CN104531817B

CN104531817B - 一种透明质酸、硫酸软骨素、胶原蛋白肽、骨粉饲料和肥皂联产的方法

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Publication number: CN104531817B
Application number: CN201510007701.2A
Authority: CN
Inventors: 吴凌天; 陈乔煜; 黎宇航; 吴珊珊; 吴敬源; 吴林元
Original assignee: Changshu Institute of Technology
Current assignee: Changshu Institute of Technology
Priority date: 2015-01-07
Filing date: 2015-01-07
Publication date: 2017-12-01
Anticipated expiration: 2035-01-07
Also published as: CN104531817A

Abstract

本发明公开了一种透明质酸、硫酸软骨素、胶原蛋白肽、骨粉饲料和肥皂联产的方法，该方法的主要工艺步骤如下：将动物软骨用水浸泡并粉碎得软骨粉，软骨粉用蛋白酶酶解，然后用树脂吸附，收集被吸附后的酶解液，用NaCl水溶液对树脂进行梯度洗脱，各洗脱液经脱盐、浓缩、灭菌、干燥分别得透明质酸和硫酸软骨素成品。吸附后的酶解液经脱色、阴、阳离子交换树脂混合柱处理、纳滤除杂、浓缩、灭菌、干燥，制得胶原蛋白肽成品。油脂经提炼皂化后制成肥皂；变性蛋白‑骨渣复合物与其他物料混合制成饲料。本发明利用树脂吸附‑喷雾干燥的工艺，实现了软骨高资源化利用，同时节能减排，经济效益和社会效益显著。

Description

一种透明质酸、硫酸软骨素、胶原蛋白肽、骨粉饲料和肥皂联产的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种透明质酸、硫酸软骨素、胶原蛋白肽、骨粉饲料和肥皂联产的方法。

背景技术

我国是农业大国，畜牧业较为发达，软骨资源十分丰富。动物软骨中富含的硫酸软骨素、胶原蛋白以及透明质酸等活性成分已被广泛应用于医药、食品和化妆品等领域。

透明质酸(Hyaluronic Acid,HA)和硫酸软骨素(Chondroitin Sulfate,CS)都属糖胺聚糖(Glyeosaminoglyean,GAG)，硫酸软骨素是D-葡萄糖醛酸和N-乙酰半乳糖胺的共聚物的硫酸酯盐，共聚物内六碳糖通过β-(1,4)和β-(1,3)糖苷键交替连接，一般约含50～70个双糖单位，分子量在10kDa-50kDa之间。透明质酸是一种由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-葡萄糖胺通过β-(1,3)糖苷键连接而成的双糖重复结构单位组成的线性多糖；每个双糖单位通过件β-(1,4)糖苷键与另一个双糖单位连接起来；其双糖单位可达25000个之多，分子量在2万～5万kDa之间。

硫酸软骨素主要存在于人和牛、羊、猪的鼻骨、喉管、气管等软骨中，同时也存在于鱼类的鳍、头骨以及脊椎等组织中。透明质酸主要存在动物眼睛、鸡冠和脐带中，少量存在动物软骨中。硫酸软骨素和透明质酸是医药、保健品和化妆品等领域重要的生物化工原料。作为医疗药物，它们具有降血脂、抗血栓、抗肿瘤、治疗关节炎、动脉硬化、心脑血管疾病、听觉障碍、肾炎、肝炎以及神经痛等作用，还可用作滴眼剂；作为食品添加剂，硫酸软骨素可用于食品的乳化、保湿和祛除异味；在化妆品中添加硫酸软骨素和透明质酸可调节皮肤的细胞代谢，促进营养的吸收，保持皮肤的水分和改善发质。

胶原(Collagen)蛋白是一种在动物体内含量最为丰富的功能性蛋白质，占总蛋白质量的25％～33％，主要分布在动物的肌腱、肌鞘、韧带、皮肤、软骨、牙齿、和骨骼中，是结缔组织极为重要的结构蛋白，起着保护机体、支撑器官的功能。胶原蛋白已被广泛应用于食品、医药、化妆品、保健品、生物合成等众多领域。在生物医疗行业，胶原蛋白可制成药物载体、烧伤敷料、止血绵、心脏辨膜等；在功能性食品与保健品行业，可以用作食品包装材料、改善肉类的品质、饮料澄清剂、面膜的有效活性成分。还可以用作生物发酵的培养基。胶原蛋白肽(Collagen Peptide,CP)易于人体吸收，具有保护胃粘膜，防止胃溃疡，促进钙吸收，防治骨质疏松，促进皮肤胶原代谢，抑制血压上升，以及降低血清中胆固醇含量等多方面的生理功能，是食品和医药领域重要的添加剂，市场需求量不断增加，应用前景广阔。

