombination, and microorganisms having the ability to produce the above-mentioned ubiquinone-10 in which the enzyme has been enriched are also included in the method of the present invention. Can be used.
  • a natural medium or a synthetic medium may be used as long as the medium contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like which can be used by the microorganism and can efficiently culture the microorganism. Either may be used.
  • the carbon source may be any one which can be assimilated by the microorganism, such as glucose, fructose, sucrose, molasses containing them, carbohydrates such as starch or starch hydrolysate, and organic acids such as acetic acid and propionic acid. And alcohols such as ethanol, propanol and the like.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate, and other ammonium or inorganic salts of organic acids, other nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, yeast extract, corn Chip liquor, casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermentation cells and their digestions, and the like can be used.
  • potassium (II) phosphate potassium (II) phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, carbonated calcium sulfate, and the like can be used.
  • the culture is performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the culturing temperature is preferably 15 to 40 ° C, and the culturing time is usually 16 hours to 14 days.
  • the pH during the culturing is preferably maintained at 3.0 to 9.0. Adjust pH with inorganic or organic acids, alkaline solutions, urine This is done using element, calcium carbonate, ammonia, etc.
  • the culture that has been cultured can be directly used in the purification method of the present invention, and the processed product of the culture can also be used in the purification method of the present invention.
  • the processed product of the culture includes a concentrate of the culture, a dried product of the culture, cells obtained by separating from the culture, a dried product of the cells, a lyophilized product of the cells, Washed cells obtained by washing the cells, dried cells of the washed cells or freeze-dried products of the washed cells can be mentioned.
  • the washed cells are washed cells washed with a solvent that does not substantially dissolve ubiquinone 10 and, for example, 1 to 10 times, preferably 2 to 7 times, more preferably 3 to 10 times using the solvent. Up to five times, the cells obtained by washing can be given.
  • Water is suitably used as the solvent used for the above washing.
  • substantially not dissolving ubiquinone-10 means that ubiquinone-10 may have sufficient solubility in an industrial purification method for ubiquinone-10. Specifically, it means that the solubility of ubiquinone-10 is 0.05% or less, more preferably 0.02% or less, further preferably 0.01% or less.
  • Microbial cells can be obtained by separating the culture, such as filtration, centrifugation, or membrane separation, preferably by centrifugation. Filtration can be performed with a nutsche, filter press, basket separator or the like.
  • the culture and the processed product of the culture can be stored frozen and thawed when necessary.
  • ubiquinone-10 can be purified from the above-mentioned culture and a processed product of the culture, and also ubiquinone-10 can be purified from a crudely purified product of ubiquinone-10.
  • Examples of the crudely purified product of ubiquinone-10 include a solution containing ubiquinone-10, which is rich in analogs of ubiquinone-10, a dried product, a lyophilized product, and a crystallized product.
  • the method may be any method, for example, extracting ubiquinone-10 from a culture obtained by culturing a microorganism capable of producing ubiquinone-10 using an organic solvent or the like according to a conventional method.
  • a solution containing ubiquinone-10 analog containing a large amount of ubiquinone-10 analog is, for example, a solution containing ubiquinone-10 analog containing 5 parts by weight or more for 95 parts by weight of ubiquinone-1 °. Etc. can be given.
  • ubiquinone-10 analog examples include ubiquinone-10 structural analogs such as 3-demethoxyubiquinone-10 and carotenoids such as spheroidene.
  • the methanol solution used in the method of the present invention includes methanol and an aqueous solution of methanol. Further, a methanol solution obtained by adding another organic solvent or the like to methanol may also be mentioned as the methanol solution used in the method of the present invention, as long as the object of the present invention can be achieved. it can.
  • a methanol solution was added to the culture of the microorganism obtained by the above method, a processed product of the culture, or a crudely purified product of ubiquinone 10 to a concentration of 50 to 10 Ov / v%.
  • concentration and temperature of the above-mentioned medium solution may be any concentration and temperature as long as the combination of the concentration and temperature does not substantially dissolve ubiquinone 10 at the above-mentioned concentration and temperature. May be combined.
  • the concentration is 50 to 100 v / v% and the temperature is 0 to 30.
  • C more preferably at a concentration of 70 to 100; at 100 v / v%, the temperature is 10 to 20 ° C, and more preferably, at a concentration of 80 to 100 v / v%, the temperature is 20 °. Combinations of C can be given.
  • a method of maintaining a solution containing a culture or the like at the above concentration and temperature for example, a method of stirring with a stirrer for 30 minutes to 10 hours, preferably 1 to 5 hours, more preferably 1 to 2 hours, may be mentioned.
  • a method of stirring with a stirrer for 30 minutes to 10 hours, preferably 1 to 5 hours, more preferably 1 to 2 hours may be mentioned.
  • ubiquinone-10 analogs other than ubiquinone-10 contained in the culture or the like can be extracted into a methanol solution, and an insoluble substance containing ubiquinone-10 can be obtained.
  • the insoluble matter containing ubiquinone-10 obtained in the above step can be separated from the solution by a separation operation such as filtration, centrifugation, membrane separation and the like. Filtration can be performed with Nutsche, filter press, basket separator, and the like. A methanol solution is added again to the insoluble matter obtained by the above series of steps to a concentration of 50 to 100 v / v%, and the above series of steps is repeated one or more times, for example, several times. The concentration of insolubles containing ubiquinone 10 at a given concentration may be obtained.
  • a methanol solution having a concentration of 85 to 100 v / v% is added to the insoluble matter containing ubiquinone 10 obtained in the above step, and the temperature is maintained at a temperature higher than 30 ° C and 80 ° C or lower.
