CN114181990A - 一种酶法联合微生物发酵制备大豆低聚肽的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了一种酶法联合微生物发酵制备大豆低聚肽的方法，包括大豆分离蛋白预处理、复合酶酶解、微生物发酵、分离纯化的等步骤。本公开还提供了一种大豆低聚肽的应用，即可用于制备大豆低聚肽咀嚼片。
Description
技术领域
本公开涉及食品加工的技术领域，尤其涉及一种酶法联合微生物发酵制备大豆低聚肽的方法及其应用。
背景技术
大豆蛋白营养价值很高，有丰富的优质蛋白，可以提供充足的人体所需的8种必需氨基酸、多种维生素和矿物质等。但大豆蛋白质分子结构复杂，相对分子量较大，溶解性差，消化率和生物效价不及牛乳等动物蛋白质。大豆肽是由大豆蛋白经过蛋白酶作用或者微生物技术处理后，再经过分离、精制等特殊处理而得到的低聚肽混合物，还包括一些游离氨基酸、水、灰分和少量的糖分等。大豆肽一般是由3～6个氨基酸组成的低分子量肽，蛋白质含量为85％左右，氨基酸组成与大豆蛋白质大体相同，必需氨基酸含量丰富且平衡。大豆肽的平均分子量小于1000道尔顿，主要出峰位置在分子量为300～700道尔顿。大豆肽具有良好的生物活性，如:促进脂肪代谢、抗氧化、降血脂和抗血栓形成等；同时具有良好的营养特征和加工性能，大豆肽能促进微生物的生长发育和代谢，在醋、酱油、奶酪、发酵食品中添加大豆肽可以显著提高产品的品质和营养价值，并增强产品的口感风味等，大豆肽作为新一代的超级蛋白营养素和多功能生理活性物质，具有广阔的应用及市场前景。
现有技术采用酶法或微生物发酵法制备大豆低聚肽都存在一些不足，采用单独酶法制备大豆低聚肽工艺存在酶解周期长、使用化学品多、产生苦味大、溶解性能差、产品得率低，而且需要投资的膜分离设备价格昂贵，处理效率低，维护成本高。而微生物发酵法存在发酵周期长、发酵条件比较严苛、菌株效率低、产能局限、成本高等问题。
发明内容
针对上述传统方法制备大豆低聚肽的问题，本公开提供了一种酶法联合微生物发酵制备大豆低聚肽的方法，包括：
步骤一、大豆分离蛋白预处理：以大豆分离蛋白粉为原料，大豆分离蛋白按1：8～1：10(w/v)料液比(kg：L)加入纯化水，常温下剪切30～60min，剪切速度600～1000r/min；得到蛋白匀浆液；
步骤二、复合酶酶解：在所述蛋白匀浆液中滴加碱液调节体系pH至8.0～8.5,通过维持pH＝8.0～8.5条件下，不断地富集含羧基基团的低聚肽，正向提高大豆分离蛋白的水解度，采用复合酶A和复合酶B梯度酶解：先添加复合酶A，通过控制体系pH维持在8.0～8.5，酶解温度50～60℃，酶解2～3小时；再加入复合酶B，酶解1～2小时，高温灭菌，再降温至30～38℃；得到复合酶酶解液；
步骤三、微生物发酵：控制发酵温度30～38℃；在复合酶酶解液中加入碳源以及无机盐氯化铵缓冲体系，再加入活性干酵母发酵发酵，活性干酵母添加质量按发酵液体积的0.05％～0.4％(w/v)，发酵3～5h，控制酒精度1～3(％Vol)；再加入东方醋酸菌发酵，东方醋酸菌添加质量按发酵液体积的0.1％～1.0％(w/v)，发酵1～3h，控制产乙酸5～20g/L；再加入枯草芽孢杆菌及植物乳酸菌发酵，枯草芽孢杆菌和植物乳酸菌添加质量按发酵液体积的0.1％～0.8％(w/v)，发酵4～8h；东方醋酸菌产酸富集，待发酵体系的pH＝4.4～4.8，终止发酵；
步骤四、分离纯化：发酵结束后灭菌，通过东方醋酸菌代谢产酸的富集让分散型的蛋白变性沉淀，离心机分离2000～4000r/min，得到发酵清液和固体渣，所述固体渣通过高温灭菌，冻干后，得到大豆发酵粉；所述发酵清液通过活性炭脱色脱味、板框过滤、纳滤脱盐浓缩、UHT杀菌、喷雾干燥工序，得到大豆低聚肽。