目前工业生产硫酸软骨素的方法通常包括碱法、酶法、中性盐法以及碱盐法等，但这些方法分离提取的硫酸软骨素含量一般不高于90％。精制硫酸软骨素的方法也有很多，如季胺盐络合法、乙醇分级沉淀法、超滤膜法、离子交换层析法以及区带电泳分离法等，但在大规模的工业化生产中，单一使用这些方法具有能耗大、成本高等缺点。

近年来，如何提高动物软骨资源的利用率和降低环境污染是制备硫酸软骨素的热点话题。通过查阅专利与文献，目前利用动物软骨为原料制备硫酸软骨素的方法存在以下问题：生产周期长、产品含量低、胶原蛋白肽产品联产相关问题、骨渣及变性蛋白的处理问题、乙醇沉淀法的安全隐患问题、乙醇与双氧水残留问题以及环境污染等。

据报道，我国硫酸软骨素产量占世界总产量的80％以上，大量硫酸软骨素出口到欧美许多国家，在国际市场急需的十大类中成药原料中位居第三。研究与环境有好的硫酸软骨素生产工艺将具有更重要的经济、社会和环境意义。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是，提供一种透明质酸、硫酸软骨素、胶原蛋白肽、骨粉饲料和肥皂联产的方法，该法联产了透明质酸、硫酸软骨素、胶原蛋白肽、骨粉饲料和肥皂，摒弃了传统的乙醇沉淀硫酸软骨素的方法，利用树脂吸附-喷雾干燥法制备硫酸软骨素，解决了生产过程中乙醇存在的安全隐患问题；利用复合酶分步酶解技术，将硫酸软骨素与蛋白质完全分离，不仅提高了产品含量，而且省去了过氧化氢氧化步骤。本法不仅降低了生产成本和生产周期，而且对节能减排和环境保护起到了积极的作用。

为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种透明质酸、硫酸软骨素、胶原蛋白肽、骨粉饲料和肥皂联产的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(1)软骨预处理：将动物软骨在蒸馏水中浸泡3～4h，再将动物软骨粉碎处理，放入反应釜中，加入蒸馏水，控制温度为75～80℃，加热1～2小时，然后分别收集上层骨油和下层软骨液；

(2)肥皂制备：

(2a)皂化：向步骤(1)得到的骨油中加入400g/L的NaOH水溶液，使骨油中NaOH和骨油的质量比为1:2.5～3，95℃条件下加热4～6h，加热过程中不断搅拌，得到混合体系A；

骨油皂化程度的判定方法如下：当皂化液滴加到水中时，其在水面上不再形成油滴视为皂化完全。

(2b)除杂：向步骤(2a)得到的混合体系A中，按照硅藻土与混合体系A的比例为10～20g：1L加入硅藻土，在70℃条件下搅拌30～45分钟，然后过滤，收集滤液；

(2c)盐析：向步骤(2b)得到的滤液中加入香精；再向滤液中加入NaCl，使NaCl的浓度在滤液中饱和，搅拌均匀，滤出皂基，将滤液打入储罐A中；

(2d)成形：将步骤(2c)得到的皂基冷凝成皂板，然后切成皂坯，经干燥得到洗衣皂或香皂；

(3)酶解：用NaOH调节步骤(1)得到的软骨液的pH为7.5～9.0；向其中加入复合酶A，使复合酶A的总酶活与软骨质量的比例为1×10⁶～1.4×10⁶U：1kg，酶解1～4h，优选2h；再用12mol/L的盐酸调节pH为6.5～7.5，向其中加入复合酶B，使复合酶B的总酶活与软骨质量的比例为4×10⁵～6×10⁵U：1kg，酶解2～5h，优选酶解4h；最后灭酶，得到混合体系B；

软骨液酶解程度的判定方法如下：将0.3mol/L三氯乙酸滴加到酶解液中观察酶解液的混浊程度，酶解液不混浊或显微混浊，则证明酶解完全；

(4)过滤：过滤步骤(3)得到的混合体系B，分别收集滤液和滤渣，将滤渣烘干、粉碎得到骨渣-变性蛋白复合物粉末；

(5)吸附：将步骤(4)得到的滤液加入糖胺聚糖专用吸附树脂柱内，经吸附处理后，得到吸附了糖胺聚糖的树脂柱，收集流出液；

吸附完成的确定方法：将吸附液滴加到70％的乙醇中，或将CPC滴加到吸附液中，若无硫酸软骨素析出或溶液没有变浑浊，即吸附完成。

(6)透明质酸和硫酸软骨素制备：

(6a)洗脱：

第一次洗脱：用15g/L的NaCl水溶液以3～5BV/h的流速对步骤(5)得到的吸附了糖胺聚糖的树脂柱进行第一次洗脱处理，得到洗脱液A，将洗脱液A与步骤(5)得到的流出液混合，洗脱液A中含有胶原蛋白肽；