  • a methanol solution containing ubiquinone-10 can be obtained.
  • the concentration and temperature of the methanol solution to be added to the insoluble matter are determined by dissolving ubiquinone-10 contained in the insoluble matter separated and obtained in the above step at the concentration and temperature of the methanol solution used; Any combination of concentration and temperature may be used as long as the concentration and temperature do not substantially dissolve contaminants other than ubiquinone-10.
  • the concentration of the methanol solution is 85 to 100 v / v% and the concentration is higher than 30 ° C and lower than 80 ° C, more preferably the concentration is 90 to 100 v / v%. % To a temperature of 50 to 70 ° C, and more preferably, a combination of a concentration of 95 to 100 v / v% and a temperature of 60 to 70 ° C.
  • a method of maintaining the methanol solution at the above concentration and temperature for example, a method of stirring with a stirrer for 30 minutes to 10 hours, preferably 1 to 5 hours, more preferably 1 to 2 hours can be mentioned. .
  • a methanol solution containing ubiquinone-10 can be obtained.
  • a solution containing ubiquinone-10 By removing insolubles from the methanol solution containing ubiquinone-10 obtained in the above step, a solution containing ubiquinone-10 can be separated and obtained.
  • a method for removing insolubles include a method of separating from a solution by a separation operation such as filtration, centrifugation, or membrane separation. Filtration can be performed by Nutsch ⁇ , Phil Yuichi Press, Noh, 'Sket Separator etc.
  • Crystals of ubiquinone-10 can be obtained by crystallizing crystals of ubiquinone-10 from the solution containing ubiquinone-10 obtained in the above step using a crystallization method or the like.
  • the crystallization method used in the method of the present invention may be any method as long as it can crystallize ubiquinone-10 crystals from the ubiquinone-10-containing solution obtained by the method of the present invention.
  • the crystallization conditions may be any conditions as long as the crystals of ubiquinone 10 are crystallized, and those skilled in the art can set the conditions without trial and error.
  • the crystallization conditions in the cooling crystallization method are as follows: the solution containing ubiquinone-10 obtained in the above step is taken for 1 to 30 hours, preferably for 2 to 20 hours, more preferably for 5 to 15 hours. , 0 to 30 ° C, preferably 10 to 25 ° C, more preferably 15 to 20 ° C.
  • the crystals crystallized by the above-mentioned crystallization method are separated from the solution by filtration, centrifugation and membrane separation, and then dried to obtain crystals of ubiquinone-10.
  • a methanol solution was added to the obtained crystals so as to have a concentration of 85 to 10 O v / v% ′, and the crystals were dissolved at a temperature higher than 30 and lower than 80 ° C.
  • the purity of ubiquinone 10 is 90.0% or more, preferably 95.0% or more, more preferably 97.0% or more, More preferably, a crystal of ubquinone 10% or more of 99. ⁇ % or more can be mentioned.
  • FIG. 1 is a graph showing the solubility of ubiquinone-10 in an aqueous methanol solution.
  • the methanol aqueous solution temperature is 70 ° C: Hata
  • ⁇ is 50 ° C
  • ⁇ is 30 ° C
  • ⁇ is the solubility of ubiquinone at 20 ° C.
  • the ubiquinone was placed in a 3 L fermenter containing 1.8 L of medium sterilized at 121 ° C for 10 minutes.
  • Rhodobacter sphaeroides ATCC 21286 which is a 10-producing bacterium, was inoculated and cultured at 28 ° C for 8 days at 450 rpm.
  • the trace elements tetraborate sodium ⁇ beam of 88 mg / l (borax, ⁇ ⁇ 4 0 7 ⁇ 103 ⁇ 40 ), 37mg / l of Anmoniumu molybdate [( ⁇ 4) 6 ⁇ 7 0 24 ⁇ 43 ⁇ 40] , 8.8 mg / l zinc sulphate (ZnS0 4) of, 270 mg / l of copper sulfate (CuS0 4 '53 ⁇ 40), Shioi ⁇ of 7.2 mg / l
  • Nicotinic acid 8.0mg / L
  • Ubiquinone-10 standard (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used to examine the solubility of ubiquinone-10 in a methanol aqueous solution in relation to the concentration of the solution and the temperature.
  • Figure 1 shows the results.
  • Example 2 80 g of wet cells of Rhodobacter sphaeroides ATCC 21286 obtained in the same manner as in Example 1 were washed three times with water to obtain washed cells. To the washed cells, 500 ml of methanol as an extraction solvent was added, and the mixture was stirred at 20 ° C. for 1 hour, and then centrifuged to remove a methanol solution phase containing a large amount of impurities. The methanol extraction operation described above was repeated twice on the obtained precipitate. Next, methanol was added again, the mixture was stirred at 60 ° C for 1 hour, and an extract was obtained by filtration. The extract contained 99 parts by weight of ubiquinone 110 with respect to 1 part by weight of 3-demethoxyxbiquinone 10.
  • the extract was cooled to 20 ° C. over 5 hours to precipitate ubiquinone-10, and crude crystals of ubiquinone-10 were obtained.
  • the purity of the crystals was 99.5%.
  • Example 4 Purification of Ubiquinone 10 from Dried Cells of Ubiquinone 10 Producing Bacteria Water was added to 80 g of wet cells obtained by centrifuging the culture obtained in the same manner as in Example 1. After mashing and returning to a slurry state, dried cells were obtained with a spray drier (water content: 2.0 w / w%). To the dried cells, 500 ml of methanol was added as an extraction solvent, and the mixture was stirred at 20 ° C. for 1 hour, and then centrifuged to remove a methanol solution phase. The methanol extraction operation described above was repeated twice on the obtained precipitate.