作为实施例的优选方式，所述步骤二中，所述复合酶A添加量为大豆分离蛋白粉质量的0.8％～2.0％(w/w)，所述复合酶B添加量为大豆分离蛋白粉质量的0.3％～1.0％(w/w)。
作为实施例的优选方式，所述步骤二中，所述复合酶A或所述复合酶B为碱性蛋白酶Alcalase 2.4L、胰酶、胶原酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶中的任意一种酶与果胶酶的复合酶，复配比例为5：1。
作为实施例的优选方式，所述步骤三中，枯草芽孢杆菌和植物乳酸菌的质量组分比为2：1。
本公开还提供了一种组合物，包括以下重量份数的组分：所述大豆发酵粉25～35份、多聚果糖15～25份、桑葚发酵粉15～25份、β-环糊精10～15份、麦芽糊精10～15份、菊粉5～10份、维生素C1.5～2份。
本公开还提供了另外一种组合物，包括以下重量份数的组分：所述大豆低聚肽25～35份、山梨糖醇15～20份、低聚异麦芽糖15～20份、珠肽粉10～15份、燕麦10～15份、硬脂酸镁1～5份、Na-CMC 1～5份。
本公开利用微生物代谢活动产生的混合酶能够催化生物活性肽的生成，微生物可借助多肽水解液提高生长及产酶能力，同时微生物代谢过程中产生的物质对原料加工过程中起到不同的改性功能，具有一定的协同作用，生产效率更高，将释放的小肽通过移接和重排，经过微生物作用对某些苦味基团进行修饰、转移和重组，使获得的大豆肽具有更好的溶解性，无苦味，增强其应用价值。
采用上述技术方案后，本公开具有以下有益效果：
1.本公开大豆分离蛋白在碱性蛋白酶和中性蛋白酶梯度复合体系中酶解，通过维持pH＝8.0-8.5条件下，不断地富集含羧基基团的低聚肽，正向提高大豆分离蛋白的水解度，利用东方醋酸菌、活性干酵母、枯草芽孢杆菌、植物乳酸菌混合菌群高效协同发酵，二次提高大豆分离蛋白的水解度以及大大提高大豆低聚肽产品的得率。
2.本公开依托东方醋酸菌富集产酸效应，使难以降解的大豆分离蛋白在pH＝4.4～4.8下产生絮凝沉淀，因大豆分离蛋白本身分散性好易造成大豆发酵液乳化现象，难于澄清处理，给生产物料分离造成困难，需要借助化学絮凝药剂、澄清剂、陶瓷膜设备等手段，东方醋酸菌的产酸特性进而高效的解决发酵液的澄清分离问题，降低能耗和成本，保证产品食用安全性。
3.本公开微生物发酵对大豆低聚肽苦味基团进行修饰、转移和重组，特征改性无苦味、溶解性好、强酸性下稳定。
4.本公开大豆低聚肽添加珠肽粉，抑制胰脂酶的活性，从而减少小肠对于脂肪的吸收，起到降低胆固醇的保健作用，低聚异麦芽糖改善口感，添加硬脂酸镁和Na-CMC进行压片，保证产品硬度优越，提高大豆低聚肽的生物活性功能和口感的进一步提升。
5.本公开提高了大豆分离蛋白的高附加值，综合利用加工副产物，无生产废料的排放，实现了一条高产、绿色、环保、无污染的制备大豆发酵粉和大豆低聚肽产品联产方法。
附图说明
附图示出了本公开的示例性实施方式，并与其说明一起用于解释本公开的原理，其中包括了这些附图以提供对本公开的进一步理解，并且附图包括在本说明书中并构成本说明书的一部分。
图1是本公开的工艺流程图。
图2是本公开的大豆低聚肽的得率结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施方式对本公开作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于解释相关内容，而非对本公开的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与本公开相关的部分。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本公开中的实施方式及实施方式中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施方式来详细说明本公开。