第二次洗脱：用35～40g/L的NaCl水溶液以3～5BV/h的流速再对吸附了糖胺聚糖的树脂柱进行第二次洗脱处理，得到洗脱液B，洗脱液B中含有透明质酸；

第三次洗脱：用120～140g/L的NaCl水溶液以3～5BV/h的流速对吸附了糖胺聚糖的树脂柱进行第三次洗脱处理，得到洗脱液C，洗脱液C中含有硫酸软骨素；

(6b)脱盐：将步骤(6a)得到的洗脱液B用5000Da的透析袋透析脱盐，得到截留液Ⅰ；将步骤(6a)得到的洗脱液C用1000～8000Da的超滤膜超滤脱盐，得到截留液Ⅱ；将透析液和超滤截留液打入储罐A中；

透析终止的确定方法：透析液的电导率小于400μs/cm时，透析完成；

超滤终止的确定方法：滤出液的电导率小于500μs/cm时，超滤完成；

(6c)浓缩：将步骤(6b)得到的截留液Ⅰ和截留液Ⅱ分别通过三效浓缩器浓缩，浓缩到物料浓度在300～350g/L时，停止浓缩，得到浓缩液Ⅰ和浓缩液Ⅱ；

(6d)灭菌：对步骤(6c)得到的浓缩液Ⅰ和浓缩液Ⅱ分别进行灭菌处理，得到无菌浓缩液Ⅰ和无菌浓缩液Ⅱ；

(6e)干燥：将步骤(6d)得到的无菌浓缩液Ⅰ和无菌浓缩液Ⅱ分别加入喷雾干燥器内，进风温度185℃，出风温度90℃，进行干燥，分别得到透明质酸和硫酸软骨素成品；

(7)胶原蛋白肽制备：

(7a)脱色：将步骤(5)得到的流出液加入反应釜中，按照活性炭与流出液的比例为10～20g：1L加入活性炭，用12mol/L的盐酸调节pH为4.0～6.0，优选pH为4.0～5.0；温度为40～70℃，优选温度为60℃；处理1～3小时，优选处理1h；再次过滤，收集滤液；

(7b)除腥脱臭：将步骤(7a)得到的滤液加入阴、阳离子交换树脂混合柱中，以5～8BV/h的流速，回流处理0.5～1h，收集流出液；

(7c)除杂：将(7b)得到的流出液用300-500Da的纳滤膜处理，得到截留液；将纳滤流出液打入储罐A中；

纳滤终止的确定方法：滤出液的电导率小于200μs/cm时，纳滤完成；

(7d)浓缩：将步骤(7c)得到的截留液通过三效浓缩器浓缩，浓缩到物料浓度为350～450g/L时，停止浓缩，得到浓缩液；

(7e)灭菌：对步骤(7d)得到的浓缩液进行灭菌处理，得到无菌浓缩液；

(7f)干燥：将步骤(7e)得到的无菌浓缩液加入喷雾干燥器内，进风温度185℃，出风温度85℃，干燥得到胶原蛋白肽成品；

(8)骨粉饲料制备：将步骤(4)得到的骨渣-变性蛋白复合物粉末按如下方法制备得到骨粉饲料：

骨粉-变性蛋白复合物60重量份、米糠10重量份、豆饼10重量份、麸皮10重量份、油菜籽渣10重量份；将以上复合物混合搅拌均匀，用饲料造粒机造粒即得所需骨粉饲料。

(9)废水处理：向储罐A中加入絮凝剂，搅拌10分钟，过滤，滤液用反渗透膜制备纯水，截留液经硅藻土过滤器过滤之后用蒸发结晶器结晶得到NaCl晶体，所述的絮凝剂为聚合氯化铝，使用量5×10^-3g/L。。

其中，步骤(1)中，所述的动物软骨为鲨鱼软骨、牛软骨、猪软骨中的一种或几种的混合物，反应釜中，水与软骨的质量比为1～5：1，优选3～4：1。

其中，步骤(2c)中，所述的香精为无花果天然香精、柠檬天然香精或茉莉花天然香精中的一种或几种的混合物，香精的加入量为2g/L。

其中，将步骤(2c)得到的皂基加热溶解，再加入NaCl至饱和，并搅拌均匀，滤出皂基，重复该步骤三次。

其中，步骤(3)中，所述的复合酶A是木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和碱性蛋白酶中的任意两种蛋白酶按照酶活比为1:1混合的混合酶；所述的复合酶B是中性蛋白酶、风味蛋白酶、胶原蛋白酶和菠萝蛋白酶中任意两种蛋白酶按照酶活比为1:1混合的混合酶；优选复合酶A是木瓜蛋白酶和胰蛋白酶，复合酶B是中性蛋白酶和菠萝蛋白酶。

其中，步骤(3)中，复合酶A酶解温度为55～60℃，酶解过程中控制pH为7.5～9.0；复合酶B酶解温度为50～60℃，酶解过程中控制pH为6.5～7.5；灭酶的方法为：用12mol/L盐酸调节酶解后软骨液体系的pH为5.0～6.5，升温至75～80℃，保持10～60分钟。