  • a spray drier water content: 2.0 w / w%
  • the extract contained 99 parts by weight of ubiquinone-10 with respect to 1 part by weight of 3-demethoxyubiquinone-10.
  • the extract was cooled to 20 ° C. over 5 hours to precipitate ubiquinone 110, and crude crystals of ubiquinone 110 were obtained.
  • the crystals were dissolved in methanol at 40 ° C. to a concentration of 0.5 g / L, and then cooled to 20 ° C. over 5 hours to obtain crystals of ubiquinone-10.
  • the purity of the crystals was 99.5%.
  • Example 2 To 0.5 L of the culture obtained in the same manner as in Example 1, 0.5 L of methanol was added, and the mixture was stirred at 20 ° C for 1 hour, and then centrifuged to remove a methanol solution phase. The above methanol extraction operation was repeated three times on the obtained precipitate.
  • the extract contained 99 parts by weight of ubiquinone-10 with respect to 1 part by weight of 3-demethoxyubiquinone-10.
  • the extract was cooled to 20 ° C. over 5 hours to precipitate ubiquinone 110, and crude crystals of ubiquinone 110 were obtained.
  • the crystals were dissolved in a medium at 40 ° C. to a concentration of 0.5 g / L, and cooled to 20 ° C. over 5 hours to obtain crystals of ubiquinone-10.
  • the purity of the crystals was 99.5%.
  • Example 2 80 g of wet cells obtained by centrifuging the culture obtained in the same manner as in Example 1 were washed with water to obtain washed cells. An 80 v / v% aqueous methanol solution was added to the cells, and the mixture was stirred at 20 ° C for 1 hour, and then centrifuged to remove a methanol solution phase. The methanol extraction operation described above was repeated 5 times on the obtained precipitate.
  • the extract contained 99 parts by weight of ubiquinone 110 per 1 part by weight of 3-demethoxy ubiquinone 10.
  • Example 7 Purification of Ubiquinone 10 from Crude Purified Ubiquinone 10 The wet cells obtained by centrifuging the culture obtained in the same manner as in Example 1 were subjected to a conventional method.
  • Ubiquinone-110 is extracted using evening solution, and the ubiquinone-10-containing fraction obtained by adsorbing and desorbing ubiquinone-110 contained in the extract to a synthetic adsorption resin in accordance with a conventional method is concentrated. As a result, a crude purified product of ubiquinone-10 having a purity of 82.9% was obtained. To the crude product was added a 80% v / v% aqueous methanol solution, and the mixture was stirred at 20 ° C for 1 hour, and then centrifuged to remove the methanol solution phase. The above methanol extraction operation was repeated 5 times on the obtained precipitate.