如图1所示，本公开提供了一种酶法联合微生物发酵制备大豆低聚肽的方法，包括：
步骤一、大豆分离蛋白预处理：以大豆分离蛋白粉为原料，大豆分离蛋白按1：8～1：10(w/v)料液比加入纯化水，常温下剪切30～60min，剪切速度600～1000r/min；得到蛋白匀浆液；
步骤二、复合酶酶解：在所述蛋白匀浆液中滴加碱液调节体系pH至8.0～8.5,采用复合酶A和复合酶B梯度酶解：先添加复合酶A，通过控制体系pH维持在8.0～8.5，酶解温度50～60℃，酶解2～3小时；再加入复合酶B，酶解1～2小时，高温灭菌，再降温至30～38℃；得到复合酶酶解液；
作为实施例的优选方式，所述步骤二中，所述复合酶A添加量为大豆分离蛋白粉质量的0.8％～2.0％(w/w)，所述复合酶B添加量为大豆分离蛋白粉质量的0.3％～1.0％(w/w)。
作为实施例的优选方式，所述步骤二中，所述复合酶A或所述复合酶B为碱性蛋白酶Alcalase 2.4L、胰酶、胶原酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶中的任意一种酶与果胶酶的复合酶，复配比例为5：1。
步骤三、微生物发酵：控制发酵温度30～38℃；在复合酶酶解液中加入碳源以及无机盐氯化铵缓冲体系，再加入活性干酵母发酵发酵，活性干酵母添加质量按发酵液体积的0.05％～0.4％(w/v)，发酵3～5h，控制酒精度1～3(％Vol)；再加入东方醋酸菌发酵，东方醋酸菌添加质量按发酵液体积的0.1％～1.0％(w/v)，发酵1～3h，控制产乙酸5～20g/L；再加入枯草芽孢杆菌及植物乳酸菌发酵，枯草芽孢杆菌和植物乳酸菌添加质量按发酵液体积的0.1％～0.8％(w/v)，发酵4～8h；东方醋酸菌产酸富集，待发酵体系的pH＝4.4～4.8，终止发酵；
本公开利用东方醋酸菌、活性干酵母、枯草芽孢杆菌、植物乳酸菌混合菌群高效协同发酵，活性干酵母利用糖源代谢产生乙醇，耐醇性东方醋酸菌利用乙醇代谢产有机酸，进而通过枯草芽孢杆菌、植物乳酸菌借助多肽水解液提高生长及产内源性蛋白酶能力，具有协同作用，可以提高产品得率。依托东方醋酸菌富集产酸效益，使难以降解的大豆分离蛋白在pH＝4.4～4.8下产生絮凝沉淀，因大豆分离蛋白本身分散性好易造成大豆发酵液乳化现象，难于澄清处理，给生产物料分离造成困难，需要借助化学絮凝药剂、澄清剂、陶瓷膜设备等手段，东方醋酸菌的产酸特性进而高效的解决发酵液的澄清分离问题，降低能耗和成本，保证产品食用安全性。经过微生物作用对大豆低聚肽苦味基团进行修饰、转移和重组，特征改性无苦味、溶解性好、酸性稳定。
作为实施例的优选方式，所述步骤三中，枯草芽孢杆菌和植物乳酸菌的质量组分比为2：1。
步骤四、分离纯化：发酵结束后灭菌，通过东方醋酸菌代谢产酸的富集让分散型的蛋白变性沉淀，离心机分离2000～4000r/min，得到发酵清液和固体渣，所述固体渣通过高温灭菌，冻干后，得到大豆发酵粉；所述发酵清液通过活性炭脱色脱味、板框过滤、纳滤脱盐浓缩、UHT杀菌、喷雾干燥工序，得到大豆低聚肽。