其中，步骤(5)中，所述的吸附处理，其吸附条件为：温度为50～70℃，优选温度60℃，pH为4.0～6.0，优选pH为5.0，以3～5BV/h的流速回流吸附4～6小时，优选5h；所述的树脂为BE-D82型糖胺聚糖专用吸附树脂。

其中，步骤(6c)和(7d)中，所述的三效浓缩器浓缩，其浓缩条件为：一效温度85～90℃，二效温度80～85℃，三效温度65～70℃，真空度为0.03～0.05Mpa。

其中，步骤(6d)和(7e)中，所述灭菌处理，是利用0.01～0.22μm除菌膜过滤除菌，或利用高温灭菌器135℃保持4～15秒的瞬间灭菌。

其中，步骤(7b)中，所述的阴、阳离子交换树脂混合柱，其中阴离子树脂和阳离子树脂按照重量比为1.5～2:1混合；所述的阴离子树脂为强碱性阴离子交换树脂201×7，阳离子树脂为强酸性阳离子交换树脂001×7。

各种蛋白酶的酶切位点如表1所示，从表1中可以看出，本发明中使用的六种蛋白酶的酶切位点均不相同，选用这六种蛋白酶可以将与硫酸软骨素共价连接的蛋白质充分酶解。

表1 蛋白酶及其特性

有益效果:

1、本发明通过采用两种复合酶对软骨液实施分段酶解的技术，实现透明质酸、硫酸软骨素和胶原蛋白的同步水解；并结合树脂吸附、超滤、透析和喷雾干燥等先进的工业化技术，连续分离获得透明质酸、硫酸软骨素和胶原蛋白肽以及制备了骨粉饲料和肥皂，显著增加了利润空间，经济效益显著，而且极大地减少污水排放量，以及一定程度上降低了环境污染问题。

2、本发明将离子交换法应用于透明质酸、硫酸软骨素以及胶原蛋白肽的分离，进一步提高了硫酸软骨素的纯度。温和的分离条件避免了硫酸软骨素糖链结构的破坏，保证了其原有的药理作用。此外，离子交换树脂可以反复使用，而且选择性好、操作方便、节省分离与纯化的成本。

3、本发明将喷雾干燥法替代了传统乙醇沉淀硫酸软骨素的方法，解决了硫酸软骨素生产过程中乙醇存在的安全性问题，且从根源上解决了硫酸软骨素成品中乙醇残留的问题；而且喷雾干燥操作方便，干燥后的产品不需粉碎和筛选，减少了生产工序，降低了生产周期与生产成本。

4、硫酸软骨素与蛋白质是共价连接在一起的，若软骨液酶解不彻底将直接影响硫酸软骨素成品中硫酸软骨素的含量。现有技术中常常利用过氧化氢在碱性条件下破坏蛋白质与硫酸软骨素之间的共价键，以提高硫酸软骨素的含量，但是硫酸软骨素经过氧化氢氧化后，硫酸软骨素成品经储存一定的时间，会发生回色现象，严重影响了硫酸软骨素的使用和销售。本发明通过多种不同的蛋白酶共同作用，能将与硫酸软骨素共价连接的蛋白质充分“切除”，从而省去了过氧化氢氧化的步骤，从根源上解决了硫酸软骨素成品中过氧化氢残留的问题，也解决了产品回色问题，确保了硫酸软骨素的绿色化生产。

5、本发明利用除菌膜或高温瞬时灭菌器对软骨素和胶原蛋白肽浓缩液进行灭菌处理，使其微生物指标达到检测标准，避免了传统辐照灭菌引起的产品物理性状的改变。

6、本发明将制备肥皂、透明质酸、硫酸软骨素以及胶原蛋白肽的废水经过絮凝、过滤、反渗透处理以及结晶处理，得到了纯水和NaCl晶体，使得水和NaCl在生产中可以重复循环利用，这不仅节约了资源也降低了生产成本，更重要的是把生产废水降为“零排放”，符合国家可持续发展战略。

7、本发明从动物软骨中连续分离了透明质酸、硫酸软骨素和胶原蛋白肽以及制备了骨粉饲料和肥皂，大大提高了利润空间。根据不同的动物软骨来源，透明质酸得率在0.8～1.3％(得到的透明质酸质量与总物料的质量比)，硫酸软骨素得率在5～40％(得到的硫酸软骨素质量与总物料的质量比)，可以进行规模生产，技术可靠、产品质量稳定，实现了动物软骨资源的高效利用。生产出的透明质酸成品中透明质酸的含量在92％以上，硫酸软骨素成品中硫酸软骨素的含量高达98％，可以作为针剂使用；胶原蛋白肽成品中蛋白含量也在95％以上，达到了化妆品级的要求。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