  • the extract contained 99 parts by weight of ubiquinone-10 with respect to 1 part by weight of 3-demethoxyubiquinone-10.
  • the extract was cooled to 20 ° C. over 5 hours to precipitate ubiquinone-10, and crude crystals of ubiquinone-10 were obtained.
  • the crystals were dissolved in methanol at 40 ° C. to a concentration of 0.5 g / L, and cooled to 20 ° C. over 5 hours to obtain crystals of ubiquinone-10.
  • the purity of the crystals was 99.5%.
  • high-purity ubiquinone 10 is inexpensively purified from a culture of a microorganism capable of producing ubiquinone 10, a processed product of the culture, or a crudely purified ubiquinone 10. can do.

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Abstract

本発明によれば、以下の工程、[1]ユビキノン-10を生産する能力を有する微生物を培地に培養して得られる培養物、該培養物の処理物、またはユビキノン-10の粗精製物に、50～100v/v%の濃度になるようにメタノール溶液を加え、0以上30℃以下の温度に保持する工程、[2]工程[1]で得られる溶液から不溶物を分離取得する工程、[3]工程[2]で得られる不溶物に、85～100v/v%の濃度のメタノール溶液を加え、30℃より高く80℃以下の温度に保持する工程、および[4]工程[3]で得られる溶液から不溶物を除去する工程、を含むユビキノン-10含有溶液の製造方法が提供される。

Description

明 細 書
ュビキノン— 1 0含有溶液の製造方法
技術分野
本発明は、 ュビキノン一 1 0を含有する培養物、該培養物の処理物、 またはュビキ ノン一 1 0の粗精製物から、 ュビキノン一 1 0を分離精製する方法に関する。
背景技術
ュビキノンー 1 0は広く動植物の組織、微生物の細胞内に存在し、末端電子伝達系 の必須成分として重要な働きをしている。またその薬理作用はうつ血性心不全及び冠 不全、栄養障害による筋ジストロフィーなどに有効であり、医薬品としても価値の高 い物質である。
ュビキノン一 1 0の製造法としては、ュビキノン一 1 0の含有率が高い微生物を培 養して得られる培養物から抽出する方法が一般的である。
該培養物からュビキノン一 1 0を精製する方法としては、従来から有機溶媒等を用 いる抽出法が知られている （特閧平 11- 178595号など） 。 また、 該抽出液からュビキ ノン一 1 0を精製する方法としては、 シリ力ゲルまたは活性アルミナを用いる方法 ( 特開昭 63- 91360号、 特閧平卜 160953号など） が知られている。
しかしながら、上記抽出法で得られる抽出液は、ュビキノン一 1 0以外にュビキノ ン— 1 0類縁体を多く含み、該抽出液から晶析法により直接、高純度のュビキノン一 1 0を精製することは困難である。
シリカゲルまたは活性アルミナを用いた方法では、ュビキノン一 1 0類縁体を多く 含む該抽出液を用いた場合、ュビキノン一 1 0を効率よく分離精製することはできな い。さらに、 シリカゲルおよび活性アルミナは高価であり、 工業規模での製造におい ては、 コスト高につながるという問題もある。
発明の開示
本発明の目的はュビキノン一 1 0を含有する培養物、該培養物の処理物、 またはュ ビキノン一 1 0の粗精製物から、高純度のュビキノン— 1 0を安価に分離精製する方 法を提供することにある。
本発明は以下の （1 ) 〜 （6 ) に関する。
( 1 ) 以下の工程、 [1]ュビキノン一 10を生産する能力を有する微生物を培地に培養して得られる培 養物、 該培養物の処理物、 またはュビキノン— 10の粗精製物に、 50〜100v/ v%の濃度になるようにメタノール溶液を加え、 0°C以上 30°C以下の温度に保持す る工程、
[2] 工程 [1] で得られる溶液から不溶物を分離取得する工程、
[3] 工程 [2] で得られる不溶物に、 85〜100 v/v%の濃度のメタノール溶 液を加え、 30°Cより高く 80°C以下の温度に保持する工程、 および
[4]工程 [3]で得られる溶液から不溶物を除去する工程、 を含むュビキノン一 1
0含有溶液の製造方法。
(2) 請求項 1記載の方法の工程 [2]で得られる不溶物に、 再び 50〜100 v/v%の濃度になるようにメタノール溶液を加え、 0°C以上 30°C以下の温度に保 持した後、不溶物を分離取得する工程を、 1回以上繰り返してから請求項 1記載のェ 程 [3] 以降の工程を行うことを特徴とする上記 （1) の方法。
(3) ュビキノン一 10を生産する能力を有する微生物が、 担子菌、 真菌、 酵母 および細菌からなる群より選ばれる微生物である上記 （1) または （2) の方法。
( 4 ) 培養物の処理物が、 微生物の培養物の濃縮物、 該培養物の乾燥物、 該培養 物から分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、 該菌体の凍結乾燥物、該菌体を洗浄 して得られる洗浄菌体、該洗浄菌体の乾燥物または該洗浄菌体の凍結乾燥物であるこ とを特徴とする、 上記 （1) または （2) の方法。
(5) 上記（1) または （2)の方法で得られるュビキノン一 10含有溶液から ュビキノン一 10の結晶を晶析させることを特徴とするュビキノン一 10の結晶の 製造方法。