具体而言，固体渣通过高温灭菌，冻干技术制作成大豆发酵粉，通过方锥混料机进行混匀，频率20～30Hz，时间30～60分钟。发酵清液采用活性炭添加按发酵液的0.08％～0.15％(w/v)脱色脱味，温度45～50℃，时间1～1.5h，板框填充白色和红色硅藻土按发酵液的0.1％～0.3％(w/v)填充均匀，重量比为白土：红土＝1：1，过滤澄清后，利用纳滤膜DK200，规格为SUEZ卷式有机膜，分子量为200Da，控制膜前压力为0.2～0.3MPa，膜后压力为0.2～0.3MPa，初始浓度4～5％Brix，脱盐浓缩至8～10％Brix，再添加0.2～0.5倍发酵液体积的纯水，平均分2～3次补水脱盐，控制终点物料10％Brix，电导率终点为6～8ms/cm，送料至全自动UHT杀菌设备，杀菌参数为：105～110℃，2～3min；灭菌后的物料输送至喷雾干燥塔，干燥参数为：螺杆泵5～10Hz，进风温度180～190℃，出风温度90～95℃，得到水分低于7％大豆低聚肽末。
本公开还提供了一种组合物，包括以下重量份数的组分：所述大豆发酵粉25～35份、多聚果糖15～25份、桑葚发酵粉15～25份、β-环糊精10～15份、麦芽糊精10～15份、菊粉5～10份、维生素C1.5～2份。
本公开还提供了另外一种组合物，包括以下重量份数的组分：所述大豆低聚肽25～35份、山梨糖醇15～20份、低聚异麦芽糖15～20份、珠肽粉10～15份、燕麦10～15份、硬脂酸镁1～5份、Na-CMC 1～5份。
实施例1
一种酶法联合微生物发酵制备大豆低聚肽的方法，以大豆分离蛋白粉为主要原料，剪切罐加入纯化水9kg，大豆分离蛋白1kg，常温下快速剪切30min，剪切速度800r/min；大豆蛋白匀浆液中滴加20％氢氧化钠溶液调节体系pH＝8.5,采用碱性蛋白酶Alcalase2.4L和中性蛋白酶梯度酶解，碱性蛋白酶Alcalase 2.4L 16g，果胶酶3.2克，通过控制体系pH维持在8.0-8.5，酶解温度55℃，酶解3小时，自然pH再加入中性蛋白酶5g，果胶酶1g，酶解1小时，90℃高温灭酶及灭菌30分钟。采用板式换热快速降温35℃；转至多级控温发酵罐中，碳源白砂糖加入1kg，缓冲体系无机盐氯化铵添加50g，依次加入活性干酵母15g，发酵4h，控制酒精度3(％Vol)，东方醋酸菌添加20克发酵2h，产乙酸10g/L、分别加入枯草芽孢杆菌20g和植物乳酸菌添10g，发酵6h，利用高产酸的东方醋酸菌及其复合菌联合发酵，控制发酵温度35℃，发酵12小时；东方醋酸菌产酸富集，待发酵体系的pH＝4.5，终止发酵，通过东方醋酸菌代谢产酸的富集让分散型的蛋白变性沉淀，升温至90℃高温灭酶及灭菌30分钟；通过夹套快速降温至常温，利用碟式离心机分离3000r/min，分离出发酵清液和固体渣，固体渣通过高温灭菌，冻干技术制作成大豆发酵粉，通过方锥混料机进行混匀，频率30Hz，时间30分钟，颗粒冲剂产品按重量份的组分含量为：大豆发酵粉30份、多聚果糖20份、桑葚发酵粉20份、β-环糊精10份、麦芽糊精10份、菊粉8份、维生素C 2份；清液加入100目HPM-05型活性炭15g脱色脱味，温度45℃，时间1h，板框填充白色和红色硅藻土分别各加入15克，填充均匀，过滤澄清后，利用纳滤膜DK200，规格为SUEZ卷式有机膜，分子量为200Da，控制膜前压力为0.25MPa，膜后压力为0.25MPa，初始浓度4％Brix，脱盐浓缩至10％Brix，再添加5kg纯水，平均分2次补水脱盐，控制终点物料10％Brix，电导率终点为6.5ms/cm，送料至全自动UHT杀菌设备，杀菌参数为：110℃，3min；灭菌后的物料输送至喷雾干燥塔，干燥参数为：螺杆泵5Hz，进风温度185℃，出风温度95℃，得到水分为4.8％大豆低聚肽末；咀嚼片产品按重量份的组分含量为：大豆低聚肽30份、山梨糖醇20份、低聚异麦芽糖15份、珠肽粉15份、燕麦10份、硬脂酸镁5份、适量添加Na-CMC 5份。