以下实施例中所用的BE-D82糖胺聚糖专用树脂购自沧州宝恩吸附材料科技有限公司。

实施例1：

将1000kg鲨鱼软骨(包括翅骨、脊椎骨和头骨)粉碎，加入4000kg蒸馏水，升温到75℃，保持1h，降温至55℃，用400g/L的NaOH溶液调整pH至8.0，然后加入1×10⁹U复合蛋白酶A，55℃酶解2h；调整pH至7.0，再加入4.0×10⁸U复合蛋白酶B，52℃酶解4h；用盐酸调节pH至6.5，升温至80℃，保持0.5h灭酶。酶解结束后趁热利用板框叶滤机将酶解液过滤，分别得到滤液和骨渣-变性蛋白复合物。骨渣-变性蛋白复合物经真空干燥和粉碎，得到骨渣-变性蛋白复合物粉末348kg。将滤液用盐酸调节pH至5.0后，打入糖胺聚糖专用吸附树脂柱内，保持温度60℃，5BV/h的流速回流吸附4小时；期间结合乙醇沉淀法和CPC法检测硫酸软骨素是否吸附完全；将吸附完成后的流出液打入脱色罐内。

用15g/L的NaCl水溶液以3BV/h的流速对吸附了糖胺聚糖的树脂柱进行第一次洗脱处理，得到的洗脱液打入脱色罐中。用35g/L的NaCl水溶液以3BV/h的流速再对吸附了糖胺聚糖的树脂柱进行第二次洗脱处理，得到的洗脱液中含有透明质酸；用120g/L的NaCl水溶液以3BV/h的流速对吸附了糖胺聚糖的树脂柱进行第三次洗脱处理，得到的洗脱液中含有硫酸软骨素。用5000Da的透析袋对含有透明质酸的洗脱液进行透析脱盐，浓缩，再进行135℃保持6秒的瞬间灭菌，喷雾干燥得透明质酸成品12.6kg，产品收率为1.26％。用8000Da的超滤膜对含有硫酸软骨素的洗脱液进行超滤脱盐除杂，再用135℃保持6秒的瞬间灭菌，喷雾干燥得硫酸软骨素成品206kg，产品中收率为20.6％。将以上透析液和超滤流出液打入储罐A中。

向脱色罐内加入35kg活性炭，pH控制为5.5，温度60℃，脱色1h后进行过滤；滤液用阴阳离子交换树脂(阴离子树脂和阳离子树脂按照重量比为1.5：1混合，其中，阴离子树脂为强碱性阴离子交换树脂201×7，阳离子树脂为强酸性阳离子交换树脂001×7)进行脱腥和脱臭，再用300Da的纳滤膜纳滤脱盐除杂；上述液体经三效浓缩后，135℃保持6秒的瞬间灭菌，喷雾干燥得胶原蛋白肽成品268kg，产品收率26.8％。

将所得骨渣-变性蛋白复合物按以下物质按质量份数比配置：骨粉-变性蛋白复合物60份、米糠10份、豆饼10份、麸皮10份、油菜籽渣10份。将以上复合物混合搅拌均匀，用饲料造粒机造粒得568kg骨粉饲料。

在储罐A中加入0.1kg絮凝剂，搅拌10分钟，用硅藻土过滤过滤，过滤用反渗透膜制备纯水，得到纯水15吨，截留液用蒸发结晶器结晶得到NaCl晶体240kg。

本实施例中硫酸软骨素、透明质酸、胶原蛋白肽的检测结果如表2、表3、表4所示，从表2、表3、表4中可以看出，本方法制备的硫酸软骨素、透明质酸、胶原蛋白肽的各项指标均符合国家标准适合工业化生产。

注：由于鲨鱼软骨中脂肪含量甚微，一般不做除油处理，所以此实施例没有肥皂制备过程。

实施例2：

将1000kg牛、猪软骨(包括鼻骨、喉管和气管)浸泡水中使其软化，再进行粉碎，加入5000kg蒸馏水，升温到80℃，保持2h，除去上层骨油，降温至55℃，用NaOH调整pH至8.5，然后加入1.4×10⁹U复合蛋白酶A，55℃酶解2h；调整pH至7.0，再加入6.0×10⁸U复合蛋白酶B，50℃酶解5h；用盐酸调节pH至6.5，升温至80℃，保持0.5h灭酶。酶解结束后趁热利用板框叶滤机将酶解液过滤，分别得到滤液和骨渣-变性蛋白复合物。骨渣-变性蛋白复合物经真空干燥和粉碎，得到骨渣-变性蛋白复合物粉末121kg。将滤液用盐酸调节pH至5.0后，打入糖胺聚糖专用吸附树脂柱内，保持温度60℃，以5BV/h的流速回流吸附4小时；期间结合乙醇沉淀法和CPC法检测硫酸软骨素是否吸附完全；将吸附完成后的流出液打入脱色罐内。