(6) ュビキノン— 10の結晶が、 90. 0%以上の純度の結晶である上記 （5 ) の方法。
本発明の方法に用いられるュビキノン— 10を生産する能力を有する微生物は、該 能力を有する微生物であれば、 いずれの微生物でもよいが、例えば、 ュビキノン一 1 0を生産する微生物として知られている担子菌、 真菌、酵母、 および細菌をあげるこ とができる。より具体的には、担子菌としては Ustilago属、真菌としては Aspergillus 属、 Exo asidiumfes Geotrichum属、 Moimscus属、 Paecilomyces属、 SporotrichumB および Tilletiopsis属、 酵母としては Aureobasidium属、 Brettanomyces属、 Bullera 属、 Candida晨、 Cryptococcus属、 Leucosporidium属、 Oosporidium属、 Rhodotorula 属ヽ Rhodospor函属、 Schizosaccharomyces属ヽ Sporobolomyces属、 Torulopsis属ヽ Tremella属、 Trichosporon属ぉよび Sporidiobolus属、 細菌としては、 Acetobacter 属、 Agrobacteriu属、 Corynebacterium属、 Erythrobacter属、 Flavobacterium属、 Methylobacter属、 Microcyclus属、 Paracoccus属、 Phyllobacteriu属、
Protaminobacter s Pseudomonas属、 Rhizobium属、 Rhodobacter属ぉよび Xantomonas 属に属する微生物等をあげることができる。
また、遺伝子組換え等の手法により、ュビキノン合成酵素が強化された Escherichia 属に属する微生物、および該酵素が強化された上記のュビキノン— 1 0を生産する能 力を有する微生物も本発明の方法に用いることができる。
上記の微生物を培養するための培地としては、該微生物が資化し得る炭素源、窒素 源、 無機塩類等を含有し、 該微生物の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、 合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、 グルコース、 フラク卜 —ス、 スクロース、 これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等 の炭水化物、酢酸、 プロピオン酸等の有機酸、 エタノール、 プロパノールなどのアル コール類等を用いることができる。
窒素源としては、 アンモニア、塩化アンモニゥム、硫酸アンモニゥム、酢酸アンモ 二ゥム、 リン酸アンモニゥム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニゥム塩、その他の 含窒素化合物、 ならびに、 ペプトン、 肉エキス、 酵母エキス、 コーンスチープリカー 、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消 化物等を用いることができる。
無機塩としては、 リン酸第一カリウム、 リン酸第二カリウム、 リン酸マグネシウム 、硫酸マグネシウム、 塩化ナトリウム、 硫酸第一鉄、 硫酸マンガン、硫酸銅、 炭酸力 ルシゥム等を用いることができる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は 15〜40°Cがよく、培養時間は、通常 16時間〜 14日間である。培養中の pHは 3.0〜9.0 に保持することが好ましい。 pHの調整は、 無機または有機の酸、 アルカリ溶液、 尿 素、 炭酸カルシウム、 アンモニアなどを用いて行う。
培養が終了した培養物は、そのまま本発明の精製方法に用いることができ、該培養 物の処理物もまた、 本発明の精製方法に用いることができる。
該培養物の処理物としては、該培養物の濃縮物、 該培養物の乾燥物、 該培養物から 分離して得られる菌体、 該菌体の乾燥物、 該菌体の凍結乾燥物、 該菌体を洗浄して得 られる洗浄菌体、該洗浄菌体の乾燥物または該洗浄菌体の凍結乾燥物等をあげること ができる。
上記洗浄菌体とは、ュビキノン一 1 0を実質的に溶解しない溶媒で洗浄した洗浄菌 体であり、例えば該溶媒を用いて 1〜1 0回、 好ましくは 2〜7回、 さらに好ましく は 3〜5回、 洗浄して得られる菌体をあげることができる。
上記洗浄に用いられる溶媒としては、 水が好適に用いられる。
なお、 本発明において、ュビキノン一 1 0を実質的に溶解しないとは、 ュビキノン ― 1 0の工業的精製法において許容される程度のュビキノン— 1 0の溶解性はあつ てもよいことを意味し、 具体的にはュビキノン一 1 0の溶解度が 0 . 0 5 %以下、 よ り好ましくは 0 . 0 2 %以下、 さらに好ましくは 0 . 0 1 %以下であることをいう。 微生物の菌体は、 培養物をろ過、 遠心分離、 膜分離などの分離操作、 好ましくは遠 心分離操作によって得ることができる。 ろ過は、 ヌッチェ、 フィルタープレス、 バス ケット分離機などで行うことができる。
上記培養物および培養物の処理物は、凍結して保存し、必要なときに融解して用い ることもできる。
本発明の方法により、上記培養物、該培養物の処理物からュビキノンー 1 0を精製 することができるほか、ュビキノン一 1 0の粗精製物からュビキノン— 1 0を精製す ることもできる。
ュビキノン一 1 0の粗精製物としては、ュビキノン一 1 0類縁体が多く含まれるュ ビキノン— 1 0含有溶液、乾燥物、凍結乾燥物または晶析物等をあげることができる が、 それらの取得方法はいずれの方法であってもよく、例えば、 ュビキノン一 1 0を 生産する能力を有する微生物を培養して得られる培養物から従来の方法に従い、有機 溶媒等を用いてュビキノン— 1 0を抽出する方法、該抽出液を乾燥または凍結乾燥す る方法、および該粗抽出方法により得られた抽出液を晶析する方法等をあげることが できる。