实施例2
一种酶法联合微生物发酵制备大豆低聚肽的方法，以大豆分离蛋白粉为主要原料，剪切罐加入纯化水9kg，大豆分离蛋白1kg，常温下快速剪切30min，剪切速度800r/min；大豆蛋白匀浆液中滴加20％氢氧化钠溶液调节体系pH＝8.5,添加胶原酶15g，果胶酶3克进行酶解，通过控制体系pH维持在8.0-8.5，酶解温度55℃，酶解3小时，自然pH再加入木瓜蛋白酶6g，果胶酶1.2g，酶解1小时，90℃高温灭酶及灭菌30分钟。采用板式换热快速降温35℃；转至多级控温发酵罐中，碳源白砂糖加入1kg，缓冲体系无机盐氯化铵添加50g，依次加入活性干酵母15g，发酵2h，控制酒精度1(％Vol)，东方醋酸菌添加20克发酵4h，产乙酸10g/L、分别加入枯草芽孢杆菌20g和植物乳酸菌10g，发酵10h，利用高产酸的东方醋酸菌及其复合菌联合发酵，控制发酵温度35℃，发酵15小时；东方醋酸菌产酸富集，发酵体系的pH＝4.5，结束发酵，通过东方醋酸菌代谢产酸的富集让分散型的蛋白变性沉淀，升温至90℃高温灭酶及灭菌30分钟；通过夹套快速降温至常温，利用碟式离心机分离3000r/min，分离出发酵清液和固体渣，固体渣通过高温灭菌，冻干技术制作成大豆发酵粉，通过方锥混料机进行混匀，频率30Hz，时间30分钟；颗粒冲剂产品按重量份的组分含量为：大豆发酵粉25份、多聚果糖20份、桑葚发酵粉20份、β-环糊精12份、麦芽糊精12份、菊粉9份、维生素C 2份；咀嚼片产品按重量份的组分含量为：大豆低聚肽25份、山梨糖醇22份、低聚异麦芽糖18份、珠肽粉15份、燕麦10份、硬脂酸镁5份、适量添加Na-CMC5份；
实施例3：
一种酶法联合微生物发酵制备大豆低聚肽的方法，以大豆分离蛋白粉为主要原料，剪切罐加入纯化水9kg，大豆分离蛋白1kg，常温下快速剪切30min，剪切速度800r/min；大豆蛋白匀浆液中滴加20％氢氧化钠溶液调节体系pH＝8.5,添加胰酶15g，果胶酶3克进行酶解，通过控制体系pH维持在8.0-8.5，酶解温度55℃，酶解3小时，自然pH再加入风味蛋白酶6g，果胶酶1.2g，酶解1小时，90℃高温灭酶及灭菌30分钟。采用板式换热快速降温35℃；转至多级控温发酵罐中，碳源白砂糖加入1kg，缓冲体系无机盐氯化铵添加50g，依次加入活性干酵母15g，发酵6h，控制酒精度4(％Vol)，东方醋酸菌添加20克发酵1.5h，产乙酸10g/L、分别加入枯草芽孢杆菌20g和植物乳酸菌添10g，发酵4h，利用高产酸的东方醋酸菌及其复合菌联合发酵，控制发酵温度35℃，发酵11.5小时；东方醋酸菌产酸富集，待发酵体系的pH＝4.5，终止发酵，通过东方醋酸菌代谢产酸的富集让分散型的蛋白变性沉淀，升温至90℃高温灭酶及灭菌30分钟；通过夹套快速降温至常温，利用碟式离心机分离3000r/min，分离出发酵清液和固体渣，固体渣通过高温灭菌，冻干技术制作成大豆发酵粉，通过方锥混料机进行混匀，频率30Hz，时间30分钟；颗粒冲剂产品按重量份的组分含量为：大豆发酵粉22份、多聚果糖20份、桑葚发酵粉20份、β-环糊精15份、麦芽糊精12份、菊粉9份、维生素C2份；咀嚼片产品按重量份的组分含量为：大豆低聚肽32份、山梨糖醇20份、低聚异麦芽糖13份、珠肽粉15份、燕麦10份、硬脂酸镁5份、适量添加Na-CMC5份。
实施例4