用蒸馏水冲洗吸附了糖胺聚糖的树脂柱2次后，用15g/L的NaCl水溶液以3BV/h的流速对吸附了糖胺聚糖的树脂柱进行第一次洗脱处理，得到的洗脱液中含有胶原蛋白肽，将其与上一步骤中得到的吸附流出液混合，然后一起制备胶原蛋白肽。用35g/L的NaCl水溶液以3BV/h的流速再对吸附了糖胺聚糖的树脂柱进行第二次洗脱处理，得到的洗脱液中含有透明质酸；用120g/L的NaCl水溶液以3BV/h的流速对吸附了糖胺聚糖的树脂柱进行第三次洗脱处理，得到的洗脱液中含有硫酸软骨素。用5000Da的透析袋对含有透明质酸的洗脱液透析脱盐，脱盐后的透明质酸液体浓缩后经135℃保持6秒的瞬间灭菌处理后，喷雾干燥得透明质酸成品8.3kg，产品收率为8.3‰。用8000Da的超滤膜对硫酸软骨素超滤脱盐除杂，再用0.22μm的除菌膜过滤除菌，喷雾干燥得硫酸软骨素成品262kg，产品中硫酸软骨素收率26.2％。

向脱色罐内加入40kg活性炭，pH控制在5.5，温度60℃，脱色1h后进行过滤；滤液用阴阳离子交换树脂(阴离子树脂和阳离子树脂按照重量比为2：1混合，其中，阴离子树脂为强碱性阴离子交换树脂201×7，阳离子树脂为强酸性阳离子交换树脂001×7)进行脱腥和脱臭，再用300Da的纳滤膜纳滤脱盐除杂；上述液体经三效浓缩，135℃保持6秒的瞬间灭菌处理后，喷雾干燥得胶原蛋白肽成品268kg，产品收率26.8％。

将所得骨渣-变性蛋白复合物按以下物质按质量份数比配置：骨粉-变性蛋白复合物60份、米糠10份、豆饼10份、麸皮10份、油菜籽渣10份。将以上复合物混合搅拌均匀，用饲料造粒机造粒得190kg骨粉饲料。

将所得骨油加入适量40％的NaOH溶液，加热，搅拌至液体变稠，再加入1％(m/v)硅藻土搅拌30分钟，过滤，在滤液中加入适量香精和NaCl充分搅拌，滤出皂基，将皂基冷凝成大块皂板，然后切成皂坯，经干燥制成洗衣皂、香皂等产品30kg。

在储罐A中加入0.12kg絮凝剂，搅拌10分钟，用硅藻土过滤过滤，过滤用反渗透膜制备纯水，得到纯水18吨，截留液用蒸发结晶器结晶得到NaCl晶体370kg。

表2 硫酸软骨素检测报告表

表3 透明质酸检测报告表

表4 胶原蛋白肽检测报告表

实施例3：

其他操作步骤均与实施例2相同，所不同的是，将所用的原料换成表5所示的各种成分，分别计算硫酸软骨素和胶原蛋白肽的理论得率和实际得率，从表中可以看出，本发明制备的硫酸软骨素和胶原蛋白肽得率与理论得率较接近，得率高。

表5 不同原料硫酸软骨素和胶原蛋白肽的理论得率和实际得率

注：以上硫酸软骨素实际得率是指除去透明质酸后的得率。

实施例4：

其他操作步骤均与实施例2相同，所不同的是，对得到的硫酸软骨素洗脱液进行下面两种不同的处理：(1)得到的硫酸软骨素洗脱液先利用过氧化氢氧化，再脱盐、浓缩；(2)省略过氧化氢氧化的步骤，将得到的硫酸软骨素洗脱液直接脱盐、浓缩。得到的硫酸软骨素成品中各成分的检测结果见表6，从表6中可以看出，硫酸软骨素的含量基本在98％左右；蛋白限量也近似相同，都达到了行业标准。因此，省去过氧化氢氧化的步骤是可行的。

表6 利用过氧化氢氧化和不利用过氧化氢氧化的硫酸软骨素检测结果

实施例5：

其他操作步骤均与实施例2相同，所不同的是，利用的原料为猪鼻骨，将复合酶A和复合酶B按照表7所示的不同蛋白酶组合方法设置实验，复合酶A先酶解1h后再放入复合酶B继续酶解5h，共6h。从表中可以看出，硫酸软骨素得率最高的蛋白酶组合为：复合酶A：木瓜蛋白酶和胰蛋白酶；复合酶B：中性蛋白酶和菠萝蛋白酶。