ュビキノン一 1 0類縁体が多く含まれるュビキノン— 1 0含有溶液等としては、 95 重量部のュビキノン— 1◦に対し、 ュビキノン一 1 0類縁体が 5重量部以上含まれる ュビキノン一 1 0含有溶液等をあげることができる。
ュビキノン一 1 0類縁体としては、 3—デメトキシュビキノン一 1 0等のュビキノ ンー 1 0構造類縁物、およびスフェロイデン等のカロテノィ ド類などをあげることが できる。
本発明の方法で用いられるメ夕ノール溶液としては、メ夕ノールおよびメ夕ノール 水溶液をあげることができる。また、メタノールに他の有機溶媒等を添加して得られ るメタノール溶液もまた、本発明の目的を達成することができる限りにおいて、本発 明の方法で用いられるメ夕ノール溶液としてあげることができる。
上記の方法で得られる微生物の培養物若しくは該培養物の処理物、またはュビキノ ' ン一 1 0の粗精製物に 5 0〜1 0 O v/v %の濃度になるようにメタノール溶液を加 え、 0 °C以上 3 0 °C以下の温度に保持することにより、ュビキノンー 1 0高含有不溶 物を取得することができる。上記メ夕ノ一ル溶液の濃度と温度は、メ夕ノ一ル溶液が 該濃度および温度においてュビキノン一 1 0を実質的に溶解しない濃度と温度の組 み合わせであれば、 いかなる濃度と温度の組み合わせであってもよい。例えば、 メタ ノール溶液としてメタノールまたはメ夕ノ一ル水溶液を用いる場合、濃度が 5 0〜 1 0 0 v/v%で温度が 0 ~ 3 0。C、より好ましくは濃度が 7 0〜； I 0 0 v/v%で温度が 1 0〜 2 0 °C、 さらに好ましくは濃度が 8 0〜 1 0 0 v/v%で温度が 2 0 °Cの組み合わ せをあげることができる。
上記濃度と温度で培養物等を含む溶液を保持する方法としては、例えば攪拌機で 3 0分間〜 1 0時間、好ましくは 1〜 5時間、 さらに好ましくは 1〜 2時間撹拌する方 法をあげることができる。該方法により、該培養物等に含まれるュビキノンー 1 0以 外のュビキノン一 1 0類縁体をメ夕ノール溶液中に抽出することができ、ュビキノン 一 1 0含有不溶物を得ることができる。
上記工程で得られるュビキノン一 1 0含有不溶物は、 ろ過、遠心分離、膜分離など の分離操作によって溶液と分離することができる。 ろ過は、 ヌッチェ、 フィルタープ レス、 バスケット分離機などで行うことができる。 上記一連の工程によって得られる不溶物に再度 5 0〜1 0 0 v/v %の濃度になる ようにメタノール溶液を加え、上記一連の工程を 1回以上、例えば数回繰り返すこと により、 目的とする濃度のュビキノン一 1 0含有不溶物を取得してもよい。
上記工程で得られるュビキノン一 1 0含有不溶物に、 8 5〜1 0 0 v/v %の濃度 のメタノール溶液を加え、 3 0 °Cより高く 8 0 °C以下の温度に保持することにより、 ュビキノン一 1 0を含有するメタノール溶液を取得することができる。
上記不溶物に加えるメ夕ノ一ル溶液の濃度と温度は、使用するメタノール溶液が該 濃度および温度において、上記工程において分離取得される不溶物に含有されるュビ キノンー 1 0を溶解し、かつュビキノン— 1 0以外の夾雑物質を実質的に溶解しない 濃度と温度であれば、いかなる濃度と温度の組み合わせであってもよい。具体的には 例えば、 メタノール溶液の濃度が 8 5 ~ 1 0 0 v/v%で濃度が 3 0 °Cより高く 8 0 °C 以下、 より好ましくは濃度が 9 0〜 1 0 0 v/v%で温度が 5 0 ~ 7 0 °C、 さらに好ま しくは濃度が 9 5〜1 0 0 v/v%で温度が 6 0〜7 0 °Cの組み合わせをあげることが できる。
上記濃度と温度でメ夕ノール溶液を保持する方法としては、例えば攪拌機で 3 0分 間〜 1 0時間、好ましくは 1〜 5時間、 さらに好ましくは 1〜 2時間撹拌する方法を あげることができる。該方法により、ュビキノン— 1 0を含有するメタノール溶液を 取得することができる。
上記工程により取得されるュビキノン一 1 0を含有するメタノール溶液から不溶 物を除去することにより、ュビキノン一 1 0含有溶液を分離、取得することができる 。不溶物を除去する方法としては、 ろ過、 遠心分離、 膜分離などの分離操作によって 溶液と分離する方法をあげることができる。 ろ過は、 ヌッチヱ、 フィル夕一プレス、 ノ、 'スケット分離機などで行うことができる。
上記工程により取得されるュビキノン— 1 0含有溶液からュビキノン一 1 0の結 晶を、晶析法等を用いて晶析させることにより、ュビキノン一 1 0の結晶を取得する ことができる。
本発明の方法に用いられる晶析方法としては、本発明の方法で得られるュビキノン - 1 0含有溶液からュビキノン一 1 0の結晶を晶析させることができる方法であれ ばいかなる方法でもよいが、例えば濃縮晶析法、冷却晶析法およびそれらを組み合わ せた方法等をあげることができる。晶析条件は、ュビキノン一 1 0の結晶が晶析する 条件であれば、 どのような条件でもよく、 該条件は、 当業者であれば試行錯誤なく設 定することができる。冷却晶析法における晶析条件としては、上記工程で得られたュ ビキノン— 1 0含有溶液を、 1〜3 0時間、好ましくは 2〜 2 0時間、 より好ましく は 5〜 1 5時間かけて、 0〜 3 0 °C、 好ましくは 1 0〜 2 5 °C、 より好ましくは 1 5 〜2 0 °Cまで冷却する条件をあげることができる。
上記晶析方法により晶析した結晶を、 ろ過、遠心分離、膜分離によって溶液と分離 した後、乾燥させることによりュビキノン一 1 0の結晶を取得することができる。得 られた結晶に、 8 5〜1 0 O v/v% 'の濃度になるようにメタノール溶液を加え、 3 0 より高く 8 0 °Cより低い温度に保持して該結晶を溶解させた後、上記結晶方法を 1 回以上、 例えば数回繰り返すことにより、 該結晶の純度を高めることができる。 本発明の方法で得られるュビキノン一 1 0の結晶としては、ュビキノン一 1 0の純 度が 9 0 . 0 %以上、 好ましくは 9 5 . ◦%以上、 より好ましくは 9 7 . 0 %以上、 さらに好ましくは 9 9 . ◦%以上のュビキノン一 1 0の結晶をあげることができる。 図面の簡単な説明