一种酶法联合微生物发酵制备大豆低聚肽的方法，以大豆分离蛋白粉为主要原料，剪切罐加入纯化水9kg，大豆分离蛋白1kg，常温下快速剪切30min，剪切速度800r/min；大豆蛋白匀浆液中滴加20％氢氧化钠溶液调节体系pH＝8.5,添加碱性蛋白酶Alcalase2.4L 16g，果胶酶3.2克进行酶解，通过控制体系pH维持在8.0-8.5，酶解温度55℃，酶解3小时，自然pH再加入中性蛋白酶5g，果胶酶1g，酶解1小时，90℃高温灭酶及灭菌30分钟。采用板式换热快速降温35℃；转至多级控温发酵罐中，碳源白砂糖加入1kg，缓冲体系无机盐氯化铵添加50g，依次加入活性干酵母15g，发酵4h，控制酒精度3(％Vol)，分别加入枯草芽孢杆菌20g和植物乳酸菌添10g，发酵8h，控制发酵温度35℃，发酵12小时；终止发酵，发酵体系出现严重乳化现象；需要借助化学药剂或膜过滤设备，高速离心、板框过滤无法澄清处理。
实施例5
一种酶法联合微生物发酵制备大豆低聚肽的方法，以大豆分离蛋白粉为主要原料，剪切罐加入纯化水9kg，大豆分离蛋白1kg，常温下快速剪切30min，剪切速度800r/min；大豆蛋白匀浆液中滴加20％氢氧化钠溶液调节体系pH＝8.5,添加碱性蛋白酶Alcalase2.4L 16g，果胶酶3.2克进行酶解，通过控制体系pH维持在8.0-8.5，酶解温度55℃，酶解3小时，自然pH再加入中性蛋白酶5g，果胶酶1g，酶解1小时，90℃高温灭酶及灭菌30分钟。采用板式换热快速降温35℃；转至多级控温发酵罐中，碳源白砂糖加入1kg，缓冲体系无机盐氯化铵添加50g，依次加入活性干酵母15g，发酵4h，控制酒精度3(％Vol)，东方醋酸菌添加20克发酵1.5h，产乙酸10g/L，发酵8h，控制发酵温度35℃，发酵12小时；终止发酵，发酵体系pH＝4.5，出现絮凝现象，终止发酵，碟式离心机分离，最终大豆发酵粉得率提高10％，大豆低聚肽产品得率下降15％。
对比例1
一种酶法联合微生物发酵制备大豆低聚肽的方法，以大豆分离蛋白粉为主要原料，剪切罐加入纯化水9kg，大豆分离蛋白1kg，常温下快速剪切30min，剪切速度800r/min；大豆蛋白匀浆液中，90℃高温灭酶及灭菌30分钟。采用板式换热快速降温35℃；转至多级控温发酵罐中，碳源白砂糖加入1kg，缓冲体系无机盐氯化铵添加50g，依次加入活性干酵母15g，发酵6h，控制酒精度3(％Vol)，东方醋酸菌添加20克发酵4h，产乙酸10g/L、分别加入枯草芽孢杆菌20g和植物乳酸菌添10g，发酵10h，利用高产酸的东方醋酸菌及其复合菌联合发酵，控制发酵温度35℃，发酵18小时；东方醋酸菌产酸富集，待发酵体系的pH＝4.5，终止发酵，通过东方醋酸菌代谢产酸的富集让分散型的蛋白变性沉淀，升温至90℃高温灭菌30分钟；通过夹套快速降温至常温，利用碟式离心机分离3000r/min，分离出发酵清液和固体渣，固体渣通过高温灭菌，冻干技术制作成大豆发酵粉，通过方锥混料机进行混匀，频率30Hz，时间30分钟，颗粒冲剂产品按重量份的组分含量为：大豆发酵粉30份、多聚果糖20份、桑葚发酵粉20份、β-环糊精10份、麦芽糊精10份、菊粉8份、维生素C 2份；清液加入100目HPM-05型活性炭15g脱色脱味，温度45℃，时间1h，板框填充白色和红色硅藻土分别各加入15克，填充均匀，过滤澄清后，利用纳滤膜DK200，规格为SUEZ卷式有机膜，分子量为200Da，控制膜前压力为0.25MPa，膜后压力为0.25MPa，初始浓度4％Brix，脱盐浓缩至10％Brix，再添加5kg纯水，平均分2次补水脱盐，控制终点物料10％Brix，电导率终点为6.5ms/cm，送料至全自动UHT杀菌设备，杀菌参数为：110℃，3min；灭菌后的物料输送至喷雾干燥塔，干燥参数为：螺杆泵5Hz，进风温度185℃，出风温度95℃，得到水分为4.8％大豆低聚肽末；咀嚼片产品按重量份的组分含量为：大豆低聚肽30份、山梨糖醇20份、低聚异麦芽糖15份、珠肽粉15份、燕麦10份、硬脂酸镁5份、适量添加Na-CMC 5份。