表7 不同蛋白酶组合对硫酸软骨素得率及胶原蛋白肽分子量的研究

注：①以上硫酸软骨素得率是指除去透明质酸后的得率；②胶原蛋白肽分子量是指主要分布在某个范围内的分子量。

实施例6：

其他操作步骤均与实施例2相同，所不同的是，复合酶A(木瓜蛋白酶和胰蛋白酶)；复合酶B(中性蛋白酶和菠萝蛋白酶)的处理时间按照表8设置。从表8中可以看出，复合酶A处理2h，复合酶B处理4h时硫酸软骨素的得率最高。

表8 酶解时间对硫酸软骨素得率和胶原蛋白肽分子量影响的研究

实施例7：

其他操作均与实施例2相同，所不同的是利用BE-D82型糖胺聚糖专用吸附树脂吸附硫酸软骨素和透明质酸时的pH和温度按照表9所示的数值设置，吸附时间为5h。透明质酸中含有糖醛酸、硫酸软骨素中含有糖醛酸及硫酸酯基，两者均携带大量负电荷。而大多数蛋白多肽的pI在4.0以下，所以在中、碱性条件下，酶解液中的蛋白多肽以阴离子形式存在，与透明质酸和硫酸软骨素的吸附存在竞争性，使得透明质酸和硫酸软骨素吸附量减少；但是当pH过酸时，透明质酸和硫酸软骨素所带的负电荷减少，其吸附量将大幅下降。因此选择合适的pH是吸附过程的关键因素。如表9所示：pH＝5.0、温度为60℃时为最佳吸附条件。

表9 糖胺聚糖专用吸附树脂吸附处理的pH和温度的研究

注：吸附量单位是mg糖胺聚糖/g湿树脂。

实施例8：

活性炭脱色主要是为了解决胶原蛋白肽成品的色泽问题。由于本专利中制备胶原蛋白肽时，不论用何种方法进行脱色，成品胶原蛋白肽T₆₂₀>85％是必然的，所以这里只讨论T₄₅₀的最佳脱色条件。其他操作均与实施例2相同，所不同的是在利用活性炭脱色时，使用表10所示的pH和温度。从T₄₅₀的检测结果可以看出，当温度为60℃，pH＝4.0～5.0时，脱色效果最好。虽然本专利中使用树脂吸附法分离透明质酸、硫酸软骨素和胶原蛋白，但终究有一些透明质酸和硫酸软骨素残留在蛋白质液体中，而透明质酸和硫酸软骨素中存在羰基，可与氨基化合物(氨基酸和蛋白质)发生美拉德反应，可生成棕色甚至是黑色的大分子物质。这将在很大程度上影响产品的最终色泽以及口感。所以在加热情况下，pH的控制对活性炭脱色起到了至关重要的作用。

表10 活性炭对胶原蛋白肽脱色的最佳温度与pH的研究

实施例9：

胶原蛋肽料液在阴、阳离子交换树脂混合柱内脱臭除腥的同时也能脱盐份(灰分从原来的4.18％变为2.89％)。其他操作均与实施例2相同，所不同的是在对胶原蛋白肽进行纳滤时按照表11中的条件设置。在5公斤压力下，料液pH中性条件下进行纳滤，考察温度、电导率(滤出液体积与原料液体积相比)与胶原蛋白肽灰分的关系。高温纳滤一方面是防止纳滤时间过长，料液中微生物的大量繁殖，使料液变质；另一方面是，高温可以增加膜通量，以减少纳滤时间。灰分越低，胶原蛋白肽蛋白含量就越高，所以一般需要5～6倍料液体积进行纳滤，以提高蛋白质含量。如果对灰分没有严格的要求，一般纳滤体积为3倍料液体积即可；最佳温度为60℃。

表11 胶原蛋白肽纳滤条件的研究

注：表中电导率是指料液被浓缩之后，流出液的电导率；②原料液体积记为V。

Claims

1.一种透明质酸、硫酸软骨素、胶原蛋白肽、骨粉饲料和肥皂联产的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(2)肥皂制备：

(2a)皂化：向步骤(1)得到的骨油中加入400g/L的NaOH水溶液，使NaOH和骨油的质量比为1:2.5～3，95℃条件下加热4～6h，加热过程中不断搅拌，得到混合体系A；

(2b)除杂：向步骤(2a)得到的混合体系A中加入硅藻土，其中，硅藻土与混合体系A的比例为10～20g：1L，在70℃条件下搅拌30～45分钟，然后过滤，收集滤液；

(2c)盐析：向步骤(2b)得到的滤液中加入香精；搅拌条件下，再向滤液中加入NaCl，使NaCl在滤液中达到饱和状态，盐析结束后滤出皂基，将滤液打入储罐A中；

(3)酶解：用NaOH调节步骤(1)得到的软骨液的pH为7.5～9.0；向其中加入复合酶A，使复合酶A的总酶活与软骨质量的比例为1×10⁶～1.4×10⁶U：1kg，酶解1～4h；再用12mol/L的盐酸调节pH为6.5～7.5，向其中加入复合酶B，使复合酶B的总酶活与软骨质量的比例为4×10⁵～6×10⁵U：1kg，酶解2～5h；最后灭酶，得到混合体系B；