第 1図は、 メタノール水溶液に対するュビキノン一 1 0の溶解度を表す図である。 図中、 メタノール水溶液温度が、 秦は 7 0 °C：、 △は 5 0 ° ♦は 3 0 °C、 ▽は 2 0 °C におけるュビキノン一 1 0の溶解度を示す。
以下、 本発明の実施例を示すが、 本実施例は本発明を限定するものではない。 発明を実施するための最良の形態
実施例 1 ュビキノン一 1 0とュビキノン一 1 0類縁体混合物からのュビキノン一 1 0類縁体の効率的除去方法
以下の第 1表記載の組成を有する培地を PH9.0に調整し、炭酸カルシウムを 1%添カロ した後、 121°Cで 10分間滅菌した 1.8Lの培地を入れた 3Lの発酵槽にュビキノン一 1 0 生産菌である Rhodobactersphaeroides ATCC 21286を植菌し、 8日間、 28°C、 撹拌回転 数 450rpmで培養した。表中、 トレースエレメントとは、 88mg/lのテトラホウ酸ナトリ ゥム（ホウ砂、 Ν Β407· 10¾0)、 37mg/lのモリブデン酸アンモニゥム [(ΝΗ4)6Μο7024 ·4¾0 ]、 8.8mg/lの硫酸亜鉛 （ZnS04) 、 270mg/lの硫酸銅 （CuS04'5¾0) 、 7.2mg/lの塩ィ匕
(MnCl2-4H20) および 970mg/lの塩化第 2鉄 （FeCl3'6¾0) からなる溶液を示 す。
第 1表
組成物 濃度
廃糖蜜 4.0 %
グルコース 2.7 %
コーンスチープリーカー 4.0 %
硫酸アンモニゥム 0.8 %
リン酸第 1カリウム 0.05 %
リン酸第 2カリウム 0.05 %
硫酸マグネシウム · 7水和物 0.025%
硫酸第一鉄■ 7水和物 3.0mg/L
チアミン 8.0mg/L
ニコチン酸 8.0mg/L
卜レースエレメント 1 .0mL/L
培養終了後、 0.3mlの培養物に、 20%のフヱリシアン化カリウム [K3Fe(CN)6] 溶液 を 1 1、 2-ブ夕ノールを 0.3mlおよびガラスビーズを 0.3ml加え、マルチビーズショッ カー MB200 (安井器械社製） を用いて 30分間振盪して菌体を破碎することにより、 ュ ビキノン一 1 0およびュビキノン一 1 0類縁体を完全に抽出した。 該破砕抽出液を 15000rpmで 10分間、遠心分離して得られる上清を HPLC分析した結果、ュビキノンー 1 0に対する 3—デメ トキシュビキノン— 1 0の比率は 1 %であった。
一方、培養終了後、培養物を遠心分離により集菌して得られた 80 gの湿菌体を水で 3回洗浄し、 洗浄菌体を取得した。 該洗浄菌体に 10、 20、 40または 60°Cの 100v/v%の メタノールを 500mlカ卩ぇ 1時間撹拌した後、遠心分離し、 沈殿物を取得した。得られた 沈殿物のュビキノン一 1 0に対する 3—デメ トキシュビキノン一 1 0 (3- dmUBD) の 比率を高速液体ク口マトグラフィ一で分析した結果を第 2表に示す。
第 2表
/皿反 し 3-dmU BD比率 (％)
1 0 0. 03
20 0. 05
40 0. 71
60 0. 61 上記結果から、本発明の方法を用いることにより、ュビキノン一 1 0とュビキノン — 1 0類縁体を含有する溶液から、ュビキノン一 1 0類縁体を効率よく除去できるこ とが確認された。
実施例 2 メタノール溶液に対するュビキノン一 1 0の溶解度
ュビキノン一 1 0標品（和光純薬社製） を用いて、 メタノール水溶液に対するュビ キノン— 1 0の溶解度を、溶液の濃度と温度の関係において調べた。結果を第 1図に 示す。
ュビキノン一 1 0の溶解度は、メ夕ノール濃度とメ夕ノール水溶液温度に比例して 増加することが示された。
実施例 3 ュビキノン— 1 0生産菌の菌体からのュビキノン一 1 0の精製
実施例 1と同様の方法により取得した Rhodobacter sphaeroides ATCC 21286の湿菌 体 80 gを水で 3回洗浄し、 洗浄菌体を取得した。 該洗浄菌体に抽出溶媒としてメ夕ノ —ル 500mlを加え 20°Cで 1時間撹拌した後、遠心分離し、夾雑物を多く含むメタノール 溶液相を除いた。得られた沈殿物に対し、上記メタノール抽出操作を 2回繰り返した。 次に、 再度メタノールを加えて 60°Cで 1時間撹拌した後、 ろ過により抽出液を取得 した。該抽出液中には 1重量部の 3—デメ トキシュビキノン一 1 0に対し、 99重量部 のュビキノン一 1 0が含まれていた。
該抽出液を 5時間以上かけて 20°Cまで冷却することでュビキノン— 1 0を析出させ、 ュビキノン一 1 0の粗結晶を取得した。該結晶を 40°Cのメタノールに 0.5g/Lとなるよ うに溶解した後、 5時間かけて 20°Cまで冷却することにより、 ュビキノン一 1 0の結 晶を取得した。 該結晶の純度は 99.5%であった。
実施例 4 ュビキノン一 1 0生産菌の乾燥菌体からのュビキノン一 1 0の精製 実施例 1と同様の方法で取得した培養物を遠心分離して得られた 80gの湿菌体に水 を添カ卩して、 スラリー状態に戻した後、 スプレードライヤーで乾燥菌体を取得した（ 水分含量 2.0w/w%)。該乾燥菌体に抽出溶媒として 500mlのメタノールを加え、 20°Cで 1時間撹拌した後、遠心分離し、 メタノール溶液相を除いた。得られた沈殿物に対し 、 上記メタノール抽出操作を 2回繰り返した。
次に、 再度メタノールを加えて 60°Cで 1時間撹拌した後、 ろ過により抽出液を取得 した。該抽出液中には 1重量部の 3—デメトキシュビキノン— 1 0に対し、 99重量部 のュビキノン一 1 0が含まれていた。