对比例2
一种酶法联合微生物发酵制备大豆低聚肽的方法，以大豆分离蛋白粉为主要原料，剪切罐加入纯化水9kg，大豆分离蛋白1kg，常温下快速剪切30min，剪切速度800r/min；大豆蛋白匀浆液中滴加20％氢氧化钠溶液调节体系pH＝8.5,采用碱性蛋白酶Alcalase2.4L和中性蛋白酶梯度酶解，碱性蛋白酶Alcalase 2.4L 16g，果胶酶3.2克，通过控制体系pH维持在8.0-8.5，酶解温度55℃，酶解3小时，自然pH再加入中性蛋白酶5g，果胶酶1g，酶解1小时，90℃高温灭酶30分钟。采用板式换热快速降温35℃；利用碟式离心机分离3000r/min，分离出酶解清液和固体渣，分离效果差；清液加入100目HPM-05型活性炭15g脱色脱味，温度45℃，时间1h，板框填充白色和红色硅藻土分别各加入15克，填充均匀，过滤澄清后，利用纳滤膜DK200，规格为SUEZ卷式有机膜，分子量为200Da，控制膜前压力为0.25MPa，膜后压力为0.25MPa，初始浓度4％Brix，脱盐浓缩至10％Brix，再添加5kg纯水，平均分2次补水脱盐，控制终点物料10％Brix，电导率终点为6.5ms/cm，送料至全自动UHT杀菌设备，杀菌参数为：110℃，3min；灭菌后的物料输送至喷雾干燥塔，干燥参数为：螺杆泵5Hz，进风温度185℃，出风温度95℃，得到水分为4.8％大豆低聚肽末；咀嚼片产品按重量份的组分含量为：大豆低聚肽30份、山梨糖醇20份、低聚异麦芽糖15份、珠肽粉15份、燕麦10份、硬脂酸镁5份、适量添加Na-CMC 5份。
表1本公开实施例1-5及对比例1-2大豆低聚肽得率
| 项目 | 得率/％ |
| 实施例1 | 80 |
| 实施例2 | 72 |
| 实施例3 | 68 |
| 实施例4 | 45 |
| 实施例5 | 65 |
| 对比例1 | 35 |
| 对比例2 | 40 |
本实施例1-5及对比例1-2大豆低聚肽的得率如图2所示及表1所示，实施例1-3添加东方醋酸菌、活性干酵母、枯草芽孢杆菌、植物乳酸菌混合菌发酵，大豆低聚肽得率在68％-80％之间，而实施例4仅添加活性干酵母、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌发酵，大豆低聚肽得率45％，实施例5添加东方醋酸菌、活性干酵母发酵，大豆低聚肽得率为65％，说明东方醋酸菌对大豆低聚肽得率的提高具有明显的作用，对比例1直接采用微生物发酵发现发酵周期长，大豆低聚肽得率为35％，可能是大分子蛋白对微生物的利用率低，对案例2直接采用生物蛋白酶降解，得率40％，高于对比例6，低于实施案例4，说明大豆低聚肽需要蛋白酶和微生物联合发酵，可以明显提高产品的得率。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例/方式”、“一些实施例/方式”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例/方式或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例/方式或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例/方式或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例/方式或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例/方式或示例以及不同实施例/方式或示例的特征进行结合和组合。