步骤(3)中，所述的复合酶A是木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和碱性蛋白酶中的任意两种蛋白酶按照酶活比为1:1混合的混合酶；所述的复合酶B是中性蛋白酶、风味蛋白酶、胶原蛋白酶和菠萝蛋白酶中任意两种蛋白酶按照酶活比为1:1混合的混合酶；

步骤(5)中，所述的吸附处理，其吸附条件为：温度为50～70℃，pH4.0～6.0，以3～5BV/h的流速回流吸附4～6小时；所述的糖胺聚糖专用吸附树脂为BE-D82型糖胺聚糖专用吸附树脂；

(6)透明质酸和硫酸软骨素制备：

(6a)洗脱：

第一次洗脱：用15g/L的NaCl水溶液以3～5BV/h的流速对步骤(5)得到的吸附了糖胺聚糖的树脂柱进行第一次洗脱处理，得到洗脱液A，洗脱液A中含有胶原蛋白肽，将其与步骤(5)得到的流出液混合；

(6b)脱盐：将步骤(6a)得到的洗脱液B用5000Da的透析袋透析脱盐，得到截留液Ⅰ；将步骤(6a)得到的洗脱液C用1000～8000Da的超滤膜超滤脱盐，得到截留液Ⅱ；将透析液和超滤流出液打入储罐A中；

(7)胶原蛋白肽制备：

(7a)脱色：将步骤(5)得到的流出液加入反应釜中，按照活性炭与流出液的比例为10～20g：1L加入活性炭，用12mol/L的盐酸调节pH为4.0～6.0，在40～70℃条件下处理1～3小时，然后过滤，收集滤液；

骨粉-变性蛋白复合物60重量份、米糠10重量份、豆饼10重量份、麸皮10重量份、油菜籽渣10重量份；将以上复合物混合搅拌均匀，用饲料造粒机造粒即得所需骨粉饲料；

(9)废水处理：向储罐A中加入絮凝剂，搅拌10分钟，过滤，滤液用反渗透膜制备纯水，截留液经硅藻土过滤器过滤之后用蒸发结晶器结晶得到NaCl晶体，所述的絮凝剂为聚合氯化铝，使用量为5×10^-3g/L。

2.根据权利要求1所述的透明质酸、硫酸软骨素、胶原蛋白肽、骨粉饲料和肥皂联产的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的动物软骨为鲨鱼软骨、牛软骨、猪软骨中的一种或几种的混合物，反应釜中，蒸馏水与软骨的质量比为1～5：1。

3.根据权利要求1所述的透明质酸、硫酸软骨素、胶原蛋白肽、骨粉饲料和肥皂联产的方法，其特征在于，步骤(2c)中，所述的香精为无花果天然香精、柠檬天然香精或茉莉花天然香精中的一种或几种的混合物，上述香精的加入量为2g/L。

4.根据权利要求1所述的透明质酸、硫酸软骨素、胶原蛋白肽、骨粉饲料和肥皂联产的方法，其特征在于，将步骤(2c)得到的皂基加热溶解，再加入NaCl至饱和，并搅拌均匀，滤出皂基，重复该步骤三次。

5.根据权利要求1所述的透明质酸、硫酸软骨素、胶原蛋白肽、骨粉饲料和肥皂联产的方法，其特征在于，步骤(3)中，复合酶A酶解温度为55-60℃，酶解过程中控制pH为7.5～9.0；复合酶B酶解温度为50～60℃，酶解过程中控制pH为6.5～7.5；灭酶的方法为：用12mol/L盐酸调节酶解后软骨液体系的pH为5.0～6.5，升温至75～80℃，保持10～60分钟。

6.根据权利要求1所述的透明质酸、硫酸软骨素、胶原蛋白肽、骨粉饲料和肥皂联产的方法，其特征在于，步骤(6c)和(7d)中，所述的三效浓缩器浓缩，其浓缩条件为：一效温度85～90℃，二效温度80～85℃，三效温度65～70℃，真空度为0.03～0.05Mpa。

7.根据权利要求1所述的透明质酸、硫酸软骨素、胶原蛋白肽、骨粉饲料和肥皂联产的方法，其特征在于，步骤(6d)和(7e)中，所述灭菌处理，是利用0.01～0.22μm除菌膜过滤除菌，或利用高温灭菌器135℃保持4～15秒的瞬间灭菌。

8.根据权利要求1所述的透明质酸、硫酸软骨素、胶原蛋白肽、骨粉饲料和肥皂联产的方法，其特征在于，步骤(7b)中，所述的阴、阳离子交换树脂混合柱，其中阴离子树脂和阳离子树脂按照重量比为1.5～2:1混合；所述的阴离子树脂为强碱性阴离子交换树脂201×7，阳离子树脂为强酸性阳离子交换树脂001×7。