該抽出液を 5時間以上かけて 20°Cまで冷却することでュビキノン一 1 0を析出させ、 ュビキノン一 1 0の粗結晶を取得した。該結晶を 40°Cのメタノールに 0.5g/Lとなるよ うに溶解した後、 5時間以上かけて 20°Cまで冷却することにより、 ュビキノン一 1 0 の結晶を取得した。 該結晶の純度は 99.5%であった。
実施例 5 ュビキノン— 1 0生産菌の培養物からのュビキノン— 1 0の精製
実施例 1と同様の方法で取得した培養物 0.5 Lに、 0.5 Lのメタノールを加え、 20 °Cで 1時間攪拌した後、 遠心分離し、 メタノール溶液相を除いた。 得られた沈殿物に 対し、 上記メタノール抽出操作を 3回繰り返した。
次に、 再度メタノールを加えて 60°Cで 1時間撹袢した後、 ろ過により抽出液を取得 した。該抽出液中には 1重量部の 3—デメトキシュビキノン— 1 0に対し、 99重量部 のュビキノン一 1 0が含まれていた。
該抽出液を 5時間以上かけて 20°Cまで冷却することでュビキノン一 1 0を析出させ、 ュビキノン一 1 0の粗結晶を取得した。該結晶を 40°Cのメ夕ノ一ルに 0.5g/Lとなるよ うに溶解した後、 5時間以上かけて 20°Cまで冷却することにより、 ュビキノン一 1 0 の結晶を取得した。 該結晶の純度は 99.5%であった。
実施例 6 メ夕ノール水溶液を用いたュビキノン一 1 0の精製
実施例 1と同様の方法で取得した培養物を遠心分離して得られた 80 gの湿菌体を 水で洗浄して洗浄菌体を取得'した。 該菌体に 80v/v%のメ夕ノール水溶液を添加し、 20°Cで 1時間撹拌した後、 遠心分離し、 メタノール溶液相を除いた。 得られた沈殿物 に対し、 上記メタノール抽出操作を 5回繰り返した。
次に、 95v/v%メタノール溶液を添加して 60°Cで 1時間攪拌した後、 ろ過により抽 出液を取得した。該抽出液中には 1重量部の 3—デメトキシュビキノン一 1 0に対し 、 99重量部のュビキノン一 1 0が含まれていた。
該抽出液を 5時間以上かけて 20°Cまで冷却することでュビキノン一 1 0を析出させ、 ュビキノン一 1 0の粗結晶を取得した。次に該結晶を 40°Cのメタノールに 0.5g/Lとな るように溶解した後、 5時間以上かけて 20°Cまで冷却することにより、 ュビキノン一 1 0の結晶を取得した。 該結晶の純度は 99.5%であった。 実施例 7 ュビキノン一 1 0の粗精製物からのュビキノン一 1 0の精製 実施例 1と同様の方法で取得した培養物を遠心分離して得られた湿菌体を常法に 従い 2-ブ夕ノールを用いてュビキノン一 1 0を抽出し、該抽出液に含有されるュビキ ノン一 1 0を常法に従い合成吸着樹脂に吸脱着させて得られるュビキノン— 1 0含 有画分を濃縮晶析することにより純度 82.9%のュビキノン一 1 0の粗精製物を取得 した。該粗精製物に 80v/v%の含水メタノール溶液を添加し、 20°Cで 1時間撹拌した後 、遠心分離し、 メタノール溶液相を除いた。得られた沈殿物に対し、 上記メタノール 抽出操作を 5回繰り返した。
次に、 95v/v%メタノール溶液を添加して 60°Cで 1時間攪拌した後、ろ過により抽出 液を取得した。 該抽出液中には 1重量部の 3—デメトキシュビキノン一 1 0に対し、 99重量部のュビキノン— 1 0が含まれていた。
該抽出液を 5時間以上かけて 20°Cまで冷却することでュビキノン— 1 0を析出させ、 ュビキノン一 1 0の粗結晶を取得した。次に該結晶を 40°Cのメタノールに 0.5g/Lとな るように溶解した後、 5時間以上かけて 20°Cまで冷却することにより、 ュビキノン一 1 0の結晶を取得した。 該結晶の純度は 99.5%であった。
産業上の利用可能性
本発明の方法によれば、ュビキノン一 1 0を生産する能力を有する微生物の培養物 、該培養物の処理物、またはュビキノン一 1 0粗精製物から高純度のュビキノン一 1 0を安価に精製することができる。

Claims

請求の範囲
1. 以下の工程、
[ 1]ュビキノン一 10を生産する能力を有する微生物を培地に培養して得られる培 養物、 該培養物の処理物、 またはュビキノン— 10の粗精製物に、 50〜 100 v/ v%の濃度になるようにメタノール溶液を加え、 0°C以上 30°C以下の温度に保持す る工程、
[2]工程 [1]で得られる溶液から不溶物を分離取得する工程、
[3]工程 [2]で得られる不溶物に、 85〜100 v/v%の濃度のメタノール溶 液を加え、 30°Cより高く 80°C以下の温度に保持する工程、 および
[4]工程 [3]で得られる溶液から不溶物を除去する工程、
を含むュビキノン— 10含有溶液の製造方法。
2. 請求項 1記載の方法の工程 [2]で得られる不溶物に、 再び 50〜100 v/ v%の濃度になるようにメタノール溶液を加え、 0°C以上 30°C以下の温度に保持し た後、 不溶物を分離取得する工程を、 1回以上繰り返してから請求項 1記載の工程 [ 3]以降の工程を行うことを特徴とする請求項 1記載の方法。
3. ュビキノン— 10を生産する能力を有する微生物が、 担子菌、 真菌、 酵母およ び細菌からなる群より選ばれる微生物である請求項 1,または 2記載の方法。
4. 培養物の処理物が、 微生物の培養物の濃縮物、 該培養物の乾燥物、 該培養物か ら分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体を洗浄して 得られる洗浄菌体、該洗浄菌体の乾燥物または該洗浄菌体の凍結乾燥物であることを 特徴とする、 請求項 1または 2記載の方法。
5. 請求項 1または 2記載の方法で得られるュビキノン— 10含有溶液からュビキ ノン一 10の結晶を晶析させることを特徴とするュビキノン一 10の結晶の製造方 法。
6. ュビキノン— 10の結晶が、 90. ◦%以上の純度の結晶である請求項 5記載 の方法。
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