本领域的技术人员应当理解，上述实施方式仅仅是为了清楚地说明本公开，而并非是对本公开的范围进行限定。对于所属领域的技术人员而言，在上述公开的基础上还可以做出其它变化或变型，并且这些变化或变型仍处于本公开的范围内。
Claims (6)
1.一种酶法联合微生物发酵制备大豆低聚肽的方法，其特征在于，包括：
步骤一、大豆分离蛋白预处理：以大豆分离蛋白粉为原料，大豆分离蛋白按质量体积比1：8～1：10加入纯化水，常温下剪切30～60min，剪切速度600～1000r/min；得到蛋白匀浆液；
步骤二、复合酶酶解：在所述蛋白匀浆液中滴加碱液调节体系pH至8.0～8.5,采用复合酶A和复合酶B梯度酶解：先添加复合酶A，通过控制体系pH维持在8.0～8.5，酶解温度50～60℃，酶解2～3小时；再加入复合酶B，酶解1～2小时，高温灭菌，再降温至30～38℃；得到复合酶酶解液；
步骤三、微生物发酵：控制发酵温度30～38℃；在复合酶酶解液中加入碳源以及无机盐氯化铵缓冲体系，再加入活性干酵母发酵发酵，活性干酵母添加质量按发酵液体积的0.05％～0.4％，发酵3～5h，控制酒精度1～3％Vol；再加入东方醋酸菌发酵，东方醋酸菌添加质量按发酵液体积的0.1％～1.0％，发酵1～3h，控制产乙酸5～20g/L；再加入枯草芽孢杆菌及植物乳酸菌发酵，枯草芽孢杆菌和植物乳酸菌添加质量按发酵液体积的0.1％～0.8％，发酵4～8h；东方醋酸菌产酸富集，待发酵体系的pH＝4.4～4.8，终止发酵；
步骤四、分离纯化：发酵结束后灭菌，通过东方醋酸菌代谢产酸的富集让分散型的蛋白变性沉淀，离心机分离2000～4000r/min，得到发酵清液和固体渣，所述固体渣通过高温灭菌，冻干后，得到大豆发酵粉；所述发酵清液通过活性炭脱色脱味、板框过滤、纳滤脱盐浓缩、UHT杀菌、喷雾干燥工序，得到大豆低聚肽。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤二中，所述复合酶A添加量为大豆分离蛋白粉质量的0.8％～2.0％，所述复合酶B添加量为大豆分离蛋白粉质量的0.3％～1.0％。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤二中，所述复合酶A或所述复合酶B为碱性蛋白酶Alcalase 2.4L、胰酶、胶原酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶中的任意一种酶与果胶酶的复合酶，复配比例为5：1。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤三中，枯草芽孢杆菌和植物乳酸菌的质量组分比为2：1。
5.一种组合物，其特征在于，包括以下重量份数的组分：如任一权利要求1-4所述的大豆发酵粉25～35份、多聚果糖15～25份、桑葚发酵粉15～25份、β-环糊精10～15份、麦芽糊精10～15份、菊粉5～10份、维生素C1.5～2份。
6.一种组合物，其特征在于，包括以下重量份数的组分：如任一权利要求1-4所述的大豆低聚肽25～35份、山梨糖醇15～20份、低聚异麦芽糖15～20份、珠肽粉10～15份、燕麦10～15份、硬脂酸镁1～5份、Na-CMC1～5份。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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